Valutazione degli effetti metabolici del digiuno intermittente isocalorico 2:1 nei topi

Riepilogo

L'articolo corrente descrive un protocollo dettagliato per il digiuno intermittente isocalorico 2:1 per proteggere e trattare contro l'obesità e il metabolismo alterato del glucosio nei topi selvatici e ob/ob.

Abstract

Il digiuno intermittente (IF), un intervento dietetico che prevede la restrizione energetica periodica, è stato considerato per fornire numerosi benefici e contrastare le anomalie metaboliche. Finora sono stati documentati diversi tipi di modelli IF con durate variabili di periodi di digiuno e di alimentazione. Tuttavia, interpretare i risultati è impegnativo, poiché molti di questi modelli comportano contributi multifattoriali da strategie di restrizione del tempo e calorie. Ad esempio, il modello di digiuno giornaliero alternativo, spesso utilizzato come regime DI ROditore IF, può provocare l'alimentazione inedito, suggerendo che i benefici per la salute di questo intervento sono probabilmente mediati tramite limiti calorici e cicli di rifornimento di digiuno. Recentemente, è stato dimostrato con successo che 2:1 IF, che comprende 1 giorno di digiuno seguito da 2 giorni di alimentazione, può fornire protezione contro l'obesità indotta dalla dieta e miglioramenti metabolici senza una riduzione dell'apporto calorico complessivo. Presentato qui è un protocollo di questo intervento isocalorico 2:1 SE nei topi. È inoltre descritto un protocollo di alimentazione a coppie (PF) necessario per esaminare un modello murino con comportamenti alimentari alterati, come l'iperfagia. Utilizzando il regime 2:1 IF, è dimostrato che isocalorico IF porta a ridotto aumento di peso corporeo, migliore omeostasi del glucosio, e il dispendio energetico elevato. Pertanto, questo regime può essere utile per studiare gli impatti sulla salute di IF su varie condizioni di malattia.

Introduzione

Lo stile di vita moderno è associato a un tempo di assunzione giornaliero più lungo e a periodi di digiuno più lunghi¹. Ciò contribuisce all'attuale epidemia globale di obesità, con svantaggi metabolici osservati nell'uomo. Il digiuno è stato praticato nel corso della storia umana, e i suoi diversi benefici per la salute includono durata prolungata, ridotto danno ossidativo, e ottimizzata energia omeostasi^2,3. Tra i vari modi per praticare il digiuno, la privazione periodica di energia, definita digiuno intermittente (IF), è un metodo dietetico popolare che è ampiamente praticato dalla popolazione generale a causa del suo regime facile e semplice. Recenti studi in modelli preclinici e clinici hanno dimostrato che SE può fornire benefici per la salute paragonabili a prolungati a digiuno prolungato e restrizione calorica, suggerendo che IF può essere una potenziale strategia terapeutica per l'obesità e le malattie metaboliche^2,3,4,5.

I regimi IF variano in termini di durata e frequenza del digiuno. Il digiuno alternato del giorno (ad esempio, 1 giorno di alimentazione/1 giorno di digiuno; 1:1 IF) è stato il regime IF più comunemente usato nei roditori per studiare i suoi effetti benefici sulla salute, le malattie cardiovascolari, le malattie neurodegenerative, ecc.^2,3. Tuttavia, come mostrato negli studi precedenti^6,7, e ulteriormente confermata meccanicamente nella nostra analisi di assunzione di energia⁸, 1:1 IF risultati in underfeeding ( . a causa della mancanza di tempo di alimentazione sufficiente per compensare la perdita di energia. Questo rende poco chiaro se i benefici per la salute conferiti da 1:1 SE sono mediati da restrizione calorica o modifica dei modelli alimentari. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo regime IF che è mostrato qui, che comprende un modello di digiuno di 2 giorni /1 giorno (2:1 IF), che fornisce ai topi il tempo sufficiente per compensare l'assunzione di cibo (99%) e peso corporeo. Questi topi vengono quindi confrontati con un gruppo ad libitum (AL). Questo regime consente l'esame degli effetti dell'IF isocalorico in assenza di riduzione calorica nei topi selvatici.

Al contrario, in un modello murino che mostra un comportamento di alimentazione alterato, l'alimentazione AL potrebbe non essere una condizione di controllo adeguata per confrontare ed esaminare gli effetti di 2:1 IF. Ad esempio, poiché i topi ob/ob (un modello genetico comunemente usato per l'obesità) presentano iperfagia a causa della mancanza di leptina che regola l'appetito e la sazietà, quelli con 2:1 IF presentano un apporto calorico ridotto del 20% rispetto ai topi ob/ob con alimentazione AL. Pertanto, per esaminare e confrontare correttamente gli effetti dell'IF nei topi ob/ob, è necessario impiegare un gruppo di coppia di alimentazione come controllo adeguato.

Nel complesso, viene fornito un protocollo completo per eseguire isocalorico 2:1 IF, compreso l'uso di un controllo di alimentazione di coppia. È inoltre dimostrato che isocalorico 2:1 SE protegge i topi dall'obesità indotta dalla dieta ad alto contenuto di grassi e/o dalla disfunzione metabolica nei topi di tipo selvaggio e ob/ob. Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare gli impatti benefici sulla salute di 2:1 IF su varie condizioni patologiche tra cui disturbi neurologici, malattie cardiovascolari e cancro.

Protocollo

Tutti i metodi e protocolli qui sono stati approvati dai Comitati per la cura degli animali nel The Animal Care and Veterinary Service (ACVS) dell'Università di Ottawa e del Centro di Phenogenomica (TCP) e sono conformi agli standard del Canadian Council on Animal Care. Va notato che tutte le procedure qui descritte dovrebbero essere eseguite sotto l'approvazione istituzionale e governativa, nonché da personale tecnicamente abile. Tutti i topi erano alloggiati in gabbie ventilate standard in ambienti con temperatura e umidità con 12 h/12 h di cicli di luce/scuro (21-22 gradi centigradi, 30%-60% di umidità per l'alloggiamento normale) e libero accesso all'acqua. I topi maschi C57BL/6J e ob/ob sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory.

1. 2:1 Isocalorico IF Regimen

1. Per i modelli di topo di obesità magra e indotta dalla dieta, preparare una dieta normale (17% di grassi, ND) o dieta ad alto contenuto di grassi (45% di grassi, HFD).
   NOTA: il 60% di HFD può essere utilizzato per indurre una grave obesità indotta dalla dieta; tuttavia, a causa della morbidezza del pellet alimentare, è relativamente difficile misurare con precisione l'assunzione quotidiana di cibo. Un sistema di misurazione continua automatizzato può migliorare la versatilità per più tipi di diete.
2. Misurare il peso corporeo della linea di base e la composizione corporea di ogni topo a 7 settimane di età utilizzando una scala e EchoMRI, rispettivamente.
   NOT: Fare riferimento alla sezione 3 per la misurazione della composizione corporea.
3. Sulla base del peso corporeo e dei risultati della composizione corporea, dividono casualmente e allo stesso modo i topi maschi C57BL/6J di 7 settimane in due gruppi: ad libitum (AL) e gruppi di digiuno intermittente (IF).
4. Mettere da due a tre topi per gabbia e garantire l'accesso gratuito all'acqua potabile.
   NOT: Il numero di topi per gabbia può influenzare il comportamento di assunzione di cibo. Si raccomanda di mantenere lo stesso numero di topi per gabbia in tutti i gruppi durante lo studio.
5. Fornire 1 settimana di acclimatamento al nuovo ambiente gabbia e dieta prima di iniziare il regime IF.
6. Periodo di digiuno: spostare i topi in una gabbia pulita con biancheria da letto fresca alle 12:00. Non aggiungere cibo per il gruppo IF, fornendo al gruppo AL una quantità ponderata di cibo.
   NOT: Per ogni ciclo di digiuno, è importante modificare le gabbie per entrambi i gruppi AL e IF per garantire che entrambi i gruppi siano esposti alla stessa quantità di tempo di movimentazione.
7. Dopo 24 h, misurare i pesi dei topi in entrambi i gruppi e negli avanzi di cibo nelle gabbie AL.
   NOT: Assicurarsi di includere il peso delle briciole di cibo sulla tramoggia alimentare e sul fondo della gabbia, soprattutto quando si utilizza HFD, poiché i topi spesso rimuovono piccoli pellet o frammenti di cibo dalla tramoggia e li tengono vicino ai siti di nidificazione. L'assunzione media di energia per mouse alla fine di ogni ciclo 2:1 (3 giorni) è di circa 35 kcal, equivalente a 10 g per una dieta normale (3,3 kcal/g) e 7 g per HFD (4,73 kcal/g).
8. Periodo di alimentazione: fornire una quantità ponderata di cibo alle 12:00 per entrambi i gruppi AL e IF.
9. Dopo 48 h di fornire il cibo, misurare il peso del cibo e dei topi rimasti.
10. Ripetere i passaggi da 1,6 a 1,10 per la durata dello studio(ad es. 16 settimane).

2. Gruppo di controllo di alimentazione a coppie (PF)

NOT: Per un esperimento IF in cui si osserva un comportamento di alimentazione alterato in un modello di topo (ad esempio, iperfagia nei topi ob/ob), è necessario disporre di un gruppo di alimentazione di coppia come controllo per un corretto confronto indipendente dalle calorie con IF.

1. Per il gruppo di controllo PF, scaglionare la pianificazione dell'esperimento in modo che la stessa quantità di cibo utilizzata dal gruppo IF venga offerta al gruppo PF (Figura 2).
2. Misurare la quantità di cibo consumato dal gruppo IF per 2 giorni di periodo di rialimentazione.
3. Dividere questa quantità di cibo consumato nel gruppo IF in tre proporzioni e fornirlo quotidianamente al gruppo PF alle 12:00 PM.
   NOT: Fornire la stessa quantità di cibo ogni giorno è fondamentale. Nel caso di topi con iperfagia, se i topi alimentati in coppia sono dotati di una quantità di cibo inferiore al loro consumo volontario in una sola volta, probabilmente consumeranno tutto il cibo fornito e saranno effettivamente digiunati. Ciò può quindi impedire un corretto confronto con i topi trattati con IF e confondere il risultato.
4. Ripetere i passaggi da 2.1–2.3 per la durata dello studio.

3. Analisi della composizione corporea

NOT: Poiché l'IF a lungo termine influisce sul peso corporeo nei topi, la composizione corporea può essere misurata a cicli appropriati (ad esempio, ogni 3 o 4 cicli) utilizzando un analizzatore di composizione corporea per quantificare il grasso e la massa magra in topi vivi non anestesizzati.

1. Accendere l'analizzatore della composizione corporea.
   NOT: Prima di avviare il programma, lasciare la macchina accesa per almeno 2-3 h per riscaldarsi.
2. Eseguire un test di sistema sull'analizzatore della composizione corporea per verificarne l'accuratezza della misurazione. Se necessario, calibrare il sistema utilizzando campioni di olio di canola e acqua.
3. Misurare il peso corporeo di ogni mouse.
4. Posizionare il mouse in un piccolo supporto cilindrico animale.
5. Inserire un delimitatore per vincolare il movimento fisico del mouse durante la misurazione e posizionare il supporto nell'analizzatore di composizione del corpo.
6. Eseguire il programma di scansione.
   NOT: Ci vogliono circa 90–120 s per analizzare.
7. Dopo la misurazione, rimuovere il supporto dall'apparecchiatura e riportare il mouse nella gabbia.
   NOT: Un protocollo più dettagliato può essere trovato in una precedente pubblicazione⁹.

4. Test di tolleranza al glucosio e all'insulina

1. Per il test di tolleranza al glucosio (GTT), misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni mouse prima di sottoporre al digiuno e contrassegnare la coda con un marcatore permanente per un'indicizzazione facile e rapida.
2. Mettere i topi in nuove gabbie senza cibo alle 19:00 per il digiuno notturno.
   NOT: Il digiuno notturno è il protocollo standard, ma a causa della fisiologia del topo (ad esempio, aumento dell'utilizzo del glucosio dopo il digiuno prolungato di^10,11), il digiuno più breve (6 h) può essere utilizzato come descritto per l'ITT.
3. Dopo il digiuno 14-16 h (9:00 AM nel mattino seguente), misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni topo e calcolare la quantità di dosaggio del glucosio in base al peso corporeo.
   NOT: Per evitare una sopraelevazione dell'intolleranza al glucosio nei topi obesi, la massa magra ottenuta dall'analisi della composizione corporea può essere utilizzata per calcolare il dosaggio del glucosio^12,13.
4. Per ogni mouse, tagliare la punta della coda (0,5–1,0 mm) utilizzando forbici chirurgiche pulite. Dopo aver ripulito la prima goccia di sangue, disegna una nuova goccia di sangue dalla coda e misura il livello di glucosio nel sangue del digiuno al basale con il glucometer.
   NOT: Il taglio della coda aggiuntivo non è necessario per ogni misurazione della glicemia durante GTT o ITT. La ferita può essere rinfrescata da abradendola con garza per disegnare una goccia di sangue.
5. Sottoporre i topi a un'iniezione intraperitale (i.p.) di glucosio (1 mg/g di peso corporeo).
   NOT: Sulla base dell'obiettivo di un esperimento (adesempio, esaminando gli effetti dell'incretina), la somministrazione orale del glucosio può essere eseguita mediante gavage orale. Il protocollo per orale GTT (OGTT) può essere trovato in un altro studio¹⁴.
6. Misurare la glicemia dalla coda a 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min iniezione post-glucosio.
7. Dopo aver terminato la GTT, fornire una quantità sufficiente di cibo.
8. Per il test di tolleranza all'insulina (ITT), rimuovere il cibo alle 9:00.
   NOT: Dal momento che sia GTT che ITT sono esperienze che inducono stress per i topi che possono aumentare i livelli di glucosio nel sangue e cambiare la fisiologia, si consiglia di eseguire ITT dopo aver fornito almeno 2-3 giorni di recupero dopo l'esperimento GTT.
9. Dopo il digiuno per 6 h (3:00 PM), misurare il glucosio nel sangue di base dalla coda come descritto al passaggio 4.4.
10. Soggetti all'iniezione di insulina i.p. (0,65 mU/g di peso corporeo).
11. Misurare la glicemia dalla coda a 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min di iniezione post-insulina.
12. Dopo aver terminato ITT, fornire una quantità sufficiente di cibo.

5. Calorimetria indiretta

NOT: Il metabolismo energetico dei topi trattati con IF può essere ulteriormente valutato attraverso la calorimetria indiretta su un singolo ciclo di IF. Ciò misurerà il consumo di ossigeno (VO_2),la produzione di biossido di carbonio (VCO_2),il rapporto di cambio respiratorio (RER) e il calore (kcal/h).

1. Accendere la potenza del sistema calorimetrico indiretto almeno 2 h prima di eseguire l'esperimento.
   NOT: Questo riscaldamento del sistema è importante per una misurazione accurata.
2. Preparare le gabbie con biancheria da letto pulita, riempire le bottiglie d'acqua e aggiungere la quantità pre-pesata di chow alle tramogge di cibo.
3. Controllare le condizioni del Drierite e calce soda. Se un indicatore di colore del Drierite appare rosa, che indica che il Drierite ha assorbito una grande quantità di umidità, è necessario sostituire o top con Drierite fresco.
4. Calibrare il sistema utilizzando un gas con la composizione specifica (0,5% CO₂, 20,5% O₂).
5. Misurare il peso corporeo e la composizione corporea di ogni mouse, che verrà utilizzato per normalizzare i dati VO₂ e VCO_2.
6. Posizionare delicatamente un mouse per gabbia.
7. Assemblare le gabbie metaboliche, posizionarle nella camera ambiente a temperatura controllata e collegarle alle linee di gas e al cavo del sensore di attività.
8. Dopo aver impostato il profilo dell'esperimento aggiungendo parametri sperimentali appropriati utilizzando il software, eseguire il programma per la misurazione. Lo scopo della misurazione del primo giorno è quello di fornire un periodo di acclimatazione e misurare il metabolismo energetico di base.
9. Alle 12:00 del giorno seguente, sottoporre i topi a 24 h di digiuno rimuovendo cibo e briciole dalla tramoggia e dal fondo della gabbia. Se necessario, sostituire con biancheria da letto pulita.
10. Dopo 24 h, aggiungere la quantità pre-pesata di chow alla tramoggia per il periodo di rialimentazione.
11. Continuare a misurare per i prossimi 48 h. Controllare regolarmente se il sistema è in esecuzione senza interruzioni hardware o software.
12. Dopo aver completato la misurazione, terminare il programma e riportare i topi nelle gabbie originali. Misurare la quantità di cibo residuo per esaminare l'assunzione di cibo.
13. Il protocollo dettagliato per la calorimetria indiretta può essere trovato in uno studio precedente⁹.

Risultati

La figura 1 mostra le analisi di alimentazione dopo il digiuno di 24 h e il confronto tra il digiuno intermittente 1:1 e 2:1. Un periodo di digiuno di 24 h ha comportato una riduzione del peso corporeo del 10%, che è stata completamente recuperata dopo 2 giorni di refeeding (Figura 1A). Un periodo di digiuno di 24 h ha indotto l'iperfagia durante i successivi 2 giorni di refeeding (Figura 1B). Tutt...

Discussione

È stato ben documentato che SE fornisce effetti benefici sulla salute su varie malattie sia in esseri umani che negli animali^{8,15,16,17,18,19}. I suoi meccanismi alla base, come l'autofagia e il microbioma intestinale, sono stati recentemente chiariti. Il protocollo presentato descrive un regime isocalorico 2:1 IF nei topi pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Indirect calorimeter
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	For GTT
EchoMRI 3-in-1	EchoMRI	EchoMRI 3-in-1	Body composition analysis
Glucometer and strips	Bayer	Contour NEXT	These are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12451	3.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12452	4.73 Kcal/g
Insulin	El Lilly	Humulin R	For ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J	The Jackson Laboratory	#000632	Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	#000664
Normal chow (17% Kcal% fat)	Harlan	#2918
Scale	Mettler Toledo		Body weight and food intake measurement