זיהוי פשוט של Cilia הראשי על ידי אימונולוסץ

Summary

סיליה העיקרית היא מבנים extracellular הקשורים centriole. זיהוי cilia ראשוני על ידי כתם immunofluorescent הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה מאוד. בפרוטוקול זה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal.

Abstract

cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1 של מחזור התא, להיות resorbed לפני המיטוזה. ניתן לדמיין cilia הראשי עם שיטות מתוחכמות מאוד, כולל מיקרוסקופאלקטרונים שידור, הדמיה 3D, או שימוש בתוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי. עם זאת, כתמי חיסון של cilia הראשי יש צורך לבצע שיטות אלה. פרסום זה מתאר פרוטוקול לזיהוי קל של cilia הראשי במבחנה על ידי הכתמת אצטילאט אלפא טובולין (אקסואנם) וגמא טובולין (גוף בזל). פרוטוקול כתמים חיסוני זה הוא פשוט יחסית ומביא לתמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ארבעה קווי תאים (C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) המבטאים cilia ראשי תוקנו, immunostained, ותמונה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal.

Introduction

cilia העיקריים הם חושיים, בודדים, קרום כבול, מבנים לא מוזגים הקשורים צנטריול אמו של התא. cilia העיקרי נמצאים על רוב תאי החוליות למעט תאי דם אדומים, adipocytes¹, ו hepatocytes². cilia הראשי נוצרים כמו אקסואנם מוארך מורכב על ידי microtubules, שהרכיב העיקרי שלהם הוא α-tubulin. האקסואנם גדל מגוף הבסאלי, המוערך מ-0.0. אורכו של cilia הראשי משתנה בין 2-10 μm; עם זאת, ממדיו יכולים להשתנות במהלך גליצילציה, רעב, היפוקסיה, מתח ציטוקוקס, או לאחר חשיפה לקרינה^{מיוננת 3,4,,5,6,7}. בדרך כלל, תאים יש רק סיליום ראשוני אחד, אשר מעורב morphogenesis ותא איתות מסלולים חשובים להתפשטות תאים^{ובידול 8,9}.

cilia הראשי מוסדרים באופן דינמי במהלך התקדמות מחזור התא, במיוחד במהלך שלבי G0/G1, וororbed לפני הזנת מיטוזה בתהליך המשויך deacetylation טובלין בתיווך HDAC6 (histone deacetylase 6)¹⁰. הרגע המדויק של ספיגת cilia הראשי תלוי סוג התא ואת הביטוי של גנים המעורבים ישירות בתהליך זה, כגון אורורה A, Plk1, TcTex-1^11,,12,13. בהתאם לסוג התא, cilia הראשי לבטא סוגים שונים של קולטנים, ערוצי יון, ומסלולי איתות פעילים. אלה כוללים את קולטני האיתות החשובים ביותר המשפיעים על התפשטות והישרדות, EGFR, PDGFR ו- FGFR. כלולים גם כמה מסלולי איתות שעשויים להשפיע על הפונקציה של איברים אחד או יותר, כולל קיפוד, חריץ, ו Wnt. הודות קולטנים אלה ומסלולי איתות, cilia הראשי גם לבצע פונקציה chemosensory. פונקציה זו מאפשרת cilia הראשי לזהות ליגנדים ספציפיים עבור חריץ, הורמונים, וחומרים פעילים ביולוגית כגון סרוטונין או somatostatin. פונקציות ספציפיות אחרות המוצגות על ידי cilia ראשוני של אורכים שונים כוללים תגובה לשינויים בטמפרטורה, כוח המשיכה, osmolality¹⁴.

Cilia הראשי ניתן לדמיין באמצעות שיטות שונות, כגון הדמיה חיה, מיקרוסקופאלקטרון שידור, הדמיה 3D, או על ידי תוכנה לזיהוי אוטומטי של cilia הראשי^5,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה הן מאוד מיוחדים ומתמשך מחקר צריך בסיסי, מהיר, ושיטות קלות להכתים cilia הראשי בכל שלב של המחקר. מתואר היא שיטה קלה ושימושית לזיהוי cilia הראשי בתאים תרבותיים.

Protocol

1. הכנת מדיה תרבות, פתרונות ומנות

1. Autoclave את כיסויי (22 x 22 מ"מ). הכינו 6 צלחות טובות. להפשיר סרום עוף עוברי (FBS) ופניצילין אנטיביוטי / סטרפטומיצין ולחמם את טמפרטורת התרבות בינונית לחדר (RT). השתמש ב- trypsin-EDTA (0.25%) ו- 1 PBS (פוספט אגירה תמיסת מלח עם סידן ומגנזיום) כדי לעבור את התאים.
2. להכין טרי 4% paraformaldehyde (PFA) ב dH₂O (800 מ"ג של PFA ב 20 מ"ל של dH₂O). PFA חייב להיות מוכן טרי לכל ניסוי. מערבבים ומחמים את התמיסה ב-55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות במכסה המנוע. להתקרר ב RT. להוסיף 1 M נתרן הידרוקסיד עד הפתרון מתבהר (pH = 7.2–7.4). יש לאחסן ב-4°C עד שבוע אחד.
   הערה: PFA רעיל; תמיד ללבוש ציוד מגן אישי הולם ולהתכונן בשכונה כימית.
3. להכין 500 מ"ל של מדיה תרבות, DMEM (Dulbecco של שונה הנשר של מדיום) המכיל 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו 2% גלוטמין.
4. להכין 13 מ"ל של 1% פתרון ג'לטין ב dH_{סטרילי 2}O (130 מ"ג של ג'לטין ב 13 מ"ל של dH₂O). השתמש 2 מ"ל של 1% ג'לטין עבור כל באר בצלחת 6 באר. תמשיך להיות סטרילי.
5. נקה את מכסה המנוע של זרימת ה למינאר באמצעות 70% אתנול. מניחים את החומר הנדרש בתוך מכסה המנוע של זרימת ה למינאר לפני תחילת הניסוי.

2. תרבות תאים להכתמת אימונוציטוכימיה

1. להפשיר את התאים (במחקר זה C2C12, MEF, NHLF, ופיברובלסטים בעור) באמצעות טכניקות סטנדרטיות וצלחת אותם במבחנות T75 בתוספת ~ 10-12 מ"ל של התקשורת המוכנה. דגירה ב 37 °C / 5% CO₂/ 90% לחות יחסית (RH) עד התאים להגיע 70% confluence.
2. מוציאים את התאים מהאינקובטור ומניאים אותם בכסה המנוע של זרימת ה למינאר. הסר את מדיית התרבות ושטוף את התאים לזמן קצר פי 2 עם PBS אחד. הוסף ~ 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתוך בקבוקון T75 דגירה ב 37 ° C עבור ~ 5 דקות. בדוק מעת לעת את המיקרוסקופ ההפוך כדי לפקח על ניתוק התא.
   הערה: זמן הדגירה תלוי בקו התא ולכן יש לקבוע אותו באופן אמפירי.
3. בעדינות respenpent התאים ב 10 מ"ל של מדיה תרבות, pipetting בזהירות כדי ליצור מתלה תא יחיד. יש לשטוף את הבקבוקון שוב במידת הצורך.
4. הנח את מתלי התא בצינור חסונים 50 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב ~ 200 x g. לשמן את supernatant, להוסיף 10 מ"ל של מדיה תרבות, בעדינות respenpen את הכדור. קח 20 μL של מתלה התא ולערבב יחס 1:1 עם טריפאן כחול לספור ציטומטר בעקבות השיטה הסטנדרטית.
5. מניחים כיסוי אחד בתוך כל באר של צלחת 6 באר באמצעות פינצטה. לכסות את כיסויי עם ג'לטין על ידי שפיכת ~ 2 מ"ל לתוך בארות. כך יעזור לתאים לצרף את הכיסויים. מסירים את תמיסת הג'לטין ולתת לאוויר להתייבש לכמה דקות. כיסויי הכיסוי מוכנים כעת לטיפוח התאים. התחל את הטיפוח מיד.
6. זרע 100,000 פיברובלסטים לתוך כל באר ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבות. דגירה התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C / 5% CO₂/ 90% RH. בשלב זה, ניתן לטפל בתאים בהתאם לצרכי המשתמש. טיפולים כדי לגרום ciliation תוארו בעבר^4,5.
   הערה: מספר הזרעה הראשוני תלוי בזמן ההכפלה של התאים ויש לקבוע אותו בהתאם.

3. כתמי חיסון של סיליה ראשונית במבחנה

1. לחמם את 4% paraformaldehyde ל RT. להכין פיפטות פסטר, 1x PBS (RT), מיכל פסולת, 15 מ"ל צינורות חסינים, micropipettes (0.5-10 μL, 20-200 μL, ו 100-1,000 μL) וטיפים. קח את התאים מהאינקובטור והניח אותם על הספסל.
   הערה: אין צורך לבצע את הליך ההכתמה בתנאים סטריליים. כל הפתרונות חייבים להיות ב-RT.
2. הסר מדיה מכל באר. השאר את כיסוי הכיסוי בתוך הבאר. בעדינות רבה לשטוף את התאים 3x עם 2 מ"ל של 1x PBS. באמצעות פיפטה פסטר, להוסיף 2 מ"ל של 4% PFA לתוך כל באר כדי לתקן את התאים. דגירה במשך 10 דקות ב- RT. הסר את PFA ולשטוף 3x עם PBS 1x.
   הערה: השתמש תמיד בנפח מספיק כדי לכסות את כל כיסוי במהלך תקופות הדגירה. לעולם אל תיתן לתאים להתייבש. לעולם אל תשפוך את הפתרונות ישירות על מכסה.
3. הכן 0.5% Triton X-100 ב- 13 מ"ל של 1x PBS 10 דקות לפני השימוש. מוסיפים 2 מ"ל לכל באר. דגירה במשך 15 דקות. יש לשטוף בעדינות פי 4 עם PBS אחד.
   הערה: Triton X-100 אינו מסיס PBS ב RT. לחמם את פתרון 0.5% Triton X-100 כדי 37 ° C באמבט מים כדי להמיס אותו.
4. להפשיר סרום עז 5 דקות לפני השימוש. לדלל את סרום העזים ב 1x PBS ביחס 1:20 כפתרון חסימה. להוסיף 150 μL לכל כיסוי ותרגם במשך 20 דקות ב RT.
   הערה: להאריך את תקופת החסימה עד 60 דקות במידת הצורך. אין לשטוף את התאים לאחר חסימה עם סרום עזים.
5. להפשיר את הנוגדנים העיקריים (כלומר, נגד אצטילאט אלפא טובלין ואנטי גמא טובלין) 5 דקות לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים בנפרד ב 1x PBS כדלקמן: עכבר נגד אצטילאט אלפא טובלין ביחס 1:800 וארנב נגד גמא טובלין ביחס 1:300. הסר את פתרון החסימה. אל תתרחץ. להוסיף 150 μL של שני דילולנים נוגדנים לכיסויים ומדגם במשך 60 דקות ב RT.
   הערה: אם דגירה בן לילה להשתמש 500-1,000 μL של פתרונות נוגדנים העיקריים, לאטום את צלחת 6 באר עם סרט פרפין, ולאחסן ב 4 ° C. לחלופין, להשתמש 150 μL של נוגדנים דגירה בתא לחות.
6. הסר את הנוגדנים הראשיים. לשטוף את כיסויי בעדינות רבה 3x עם 2 מ"ל של PBS 1x. הכן את הנוגדנים המשניים ב- PBS 1x על-ידי דילול נפרד של כבשים Cy3 נגד עכבר ואלכסה Fluor488 עז נגד ארנב ביחס 1:300. להוסיף 150 μL של שני דילולנים משניים לכיסויים. דגירה במשך 45 דקות ב RT בחושך.
   הערה: דגירה בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. שילובים אחרים של נוגדנים משניים יכולים לשמש כצורך.
7. הכן פתרון DAPI (4', 6-diamidino-2-פנילידול) בהתאם להוראות היצרן. לאחסן את האליציטוטים העודפים ב-20°C. דילול 10 μL מ aliquot מניות (1:5,000) ב 50 מ"ל של 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של דילול זה לכיסויים. דגירה במשך 5 דקות ב RT בחושך.
   הערה: חשוב לערר את התאים בחושך כדי למנוע פוטו-בליך. ניתן לאחסן את דילול DAPI ב- 4 °C למשך עד חודש אחד.
8. הכן 2 מחטים, שקופיות, פינצטה, ומדיה הרכבה. תייג את השקופיות.
9. הסר את פתרון DAPI מהבארות. לשטוף 3x עם 1pBS. הצבת טיפה אחת של מדיה טעינה בכל שקופית. השתמש במחט כדי להרים בעדינות את הכיסוי מתחתית הבאר. הפוך את כיסוי הכיסוי באמצעות הפינצטה והינו אותו בעדינות על טיפת המדיה ההרכבה. בזהירות להסיר את כל בועות.
10. הגן על השקופיות מפני אור ואחסן אותן למשך הלילה ב- 4°C.
11. השתמש מיקרוסקופ פלורסנט או confocal עם הגדלה גבוהה כדי לדמיין את cilia הראשי.
    הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בחושך ב- 4 °C למשך עד חודשיים.

תוצאות

הכתמה החיסונית של cilia הראשי הוא הליך פשוט יחסית שתוצאות תמונות באיכות גבוהה. בניסויים אלה, פיברובלסטים המבטאים cilia ראשוני תוקנו, immunostained, ותמונה במיקרוסקופ פלורסנט או confocal בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הסיליום הראשי זוהה באמצעות אצטילאט α-טובלין ו ơ-tubulin. ההערכה של cilia הראשי יכול להתבצע ברמ?...

Discussion

מספר מחברים תיארו שיטות מגוונות לזיהוי סיליה ראשית, לעתים גם מתארים שיטות קיבעון שונות שיכולות להשפיע^{על הגילוי שלהם 6,20,21,22}. ללא קשר, קשה למצוא פרוטוקול מלא וישיר לזיהוי. הזמינות המוכנה של שיטה כזו תהיה ללא ספק של סיוע רב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco