АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Текущая статья описывает подробный протокол для изокалорийных 2:1 прерывистый пост для защиты и лечения от ожирения и нарушения метаболизма глюкозы в диком типе и об / об мышей.

Аннотация

Было сочтено, что прерывистое голодание (ИФ), диетическое вмешательство, связанное с периодическим ограничением энергии, обеспечивает многочисленные преимущества и противодействует нарушениям обмена веществ. До сих пор были задокументированы различные типы моделей IF с различной продолжительностью периодов поста и кормления. Однако интерпретация результатов является сложной задачей, поскольку многие из этих моделей включают в себя многофакторный вклад как от стратегий ограничения времени, так и от ограничений калорий. Например, альтернативная модель поста дня, часто используемая в качестве режима ГРЫЗУНов IF, может привести к недостаточному питанию, что позволяет предположить, что польза для здоровья от этого вмешательства, вероятно, опосредована как с помощью ограничения калорий, так и циклов кормления натощак. Недавно было успешно продемонстрировано, что 2:1 IF, состоящий из 1 дня поста, а затем 2 дня кормления, может обеспечить защиту от диетического ожирения и метаболических улучшений без сокращения общего потребление калорий. Представлен протокол этого изокалория 2:1 ЕСЛИ вмешательства у мышей. Также описан протокол парного кормления (PF), необходимый для изучения модели мыши с измененным поведением еды, таким как гиперфагия. Использование 2:1 IF режим, показано, что изокалории IF приводит к снижению веса тела, улучшение гомеостаза глюкозы, и повышенные расходы энергии. Таким образом, этот режим может быть полезным для изучения воздействия if на здоровье.

Введение

Современный образ жизни связан с более длительным ежедневным временем вхожжья пищи и более короткими периодами поста1. Это способствует нынешней глобальной эпидемии ожирения, с метаболическим недостатки видели в организме человека. Пост практиковался на протяжении всей истории человечества, и его разнообразные преимущества для здоровья включают длительную продолжительность жизни, снижение окислительного повреждения, и оптимизированный энергетический гомеостаз2,3. Среди нескольких способов практики поста, периодические лишения энергии, называют прерывистый пост (IF), является популярным диетическим методом, который широко практикуется населением в связи с его легкой и простой режим. Недавние исследования в доклинических и клинических моделях показали, что ЕСЛИ может обеспечить преимущества для здоровья, сопоставимые с длительным постом и ограничением калорий, предполагая, что IF может быть потенциальной терапевтической стратегией для ожирения и метаболических заболеваний2,3,4.

Схемы IF различаются с точки зрения продолжительности и частоты поста. Альтернативный день поста (т.е. 1 день кормления / 1 день поста; 1:1 IF) был наиболее часто используемый режим IF у грызунов для изучения его благотворное воздействие на здоровье ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, нейродегенеративных заболеваний и т.д.2,3. Однако, как показано в предыдущих исследованиях6,7, и далее механически подтверждено в нашем анализе потребление энергии8, 1:1 IF результаты в недоедания (80%) из-за отсутствия достаточного времени кормления, чтобы компенсировать потерю энергии. Это делает неясным, являются ли преимущества для здоровья, предоставленные 1:1, если опосредовано ограничением калорий или изменением структуры питания. Таким образом, новый режим IF был разработан и показан здесь, включающий 2-дневного кормления/1 день поста (2:1 IF) шаблон, который предоставляет мышам достаточно времени, чтобы компенсировать потребление пищи (99%) и массы тела. Эти мыши затем по сравнению с ad libitum (AL) группы. Этот режим позволяет иссучить эффекты изокалорийного ЕСЛИ при отсутствии снижения калорий у мышей дикого типа.

В отличие от мыши модели, которая exhibits измененное поведение кормления, AL кормления не может быть надлежащим условием контроля для сравнения и изучения последствий 2:1 IF. Например, так как ob/ob мышей (обычно используется генетическая модель для ожирения) экспонат гиперфагии из-за отсутствия лептина, регулирующего аппетит и сытость, те, с 2:1 IF экспонат 20% снижение калорий по сравнению с об / об мышей с AL кормления. Таким образом, чтобы должным образом изучить и сравнить эффекты IF у ob/ob мышей, пара кормления группы в качестве подходящего контроля должны быть использованы.

В целом, предусмотрен всеобъемлющий протокол для выполнения изокалорийных 2:1 IF, включая использование пара кормления управления. Кроме того, показано, что изокалорийные 2:1 IF защищает мышей от ожирения с высоким содержанием жира, вызванного диетой и/или метаболической дисфункцией как у диких, так и у мышей типа "об/об". Этот протокол может быть использован для изучения благотворного воздействия 2:1 IF на различные патологические заболевания, включая неврологические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания и рак.

протокол

Все методы и протоколы здесь были одобрены комитетами по уходу за животными в службе по уходу за животными и ветеринарной службы (ACVS) Университета Оттавы и Центра феногеномики (TCP) и соответствуют стандартам Канадского совета по уходу за животными. Следует отметить, что все описанные здесь процедуры должны осуществляться на институциональном и правительственном уровне, а также сотрудниками, которые технически владеют. Все мыши были размещены в стандартных вентилируемых клетках в помещениях с температурой и влажностью с 12 ч/12 ч светлыми/темными циклами (21-22 градусов по Цельсию, 30%-60% влажности для нормального жилья) и бесплатным доступом к воде. Мужские C57BL/6J и ob/ob мышей были получены из лаборатории Джексона.

1. 2:1 Исокалорийный IF Regimen

  1. Для постных и диетических моделей мыши ожирения, подготовить либо нормальную диету (17% жира, ND) или с высоким содержанием жира диеты (45% жира, HFD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 60% HFD может быть использован для индуцирования тяжелой диеты индуцированного ожирения; тем не менее, из-за мягкости пищевых гранул, это относительно трудно точно измерить ежедневное потребление пищи. Автоматизированная система непрерывного измерения может улучшить универсальность для нескольких типов диет.
  2. Измерьте базовый вес тела и состав тела каждой мыши в возрасте 7 недель, используя шкалу и EchoMRI, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 3 для измерения состава тела.
  3. Основываясь на весе тела и результатах состава тела, случайным образом и в равной степени разделите 7 недельных мышей C57BL/6J на две группы: ad libitum (AL) и прерывистые группы голодания (IF).
  4. Поместите от двух до трех мышей на клетку и обеспечить свободный доступ к питьевой воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество мышей в клетке может повлиять на поведение в пищу. Рекомендуется поддерживать равное количество мышей на клетку во всех группах во время исследования.
  5. Предоставьте 1 неделю акклиматизации к новой среде клетки и диеты перед началом режима IF.
  6. Период поста: переместить мышей в чистую клетку со свежими постельными принадлежностями в 12:00 вечера. Не добавляйте пищу для группы IF, обеспечивая при этом взвешенное количество пищи для группы AL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого цикла поста важно менять клетки для групп AL и IF, чтобы обе группы подвергались одинаковому времени обработки.
  7. После 24 ч, измерить вес мышей в обеих группах и остатки пищи в клетках AL.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы включить вес пищевой крошки на пищевой бункер и дно клетки, особенно при использовании HFD, как мыши часто удалить небольшие гранулы или фрагменты пищи из бункера и держать их вблизи гнезда сайтов. Среднее потребление энергии на мышь в конце каждого цикла 2:1 (3 дня) составляет около 35 ккал, что эквивалентно 10 г для нормальной диеты (3,3 ккал/г) и 7 г для HFD (4,73 ккал/г).
  8. Период кормления: обеспечить взвешенное количество пищи в 12:00 вечера для al и IF групп.
  9. После 48 ч обеспечения пищи, измерить вес остатков пищи и мышей.
  10. Повторите шаги 1.6-1.10 в течение всего исследования (например, 16 недель).

2. Контрольная группа по парной кормлению (ПФ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента IF, в котором измененное поведение кормления наблюдается в модели мыши (например, гиперфагия у мышей об/об), необходимо иметь группу кормления пара в качестве контроля для правильного независимого от калорий сравнения с IF.

  1. Для контрольной группы PF, ошеломить график эксперимента так, что такое же количество пищи, потребляемой группой IF предлагается группе PF (Рисунок 2).
  2. Измерьте количество пищи, потребляемой группой If в течение 2 дней периода кормления.
  3. Разделите это количество потребляемой пищи в группе IF равномерно на три пропорции и предоставьте его ежедневно группе ПФ в 12:00.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечение равного количества пищи ежедневно имеет решающее значение. В случае мышей с гиперфагией, если пары кормили мышей обеспечены количество пищи меньше, чем их добровольное потребление сразу, они, скорее всего, потребляют все при условии, питание и стать эффективно поститься. Это может предотвратить надлежащее сравнение с МФ лечения мышей и затруднить результат.
  4. Повторите шаги 2.1-2.3 в течение всего периода исследования.

3. Анализ состава тела

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку долгосрочный IF влияет на вес тела у мышей, состав тела может быть измерен на соответствующих циклах (например, каждые 3 или 4 цикла) с помощью анализатора состава тела для количественной оценки жира и мышечной массы в живых, неанестезиированных мышей.

  1. Включите анализатор композиции тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом программы, оставьте машину на, по крайней мере 2-3 ч, чтобы согреться.
  2. Выполнить системный тест на анализаторе состава тела, чтобы проверить его точность измерения. При необходимости откалибруем систему с использованием рапсового масла и проб воды.
  3. Измерьте массу тела каждой мыши.
  4. Поместите мышь в небольшой животных цилиндрический держатель.
  5. Вставьте делимитер, чтобы ограничить физическое движение мыши во время измерения и поместить держатель в анализатор состава тела.
  6. Запустите программу сканирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ занимает примерно 90-120 с.
  7. После измерения снимите держатель с оборудования и верните мышь в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробный протокол можно найти в предыдущей публикации9.

4. Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину

  1. Для теста на толерантность к глюкозе (GTT) измерьте массу тела и состав тела каждой мыши перед постом и пометьте хвост постоянным маркером для легкой и быстрой индексации.
  2. Поместите мышей в новые клетки без пищи в 7:00 вечера для ночного поста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ночной пост является стандартным протоколом, но из-за физиологии мыши (например, увеличение использования глюкозы после длительного поста10,11), короче поста (6 ч) могут быть использованы, как описано для ITT.
  3. После поста 14-16 ч (9:00 утра на следующее утро), измерить вес тела и состав тела каждой мыши и рассчитать количество дозы глюкозы на основе массы тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать переоценки непереносимости глюкозы у тучных мышей, мышечная масса, полученная в ходе анализа состава тела, может быть использована для расчета дозировки глюкозы12,13.
  4. Для каждой мыши, вырезать кончик хвоста (0,5-1,0 мм) с помощью чистых хирургических ножниц. После вытирания первой капли крови, сделать свежую каплю крови из хвоста и измерить базовый уровень глюкозы в крови натощак с глюкометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная резка хвоста не требуется для каждого измерения глюкозы в крови во время GTT или ITT. Рана может быть освежена, погнав ее марлей, чтобы нарисовать каплю крови.
  5. Обязать мышей интраперитонеальной (т.п.) инъекции глюкозы (1 мг/г массы тела).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На основе цели эксперимента(например, изучения эффектов инкретина), пероральное введение глюкозы может быть выполнено устные gavage. Протокол для устного GTT (OGTT) можно найти в другом исследовании14.
  6. Измерьте уровень глюкозы в крови из хвоста на 0, 5, 15, 30, 60 и 120 минут после инъекции глюкозы.
  7. После окончания GTT, обеспечить достаточное количество пищи.
  8. Для теста на толерантность к инсулину (ITT) удалите пищу в 9:00 утра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Так как GTT и ITT являются стресс-индуцирующих опытом для мышей, которые могут повысить уровень глюкозы в крови и изменить физиологию, рекомендуется выполнять ITT после предоставления по крайней мере 2-3 дней восстановления после эксперимента GTT.
  9. После поста в течение 6 ч (3:00 вечера), измерьте базовый уровень глюкозы в крови из хвоста, как описано в шаге 4.4.
  10. Обязать мышей i.p. инъекции инсулина (0.65 мЕ/г массы тела).
  11. Измерьте уровень глюкозы в крови из хвоста на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 мин после инсулиновой инъекции.
  12. После окончания ITT, обеспечить достаточное количество пищи.

5. Непрямая калория

ПРИМЕЧАНИЕ: Энергетический метаболизм обработанных ИФ мышей можно дополнительно оценить с помощью косвенной калорийности в течение одного цикла If. Это позволит измерять потребление кислорода (VO2),производство двуокиси углерода (VCO2),соотношение дыхательного обмена (RER) и тепла (ккал/ч).

  1. Включите мощность непрямой системы калорий, по крайней мере 2 ч перед запуском эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система разогрева имеет важное значение для точного измерения.
  2. Подготовка клетки с чистыми постельными принадлежностями, заполнить бутылки с водой, и добавить предварительно взвешенное количество чау в пищу бункеров.
  3. Проверьте состояние соды Drierite и извести. Если цветной индикатор дририта выглядит розовым, что указывает на то, что дририт впитал большое количество влаги, необходимо заменить или сверху свежим дририритом.
  4. Калибровать систему с помощью газа с определенным составом (0,5% CO2,20,5% O2).
  5. Измерьте массу тела и состав тела каждой мыши, которая будет использоваться для нормализации данных VO2 и VCO2.
  6. Аккуратно поместите одну мышь на клетку.
  7. Соберите метаболические клетки, поместите их в температурно-контролируемую камеру окружающей среды и подключитесь к газовым линиям и кабелю датчика активности.
  8. После настройки профиля эксперимента путем добавления соответствующих экспериментальных параметров с помощью программного обеспечения запустите программу для измерения. Целью измерения первого дня является обеспечение периода акклиматизации и измерение базового энергетического метаболизма.
  9. В 12:00 вечера на следующий день, подвергнуть мышей 24 ч поста, удалив пищу и крошки из бункера и нижней части клетки. При необходимости замените чистыми постельными принадлежностями.
  10. После 24 ч добавьте предварительно взвешенное количество чау в пищевой бункер для периода кормления.
  11. Продолжайте измерять в течение следующих 48 ч. Регулярно проверяйте, работает ли система без аппаратного обеспечения или прерывания программного обеспечения.
  12. После завершения измерения, прекратить программу и вернуть мышей в свои первоначальные клетки. Измерьте количество оставшейся пищи для изучения пищи.
  13. Подробный протокол для косвенной калорийности можно найти в предыдущем исследовании9.

Результаты

На рисунке 1 показаны анализы кормления после 24 ч поста и сравнение между 1:1 и 2:1 прерывистым постом. Период голодания в 24 ч привел к снижению массы тела на 10%, что было полностью восстановлено после 2 дней кормления(рисунок 1А). 24 ч постный период ин?...

Обсуждение

Хорошо задокументировано, что ЕСЛИ обеспечивает благотворное воздействие на здоровье различных заболеваний у людей и животных8,15,16,17,18,19. Его основные механизмы, такие как аутофа...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

K.-H.K была поддержана Фондом сердца и инсульта Канады Грант-в-помощи (G-18-0022213), J. P. Bickell Фонд и Университет Оттавы Институт сердца Стартовый фонд; H.-K.S. была поддержана грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (PJT-162083), Рубен и Хелен Деннис стипендиат и Sun Life Финансовый Новый следователь премии за диабет исследований от Бантинг и лучший диабет центр (BBDC) и естественных наук и Совет инженерных исследований (NSERC) Канады (RGPIN-2016-06610). R.Y.K. была поддержана стипендией от Фонда исследований кардиологии Университета Оттавы. J.H.L. была поддержана докторской стипендией NSERC и стипендией Онтарио. Y.O. была поддержана UOHI наделенной высшей наградой и стипендией королевы Елизаветы II в области науки и техники.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)Columbus InstrumentsIndirect calorimeter
D-(+)-Glucose solutionSigma-AldrichG8769For GTT
EchoMRI 3-in-1EchoMRIEchoMRI 3-in-1Body composition analysis
Glucometer and stripsBayerContour NEXTThese are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat)Research Diets Inc.#D124513.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat)Research Diets Inc.#D124524.73 Kcal/g
InsulinEl LillyHumulin RFor ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/JThe Jackson Laboratory#000632Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6JThe Jackson Laboratory#000664
Normal chow (17% Kcal% fat)Harlan#2918
ScaleMettler ToledoBody weight and food intake measurement

Ссылки

  1. Gill, S., Panda, S. A Smartphone App Reveals Erratic Diurnal Eating Patterns in Humans that Can Be Modulated for Health Benefits. Cell Metabolism. 22 (5), 789-798 (2015).
  2. Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian Rhythms, and Time-Restricted Feeding in Healthy Lifespan. Cell Metabolism. 23 (6), 1048-1059 (2016).
  3. Longo, V. D., Mattson, M. P. Fasting: molecular mechanisms and clinical applications. Cell Metabolism. 19 (2), 181-192 (2014).
  4. Patterson, R. E., et al. Intermittent Fasting and Human Metabolic Health. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 115 (8), 1203-1212 (2015).
  5. Fontana, L., Partridge, L. Promoting health and longevity through diet: from model organisms to humans. Cell. 161 (1), 106-118 (2015).
  6. Boutant, M., et al. SIRT1 Gain of Function Does Not Mimic or Enhance the Adaptations to Intermittent Fasting. Cell Reports. 14 (9), 2068-2075 (2016).
  7. Gotthardt, J. D., et al. Intermittent Fasting Promotes Fat Loss With Lean Mass Retention, Increased Hypothalamic Norepinephrine Content, and Increased Neuropeptide Y Gene Expression in Diet-Induced Obese Male Mice. Endocrinology. 157 (2), 679-691 (2016).
  8. Kim, K. H., et al. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  9. Lancaster, G. I., Henstridge, D. C. Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Heijboer, A. C., et al. Sixteen h of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of Lipid Research. 46 (3), 582-588 (2005).
  12. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 849-855 (2009).
  13. Jorgensen, M. S., Tornqvist, K. S., Hvid, H. Calculation of Glucose Dose for Intraperitoneal Glucose Tolerance Tests in Lean and Obese Mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 95-97 (2017).
  14. Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Journal of Visualized Experiments. (131), 56672 (2018).
  15. Kim, Y. H., et al. Thermogenesis-independent metabolic benefits conferred by isocaloric intermittent fasting in ob/ob mice. Scientific Reports. 9 (1), 2479 (2019).
  16. Li, G., et al. Intermittent Fasting Promotes White Adipose Browning and Decreases Obesity by Shaping the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 26 (4), 672-685 (2017).
  17. Mitchell, S. J., et al. Daily Fasting Improves Health and Survival in Male Mice Independent of Diet Composition and Calories. Cell Metabolism. 29 (1), 221-228 (2019).
  18. Cignarella, F., et al. Intermittent Fasting Confers Protection in CNS Autoimmunity by Altering the Gut Microbiota. Cell Metabolism. 27 (6), 1222-1235 (2018).
  19. Martinez-Lopez, N., et al. System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy. Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).
  20. Lo Martire, V., et al. Changes in blood glucose as a function of body temperature in laboratory mice: implications for daily torpor. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 662-670 (2018).
  21. Chaix, A., Zarrinpar, A., Miu, P., Panda, S. Time-restricted feeding is a preventative and therapeutic intervention against diverse nutritional challenges. Cell Metabolism. 20 (6), 991-1005 (2014).
  22. Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted Feeding Prevents Obesity and Metabolic Syndrome in Mice Lacking a Circadian Clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
  23. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin- and leptin receptor-deficient rodent models: relevance for human type 2 diabetes. Current Diabetes Reviews. 10 (2), 131-145 (2014).
  24. Pan, W. W., Myers, M. G. Leptin and the maintenance of elevated body weight. Nature Reviews: Neuroscience. 19 (2), 95-105 (2018).
  25. Jackson, D. S., Ramachandrappa, S., Clark, A. J., Chan, L. F. Melanocortin receptor accessory proteins in adrenal disease and obesity. Frontiers in Neuroscience. 9, 213 (2015).
  26. Tolson, K. P., et al. Postnatal Sim1 deficiency causes hyperphagic obesity and reduced Mc4r and oxytocin expression. Journal of Neuroscience. 30 (10), 3803-3812 (2010).
  27. Shimada, M., Tritos, N. A., Lowell, B. B., Flier, J. S., Maratos-Flier, E. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 396 (6712), 670-674 (1998).
  28. Reitman, M. L. Of mice and men - environmental temperature, body temperature, and treatment of obesity. FEBS Letters. 592 (12), 2098-2107 (2018).
  29. Chvedoff, M., Clarke, M. R., Irisarri, E., Faccini, J. M., Monro, A. M. Effects of housing conditions on food intake, body weight and spontaneous lesions in mice. A review of the literature and results of an 18-month study. Food and Cosmetics Toxicology. 18 (5), 517-522 (1980).
  30. Toth, L. A., Trammell, R. A., Ilsley-Woods, M. Interactions Between Housing Density and Ambient Temperature in the Cage Environment: Effects on Mouse Physiology and Behavior. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 708-717 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153GTTITT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены