小鼠间间间禁食的代谢效应评估 2:1 间歇禁食

摘要

本文描述了异热2:1间歇性禁食的详细方案，以保护和治疗野生型和ob/ob小鼠的肥胖和葡萄糖代谢受损。

摘要

间歇性禁食（IF），一种涉及周期性能量限制的饮食干预，被认为具有许多益处和抵消代谢异常。到目前为止，已经记录了不同类型的国际直供模型，其禁食和喂食期不同。然而，解释结果具有挑战性，因为许多模型都涉及时间和卡路里限制策略的多因素贡献。例如，通常用作啮齿动物 IF 方案的隔天禁食模式可能导致喂养不足，这表明这种干预对健康的益处可能通过热量限制和禁食-再喂养周期进行调节。最近，已经成功地证明，2:1 IF，包括1天的禁食，然后2天的喂养，可以提供防止饮食引起的肥胖和代谢改善，而不减少总热量摄入。这里介绍的是这种等量2:1IF干预小鼠的协议。还描述了一个双喂食（PF）协议，需要检查小鼠模型与改变的饮食行为，如高吞咽。使用 2:1 IF 方案，证明等量IF可降低体重增加、改善葡萄糖平衡和增加能量消耗。因此，这种疗法可能有助于研究IF对各种疾病状况的健康影响。

引言

现代生活方式与更长的每日食物摄入时间和较短的禁食^期1相关。这促成了当前的全球肥胖流行，代谢的劣势在人类身上出现。禁食在整个人类历史中一直实践，其多样化的健康益处包括延长寿命，减少氧化损伤，和优化能量^平衡2，3。在几种练习禁食的方法中，定期能量剥夺，称为间歇性禁食（IF），是一种流行的饮食方法，由于其简单易行的疗养，被一般人广泛采用。最近对临床前和临床模型的研究表明，IF可以提供与长期禁食和热量限制相当的健康益处，这表明IF可以作为肥胖和代谢疾病2、3、4、5的潜在治疗策略。

IF方案在禁食持续时间和频率方面有所不同。隔天禁食（即1天喂食/1天禁食;1:1 IF）是啮齿动物最常用的IF疗法，以研究其对肥胖、心血管疾病、神经退行性疾病等有益的健康^影响。然而，如先前^研究6、7所示，在我们的能量摄入^{分析8，1:1}IF导致喂养不足（+80%）中进一步确认由于缺乏足够的喂食时间来弥补能量损失。这使得不清楚1:1 IF所赋予的健康益处是通过限制卡路里还是改变饮食模式来调节的。因此，一个新的IF方案已经开发出来，并在这里显示，包括2天喂食/1天禁食（2:1 IF）模式，这为小鼠提供了足够的时间来补偿食物摄入量（+99%）和体重。然后，将这些小鼠与活动（AL）组进行比较。这种方案能够在野生型小鼠没有热量降低的情况下检查等热IF的影响。

相反，在显示反馈行为改变的小鼠模型中，AL 喂食可能不是比较和检查 2:1 IF 效果的适当控制条件。例如，由于ob/ob小鼠（一种常用的肥胖基因模型）由于缺乏瘦素调节食欲和饱口福而表现出吞咽困难，因此与使用 AL 喂养的ob/ob小鼠相比，2:1 IF 的小鼠表现出热量摄入减少 20%。因此，为了正确检查和比较在ob/ob小鼠中 IF 的影响，需要采用配对喂养组作为适当的对照组。

总体而言，提供了一个全面的协议来执行等分2:1 IF，包括使用对馈送控制。进一步证明，等热2:1 IF保护小鼠免受高脂肪饮食引起的肥胖和/或代谢功能障碍在野生型和ob/ob小鼠。该协议可用于检查 2:1 IF 对各种病理状况（包括神经系统疾病、心血管疾病和癌症）的有益健康影响。

研究方案

这里的所有方法和协议都经渥太华大学动物护理和兽医服务（ACVS）动物护理委员会和动物基因组学中心（TCP）批准，并符合加拿大动物护理理事会的标准。应当指出，此处描述的所有程序都应在机构和政府批准下以及由技术熟练的工作人员执行。所有小鼠都被安置在温度和湿度控制室的标准通风笼中，具有 12 小时/12 小时的光/暗循环（21~22 °C，正常住房湿度为 30%-60%），并可自由取水。雄性C57BL/6J和ob/ob小鼠从杰克逊实验室获得。

1. 2:1 等分 IF 方案

1. 对于瘦和饮食引起的肥胖小鼠模型，准备正常饮食（17%脂肪，ND）或高脂肪饮食（45%脂肪，HFD）。
   注:60%HFD可用于诱发严重的饮食诱发肥胖;然而，由于食物颗粒的柔软性，很难准确测量日常食物的摄入量。自动化连续测量系统可以提高多种饮食的多功能性。
2. 分别使用量表和EchoMRI测量每只小鼠在7周年龄的基线体重和身体组成。
   注:有关身体成分测量，请参阅第 3 节。
3. 根据体重和体组成结果，随机平均地将7周大雄性C57BL/6J小鼠分为两组:利图（AL）和间歇性禁食（IF）组。
4. 每笼放置两到三只老鼠，确保免费获得饮用水。
   注:每个笼子的老鼠数量会影响食物的摄入行为。建议在研究期间，在所有组中保持每个笼子的小鼠数量相等。
5. 在开始IF疗养之前，提供1周的适应新笼子环境和饮食。
6. 禁食期:在中午12点将老鼠转移到带新鲜床上用品的干净笼子里。不要为 IF 组添加食物，同时向 AL 组提供量重的食物量。
   注:对于每个禁食周期，必须更改 AL 组和 IF 组的保持架，以确保两组都暴露在相同数量的处理时间中。
7. 24小时后，测量两组小鼠的重量和AL笼中剩余食物的重量。
   注:确保食物屑的重量包括在食物料斗和笼子底部，特别是在使用 HFD 时，因为小鼠通常会从料斗中取出小颗粒或食物碎片，并放在巢点附近。每只小鼠在2:1周期（3天）结束时的平均能量摄入量约为35千卡，相当于正常饮食（3.3千卡/克）的10克和HFD（4.73千卡/克）的7克。
8. 喂食期:在中午12点为AL组和IF组提供量定量的食物。
9. 提供食物48小时后，测量剩菜和小鼠的重量。
10. 在研究期间（例如，16周）重复步骤 1.6~1.10。

2. 配对喂食 （PF） 控制组

注:对于在小鼠模型中观察到改变的喂养行为的 IF 实验（例如，ob/ob小鼠的吞咽过度），有必要将一对喂食组作为对照，以便与 IF 进行与卡路里无关的正确比较。

1. 对于 PF 控制组，错开实验计划，以便向 PF 组提供相同数量的 IF 组消耗的食物（图2）。
2. 测量 IF 组在 2 天的重新喂养期间消耗的食物量。
3. 将 IF 组中的此消耗食物量均匀地分成三个比例，并在每天中午 12:00 提供给 PF 组。
   注:每天提供同等数量的食物至关重要。对于患有高吞咽症的小鼠，如果一对喂食的小鼠同时获得少于自愿食用的食物量，它们很可能会消耗所有提供的食物，并变得有效禁食。这可能阻止与IF处理小鼠的正确比较，并混淆结果。
4. 在研究期间重复步骤 2.1_2.3。

3. 身体成分分析

注:由于长期IF影响小鼠的体重，身体组成可以在适当的周期（例如，每3或4个周期）测量使用身体成分分析仪量化脂肪和瘦质量在活，非麻醉小鼠。

1. 打开身体成分分析器。
   注:启动程序前，请保持机器打开至少 2~3 小时以预热。
2. 在车身成分分析仪上运行系统测试，以测试其测量精度。如有必要，使用菜籽油和水样校准系统。
3. 测量每只鼠标的体量。
4. 将鼠标放在一个小动物圆环架上。
5. 插入分隔符以在测量过程中约束鼠标的物理移动，并将支架放入身体成分分析仪中。
6. 运行扫描程序。
   注:分析大约需要 90-120 s。
7. 测量后，将支架从设备中取出，并将鼠标带回保持架。
   注:更详细的协议可以在以前的^出版物9中找到。

4. 葡萄糖和胰岛素耐受性测试

1. 对于葡萄糖耐受性测试 （GTT），在禁食前测量每只小鼠的体重和体组，并用永久标记标记尾巴，以便轻松快速地索引索引。
2. 晚上7点将老鼠放在没有食物的新笼子里过夜禁食。
   注:隔夜禁食是标准方案，但由于小鼠生理学（例如，延长^{禁食10，11}后增加葡萄糖利用率），较短的禁食（±6小时）可用于ITT。
3. 禁食14-16小时后（次上午9:00），测量每只小鼠的体重和身体组成，并根据体重计算葡萄糖剂量。
   注:为了避免对肥胖小鼠葡萄糖不耐受性高估，从人体成分分析中获得的瘦质量可用于计算葡萄糖^{剂量12，13。}
4. 对于每只鼠标，使用干净的手术剪刀切割尾部尖端（0.5–1.0 毫米）。擦掉第一滴血后，从尾部抽出一滴新鲜血液，用血糖仪测量基线腹放血糖水平。
   注:在 GTT 或 ITT 期间，每次血糖测量都不需要额外的尾部切割。伤口可以通过用纱布磨碎来吸收一滴血来重新焕发。
5. 让小鼠接受腹内（即p.）葡萄糖注射（1mg/g的体重）。
   注:基于实验的目标（例如，检查在内陆物效应），口服葡萄糖的分泌可以通过口服腹腔进行。口服GTT（OGTT）的规程可以在另一^项研究14中找到。
6. 在葡萄糖注射后0、5、15、30、60和120分钟测量尾部的血糖。
7. 完成 GTT 后，提供足够量的食物。
8. 对于胰岛素耐受性测试 （ITT），在上午 9:00 取出食物。
   注:由于GTT和ITT都是小鼠的减压体验，可以提升血糖水平和改变生理，因此建议在GTT实验后至少恢复2~3天后进行ITT。
9. 禁食 6 小时（下午 3:00）后，测量尾部基线血糖，如步骤 4.4 所述。
10. 使小鼠接受注射胰岛素（体重0.65 mU/g）。
11. 在胰岛素注射后0、15、30、60、90和120分钟测量尾部的血糖。
12. 完成 ITT 后，提供足够量的食物。

5. 间接热量测定

注:IF处理小鼠的能量代谢可以通过在IF的单一周期中间接热量进一步评估。这将测量耗氧_{量（VO2）、}二氧化碳生产（VCO_2）、呼吸交换比（RER）和热（千卡/小时）。

1. 在运行实验之前，请至少 2 小时打开间接热量计系统的功率。
   注:该系统预热对于精确测量非常重要。
2. 用干净的床上用品准备笼子，装满水瓶，并在食物漏斗中加入预称重的奶圈量。
3. 检查德丽特和石灰苏打水的状况。如果 Drierite 的颜色指示器显示为粉红色，表示 Drierite 吸收了大量水分，则需要更换或顶部使用新鲜的 Drierite。
4. 使用具有特定成分的气体（0.5% CO_2，20.5% O₂） 校准系统。
5. 测量每只小鼠的体重和身体组成，用于_标准化VO2和VCO₂数据。
6. 每个笼子轻轻放一只鼠标。
7. 组装代谢笼，将它们放置在温度控制的环境室中，并连接到气体管路和活动传感器电缆。
8. 使用软件添加适当的实验参数设置实验配置文件后，运行该程序进行测量。第一天的测量的目的是提供一个适应和测量基线能量代谢的时期。
9. 第二天中午12点，通过从料斗和笼子底部取出食物和面包屑，让老鼠禁食24小时。如有必要，请更换干净的床上用品。
10. 24小时后，在重新喂食期间将预称重的菜量加入食物料斗。
11. 继续测量接下来的 48 小时。定期检查系统是否运行，没有硬件或软件中断。
12. 完成测量后，终止程序，将小鼠带回原来的笼子。测量剩菜量，以检查食物的摄入量。
13. 间接热量学的详细方案可以在以前的^研究9中找到。

结果

图1显示了24小时禁食后的进餐分析以及1:1和2:1间间歇禁食的比较。24小时禁食期导致体重减少±10%，在重新喂食2天后完全恢复（图1A）。24小时禁食期在随后2天的重新喂食期间诱发吞咽过度（图1B）。然而，将1:1替代日禁食和2:1间间歇禁食之间的能量摄入量进行比较后发现，1:1 IF的重新喂食期的1天是不够?...

讨论

有充分记载，IF对人类和动物的各种疾病8、15、16、17、18、19等多种疾病都具有有益的健康作用。其潜在的机制，如自噬和肠道微生物群，最近已被阐明。提出的方案描述了小鼠的等分2:1 IF方案，用于研究IF对饮食引起的肥胖和相关代谢功能障碍的卡...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Indirect calorimeter
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	For GTT
EchoMRI 3-in-1	EchoMRI	EchoMRI 3-in-1	Body composition analysis
Glucometer and strips	Bayer	Contour NEXT	These are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12451	3.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12452	4.73 Kcal/g
Insulin	El Lilly	Humulin R	For ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J	The Jackson Laboratory	#000632	Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	#000664
Normal chow (17% Kcal% fat)	Harlan	#2918
Scale	Mettler Toledo		Body weight and food intake measurement