הערכה של ההשפעות המטבולית של Isocaloric 2:1 לסירוגין צום בעכברים

Summary

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט עבור isocaloric 2:1 הצום לסירוגין להגן ולטפל נגד השמנת יתר ומטבוליזם הגלוקוז לקוי בסוג פראי ו ob/ob עכברים.

Abstract

צום לסירוגין (IF), התערבות תזונתיים מעורבים הגבלת אנרגיה תקופתית, נחשב לספק יתרונות רבים ולנטרל חריגות מטבולית. עד כה, סוגים שונים של מודלים IF עם משכים שונים של תקופות צום והאכלה תועדו. עם זאת, פענוח התוצאות הוא מאתגר, כפי שרבים מדגמים אלה כוללים תרומות רב עצרת מתוך אסטרטגיות הגבלת זמן וקלוריות. לדוגמה, מודל הצום החלופי של היום, המשמש לעתים קרובות כמשטר IF מכרסם, יכול לגרום האכלה, מציע כי היתרונות הבריאותיים מהתערבות זו צפויים לתווך דרך שתי הגבלת הקלוריות ומחזורי האכלה מחדש הצום. לאחרונה, זה כבר הראה בהצלחה כי 2:1 IF, המורכב 1 יום של צום ואחריו 2 ימים של האכלה, יכול לספק הגנה מפני השמנת יתר דיאטה ושיפורים מטבוליים ללא הפחתה של צריכת הקלוריות הכוללת. מוצג כאן הוא פרוטוקול של isocaloric 2:1 אם התערבות בעכברים. המתואר גם הוא פרוטוקול של האכלה זוגית (PF) הנדרש כדי לבדוק מודל העכבר עם התנהגויות אכילה שונה, כגון hyperphagia. באמצעות 2:1 IF משטר, זה הוכיח כי isocaloric אם מובילה לעלייה במשקל הגוף מופחת, שיפור הומאוסטזיס גלוקוז, והוצאות אנרגיה מוגבר. לפיכך, משטר זה עשוי להיות שימושי כדי לחקור את ההשפעות הבריאותיות של IF בתנאי מחלה שונים.

Introduction

אורח החיים המודרני קשור לזמן צריכת מזון יומיומי ארוך יותר ותקופות צום קצר יותר¹. זה תורם מגיפת ההשמנה הגלובלית הנוכחית, עם חסרונות מטבולית לראות בני אדם. צום התאמן במהלך ההיסטוריה האנושית, ואת היתרונות הבריאותיים המגוונים שלה כוללים תוחלת חיים ממושכת, נזק חמצוני מופחת, ו אופטימיזציה הומאוסטזיס אנרגיה^2,3. בין מספר דרכים לתרגל צום, מניעת אנרגיה תקופתית, כינה צום לסירוגין (IF), היא שיטה תזונתיים פופולרית הנהוגה באופן נרחב על ידי האוכלוסייה הכללית בשל משטר קל ופשוט שלה. מחקרים שנעשו לאחרונה במודלים פרה-קליניים וקליניים הוכיחו כי אם ניתן לספק יתרונות בריאותיים הדומים להגבלה ממושכת של צום וקלוריק, מציע שאם יכולה להיות אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית להשמנת יתר ומחלות מטבוליות^2,3,4,5.

אם משטרי משתנה במונחים של משך צום ותדירות. יום חלופי צום (כלומר, 1 יום האכלה/1 יום צום; 1:1 IF) כבר בשימוש הנפוץ ביותר אם משטר מכרסמים לחקור את ההשפעות הבריאותיות המועילה שלה על השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם, מחלות ניווניות, וכו '^2,3. עם זאת, כפי שמוצג במחקרים קודמים^6,7, ועוד מכונאי אישר בניתוח צריכת האנרגיה שלנו⁸, 1:1 אם תוצאות האכלה (~ 80%) בשל חוסר זמן האכלה מספיק כדי לפצות על אובדן אנרגיה. זה הופך את זה לא ברור אם היתרונות הבריאותיים שהוענקו על ידי 1:1 אם הם מתווכת על ידי הגבלת קלוריות או שינוי של דפוסי אכילה. לכן, משטר IF חדש פותחה ומוצגת כאן, הכוללת של 2 יום האכלה/1 יום צום (2:1 IF) דפוס, אשר מספק עכברים עם זמן מספיק כדי לפצות על צריכת המזון (~ 99%) ומשקל הגוף. עכברים אלה מושווים לקבוצת ad libitum (אל). משטר זה מאפשר בדיקת ההשפעות של isocaloric אם בהעדר הפחתת קלוריות בעכברים מסוג פראי.

לעומת זאת, במודל העכבר שמוצגים התנהגות האכלה, האכלה אל לא יכול להיות מצב שליטה מתאים כדי להשוות ולבחון את ההשפעות של 2:1 IF. לדוגמה, מאז ob/ob עכברים (מודל גנטי נפוץ עבור השמנת יתר) התערוכה hyperphagia בשל חוסר לפטין הוויסות התיאבון והשובע, אלה עם 2:1 IF מוצג ~ 20% צריכת הקלוריות מופחתת בהשוואה ob/ob עכברים עם האכלה אל. כך, כדי לבחון ולהשוות את ההשפעות של IF ב ob/ob עכברים, קבוצה האכלה זוג כפקד מתאים צריך להיות מועסק.

בסך הכל, פרוטוקול מקיף מסופק לבצע isocaloric 2:1 IF, כולל שימוש בבקרת האכלה זוג. זה הוכיח עוד כי isocaloric 2:1 אם מגן על עכברים מפני השמנה גבוהה תזונה שומן המושרה ו/או תפקוד מטבולית בשני פראי סוג ו ob/ob עכברים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעות הבריאותיות המומלצות של 2:1 אם בתנאים פתולוגיים שונים, כולל הפרעות נוירולוגיות, מחלות לב וכלי דם וסרטן.

Protocol

כל השיטות והפרוטוקולים כאן אושרו על ידי ועדות טיפול בעלי חיים ב טיפול בעלי חיים וטרינרי שירות (ACVS) של אוניברסיטת אוטווה והמרכז לפנוגנומיקה (TCP) ולהתאים את הסטנדרטים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. יש לציין כי כל ההליכים המתוארים כאן צריכים להתבצע תחת אישור מוסדי וממשלתי, כמו גם על ידי צוות הבקי באופן טכני. כל העכברים שוכנו בכלובים הסטנדרטיים של פרקו בחדרים עם שליטת טמפרטורה ולחות עם 12 h/12 h מחזורי אור/כהים (21-22 ° c, 30% – 60% לחות לדיור רגיל) וגישה חופשית למים. C57BL זכר/6J ו ob/ob עכברים התקבלו מהמעבדה ג'קסון.

1.2:1 משטר אם

1. עבור רזה ודיאטה המושרה מודלים עכבר השמנת יתר, להכין תזונה נורמלית (17% שומן, ND) או דיאטה שומן גבוה (45% שומן, HFD).
   הערה: 60% hfd ניתן להשתמש כדי לגרום להשמנה חמורה הנגרמת דיאטה; עם זאת, בשל הרכות של הגלולה המזון, קשה יחסית למדוד את צריכת המזון היומית באופן מדויק. מערכת מדידה רציפה אוטומטית יכולה לשפר את הרב-תכליתיות עבור סוגים מרובים של דיאטות.
2. מדידת משקל הגוף הבסיסי ואת הרכב הגוף של כל עכבר ב 7 שבועות של גיל באמצעות סולם ו אכעמרי, בהתאמה.
   הערה: עיין בסעיף 3 למדידת הרכב הגוף.
3. בהתבסס על משקל הגוף ואת תוצאות הרכב הגוף, באופן אקראי ובאותה מידה לחלק 7 שבוע בן זכר C57BL/6J עכברים לשתי קבוצות: ad libitum (אל) ולסירוגין הצום (IF) קבוצות.
4. מניחים שניים עד שלושה עכברים לכל כלוב ומבטיחים גישה חופשית למים לשתייה.
   הערה: מספר העכברים לכל כלוב יכול להשפיע על התנהגות צריכת המזון. מומלץ לשמור על מספר שווה של עכברים לכל כלוב בכל הקבוצות במהלך המחקר.
5. ספק שבוע של הסתגלות לסביבת הכלוב החדשה ולדיאטה לפני הפעלת משטר IF.
6. תקופת צום: עכברים להעביר לכלוב נקי עם מצעים טריים ב 12:00 PM. אין להוסיף מזון לקבוצת IF, תוך מתן כמות מספקת של מזון לקבוצת AL.
   הערה: עבור כל מחזור צום חשוב לשנות כלובים לקבוצות של אל ו-IF כדי להבטיח ששתי הקבוצות ייחשפו לאותה כמות של זמן טיפול.
7. לאחר 24 שעות, למדוד את המשקולות של עכברים בשתי הקבוצות ושאריות מזון בכלובים אל.
   הערה: הקפד לכלול את המשקל של פירורי מזון על הופר המזון התחתון של הכלוב, במיוחד בעת שימוש HFD, כמו עכברים לעתים קרובות להסיר כדורי קטנות או שברי מזון מן הופר ולשמור אותם ליד אתרי הקן. צריכת האנרגיה הממוצעת לכל עכבר בסוף כל 2:1 מחזור (3 ימים) היא סביב 35 קק ל, שווה ל ~ 10 g עבור דיאטה נורמלית (3.3 קלוריות/g) ו ~ 7 g עבור HFD (4.73 קק ל/g).
8. תקופת האכלה: לספק כמות שקלה של מזון בשעה 12:00 PM עבור קבוצות AL ו-IF.
9. לאחר 48 h של מתן המזון, למדוד את המשקל של שאריות מזון ועכברים.
10. חזור על שלבים 1.6 – 1.10 למשך המחקר (למשל, 16 שבועות ).

2. קבוצת הבקרה של האכלה זוגית (PF)

הערה: עבור ניסוי IF שבו התנהגות האכלה שונה נצפתה במודל העכבר (למשל, hyperphagia ב ob/ob עכברים), יש צורך להיות קבוצה האכלה זוג כפקד עבור השוואה נכונה הקלוריות עצמאית IF.

1. עבור קבוצת הבקרה של PF, סדר את לוח הזמנים של הניסוי כך שאותה כמות מזון הנצרכת על-ידי קבוצת IF מוצעת לקבוצת PF (איור 2).
2. מדוד את כמות המזון הנצרכת על-ידי קבוצת IF למשך יומיים של תקופת הזנה מחדש.
3. חלק כמות זו של מזון נצרך בקבוצה IF באופן שווה לשלוש פרופורציות ולספק אותה מדי יום לקבוצת PF בשעה 12:00 PM.
   הערה: הענקת כמות שווה של מזון יומית היא קריטית. במקרה של עכברים עם hyperphagia, אם העכברים הזנת זוג מסופקים עם כמות של מזון פחות מאשר הצריכה ההתנדבות שלהם בבת אחת, הם כנראה לצרוך את כל המזון סיפק ולהפוך באופן יעיל. הדבר עלול למנוע השוואה נכונה לעכברים שטופלו במידה ולבלבל את התוצאה.
4. חזור על שלבים 2.1 – 2.3 למשך המחקר.

3. ניתוח הרכב הגוף

הערה: מאז לטווח ארוך אם משפיע על משקל הגוף בעכברים, הרכב הגוף יכול להיות נמדד במחזורים המתאימים (למשל, כל 3 או 4 מחזורים) באמצעות מנתח הרכב הגוף לכמת שומן המסה רזה בחיים, עכברים לא מורדם.

1. הפעל את מנתח הרכב הגוף.
   הערה: לפני תחילת התוכנית, להשאיר את המחשב על לפחות 2-3 h כדי להתחמם.
2. הפעל בדיקת מערכת על מנתח הרכב הגוף כדי לבדוק את דיוק המדידה שלו. במקרה הצורך, כיילו את המערכת באמצעות דגימות שמן קנולה ומים.
3. למדוד את משקל הגוף של כל עכבר.
4. מניחים את העכבר במחזיק בעלי חיים קטנים.
5. הוסף מפריד כדי להגביל את התנועה הפיזית של העכבר במהלך המדידה והכנס את המחזיק לתוך מנתח הרכב הגוף.
6. . הפעל את תוכנית הסריקה
   הערה: זה לוקח בערך 90-120 s לנתח.
7. לאחר המדידה, להסיר את המחזיק מהציוד ולהביא את העכבר בחזרה לכלוב.
   הערה: פרוטוקול מפורט יותר ניתן למצוא בפרסום הקודם⁹.

4. גלוקוז ובדיקות עמידות לאינסולין

1. עבור בדיקת עמידות גלוקוז (GTT), למדוד את משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר לפני העומס לצום ולסמן את הזנב עם סמן קבוע ליצירת אינדקס קל ומהיר.
2. מניחים עכברים בכלובים חדשים ללא אוכל בשעה 7:00 בלילה לצום.
   הערה: צום לילה הוא הפרוטוקול הסטנדרטי, אך בשל הפיזיולוגיה של העכבר (g., הגביראת ניצול הגלוקוז לאחר צום^{ממושך 10,11}), צום קצר (~ 6 h) ניתן להשתמש כמתואר עבור הויט.
3. לאחר הצום 14 – 16 h (9:00 בבוקר למחרת), למדוד את משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר ולחשב את כמות המינון הגלוקוז על בסיס משקל הגוף.
   הערה: כדי למנוע הערכה יתר של חוסר סובלנות של גלוקוז בעכברים שמנים, המסה רזה שהושג ניתוח הרכב הגוף ניתן להשתמש כדי לחשב את המינון גלוקוז^12,13.
4. עבור כל עכבר, לחתוך את קצה הזנב (0.5 – 1.0 מ"מ) באמצעות מספריים כירורגי נקי. לאחר לנגב את טיפת הדם הראשונה, לצייר טיפה טרייה של דם מן הזנב ולמדוד בסיסית הצום של רמת הגלוקוז בדם עם הגלוקומיטר.
   הערה: חיתוך זנב נוסף אינו נדרש עבור כל מדידת הגלוקוז בדם במהלך GTT או אוויט. הפצע יכול להיות מרענן על ידי שהוא משלחים אותו עם גזה כדי למשוך טיפת דם.
5. עכברים נושא להזרקה הצפק (כגון) של גלוקוז (1 מ"ג/g של משקל הגוף).
   הערה: מבוסס על מטרת הניסוי (למשל, בחינת אפקטים בבדיל), מינהל אוראלי של גלוקוז ניתן לבצע על ידי gavage אוראלי. הפרוטוקול עבור GTT אוראלי (OGTT) ניתן למצוא במחקר אחר¹⁴.
6. מדידת הגלוקוז בדם מהזנב ב 0, 5, 15, 30, 60, ו 120 דקות לאחר הזרקת גלוקוז.
7. לאחר סיום GTT, לספק כמות מספקת של מזון.
8. עבור בדיקת עמידות לאינסולין (אוויט), הסר מזון ב 9:00 בבוקר.
   הערה: מכיוון ששניהם GTT ו-אוויט הם חוויות לגרימת מתח עבור עכברים שיכולים להעלות את רמות הגלוקוז בדם ולשנות את הפיזיולוגיה, מומלץ לבצע את האוויט לאחר שהוא מספק לפחות 2-3 ימים של שחזור לאחר ניסוי GTT.
9. לאחר צום עבור 6 h (3:00 PM), למדוד את הגלוקוז דם הבסיסי מן הזנב כמתואר בשלב 4.4.
10. עכברים הנושא להזרקת אינסולין (0.65 mU/g של משקל הגוף).
11. מדידת הגלוקוז בדם מהזנב ב 0, 15, 30, 60, 90, ו 120 מינימום לאחר הזרקת אינסולין.
12. לאחר לסיים את הרייט, לספק כמות מספקת של מזון.

5. קלורימטריה עקיפה

הערה: מטבוליזם אנרגיה של עכברים IF שטופלו ניתן להעריך עוד יותר באמצעות calorimetry עקיפה על מחזור אחד של IF. זה יהיה למדוד את צריכת החמצן (VO₂), הייצור פחמן דו חמצני (vco₂), יחס החילוף הנשימתי (RER), וחום (קק ל/h).

1. הפעל את העוצמה של מערכת קלורימטר עקיפה לפחות 2 h לפני הפעלת הניסוי.
   הערה: חימום מערכת זה חשוב למדידה מדויקת.
2. הכינו כלובים עם מצעים נקיים, מילוי בקבוקי מים, והוסיפו את כמות האוכל המוקדמת ביותר למזון.
3. בדקו את מצב הדריריט. וסודה ליים אם מחוון צבע של הדריריט מופיע ורוד, מה שמעיד על כך שהדריריט ספג כמות גבוהה של לחות, יש צורך להחליף או לעלות בדריריט טרי.
4. כיול המערכת באמצעות גז עם הרכב מסוים (0.5% CO₂, 20.5% O₂).
5. מדידת משקל הגוף ואת הרכב הגוף של כל עכבר, אשר ישמש כדי לנרמל את VO₂ ו vco₂ נתונים.
6. מניחים בעדינות עכבר אחד לכל כלוב.
7. להרכיב כלובים מטבולית, למקם אותם בחדר הסביבה מבוקרת טמפרטורה, ולהתחבר קווי גז וכבל חיישן הפעילות.
8. לאחר הגדרת פרופיל הניסוי על-ידי הוספת פרמטרים ניסיוניים מתאימים באמצעות התוכנה, הפעל את התוכנית למדידה. מטרת המדידה של היום הראשון היא לספק תקופת ההסתגלות ולמדוד את חילוף החומרים של האנרגיה הבסיסית.
9. בשעה 12:00 ביום למחרת, הנושא עכברים ל -24 שעות של צום על ידי הסרת מזון ופירורים מהחגב והתחתון של הכלוב. במקרה הצורך, החליפו במצעים נקיים.
10. לאחר 24 שעות, להוסיף את כמות מראש שקלה של אוכל הופר מזון לתקופת האכלה מחדש.
11. המשך למדוד ל-48 h הבא. בדוק באופן קבוע אם המערכת פועלת ללא הפרעה בחומרה או בתוכנה.
12. לאחר השלמת המדידה, לסיים את התוכנית ולהביא עכברים בחזרה לכלובים המקורי שלהם. מדדו את כמות שאריות המזון כדי לבחון צריכת מזון.
13. הפרוטוקול המפורט לקלאורימטר עקיף ניתן למצוא במחקר הקודם⁹.

תוצאות

איור 1 מציג את ניתוחי האכלה לאחר הצום 24 h ואת ההשוואה בין 1:1 ו 2:1 לסירוגין צום. תקופת צום של 24 שעות הביא לירידה של ~ 10% במשקל הגוף, אשר התאושש לגמרי לאחר 2 ימים של האכלה מחדש (איור 1א). תקופת צום של 24 שעות הנגרמת hyperphagia במהלך 2 הימים הבאים של האכלה מחדש (

Discussion

זה היה מתועד היטב כי אם מספק השפעות בריאותיות מועילות על מחלות שונות בבני אדם ובעלי חיים^{8,15,16,17,18,19}. המנגנונים הבסיסיים שלה, כגון המעי האוטומטי ומיקרובידום המעיים, הובהר לאחרונה. הפר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Indirect calorimeter
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	For GTT
EchoMRI 3-in-1	EchoMRI	EchoMRI 3-in-1	Body composition analysis
Glucometer and strips	Bayer	Contour NEXT	These are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12451	3.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12452	4.73 Kcal/g
Insulin	El Lilly	Humulin R	For ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J	The Jackson Laboratory	#000632	Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	#000664
Normal chow (17% Kcal% fat)	Harlan	#2918
Scale	Mettler Toledo		Body weight and food intake measurement