İmmünfluoresan siyon ile Primer Silya'nın Basit Tespiti

Özet

Primer silia centriole ile ilişkili hücre dışı yapılardır. İmmünfloresan boyama ile primer silia tespiti son derece yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu protokolde primer silya yı ifade eden fibroblastlar sabit, immünolekeli ve floresan veya konfokal mikroskopta görüntülendi.

Özet

Primer silya, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında, özellikle hücre döngüsünün G0/G1 evreleri sırasında, mitoz dan önce rezorbe edilir. Primer silia iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da primer silia otomatik algılama için yazılım kullanarak dahil olmak üzere son derece sofistike yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak bu yöntemlerin gerçeklefltirilmesi için primer silyanın immünüdüoresan boyamasi gerekmektedir. Bu yayın asetilli alfa tubulin boyama tarafından primer silia in vitro kolay tespiti için bir protokol açıklar (aksoneme) ve gama tubulin (bazal vücut). Bu immünofloresan boyama protokolü nispeten basittir ve yüksek kaliteli görüntülerle sonuçlanır. Bu protokol, primer silya'yı ifade eden dört hücre hattının (C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) nasıl sabit, immünosülvetli ve floresan veya konfokal mikroskopla görüntülenmiş olduğunu açıklamaktadır.

Giriş

Primer silia duyusal, soliter, membrana bağlı, hücrenin ana centriole ile ilişkili nonmotile yapılardır. Primer silya kırmızı kan hücreleri hariç en omurgalı hücrelerde bulunur, adipositler¹, ve hepatositler². Primer silya, ana bileşeni α-tubulin olan mikrotübüllerden oluşan uzamış bir aksonme olarak oluşur. Aksonme γ-tubulin yapılandırılır bazal gövde, yetişir. Primer silyanın uzunluğu 2-10 μm arasında değişir; ancak, boyutları glisilasyon sırasında değişebilir, açlık, hipoksi, sitotoksik stres, ya da iyonlaştırıcı^radyasyonamaruz kaldıktan sonra 3^,4,5,6,7. Genellikle, hücrelerin sadece bir birincil cilium var, hangi morfogenez ve hücre sinyalyolları hücre çoğalması ve farklılaşma için önemli yer almaktadır^8,9.

Primer silia, özellikle G0/G1 evrelerinde hücre döngüsü ilerlemesi sırasında dinamik olarak düzenlenir ve HDAC6 (histone deacetylaz 6)¹⁰aracılı tubulin deasetilasyonu ile ilişkili bir süreçte mitoz bölünmeye girmeden önce rezorbe edilir. Primer silia rezorpsiyon tam an hücre tipi ve doğrudan aurora A, Plk1, TcTex-1^11,12^,13gibi bu süreçte yer genlerin ekspresyonuna bağlıdır.¹³ Hücre tipine bağlı olarak, primer silya reseptörleri farklı ifade, iyon kanalları, ve aktif sinyal yolları. Bunlar arasında proliferasyon ve sağkalımı etkileyen en önemli sinyal reseptörleri, EGFR, PDGFR ve FGFR bulunmaktadır. Kirpi, Çentik ve Wnt gibi bir veya daha fazla organın işlevini etkileyebilecek sinyal yollarından bazıları da dahildir. Bu fonksiyon birincil silya Çentik için belirli ligands tespit sağlar, hormonlar, ve serotonin veya somatostatin gibi biyolojik olarak aktif maddeler. Farklı uzunluklarda primer silya tarafından sergilenen diğer özel fonksiyonlar sıcaklık, yerçekimi ve osmolality¹⁴değişikliklere reaksiyon içerir.

Birincil silia canlı görselleştirme, iletim elektron mikroskobu, 3D görüntüleme, ya da birincil silia^55,15,,^16,17otomatik algılama için yazılım gibi çeşitli yöntemlerle görselleştirilmiş olabilir. Ancak, bu yöntemler son derece uzmanlaşmış ve devam eden araştırma araştırma her aşamasında birincil silya boyama için temel, hızlı ve kolay yöntemler ihtiyacı vardır. Açıklanan kültürlü hücrelerde birincil silya tespiti için kolay ve yararlı bir yöntemdir.

Protokol

1. Kültür ortamının, çözümlerinin ve yemeklerinin hazırlanması

1. Otoklav kapakları (22 x 22 mm). 6 iyi plaka hazırlayın. Çözülme fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik penisilin / streptomisin ve oda sıcaklığına kültür ortamı sıcak (RT). Tripsin-EDTA (%0.25) kullanın ve 1x PBS (kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin) hücreleri geçmesi.
2. DH₂O'nda taze %4 paraformaldehit (PFA) (20 mL dH₂O'da 800 mg PFA) hazırlayın. PfA her deney için yeni olarak hazırlanmalıdır. Çözeltiyi 55 °C'de kaputta 30 dk ısıtın. RT. Çözelti netleşene kadar 1 M sodyum hidroksit ekleyin (pH = 7.2-7.4). 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
   Not: PFA toksiktir; her zaman yeterli kişisel koruyucu ekipman giymek ve kimyasal başlık hazırlamak.
3. %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin ve %2 glutamin içeren 500 mL kültür ortamı, DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartalı orta) hazırlayın.
4. Steril dH₂O'da %1 jelatin çözeltisinin 13 mL'sini hazırlayın (13 mL dH₂O'da 130 mg jelatin). 6 kuyuluk tabaktaki her kuyu için 2 mL %1 jelatin kullanın. Steril tutun.
5. % 70 etanol kullanarak laminar akış kaputunu temizleyin. Deneye başlamadan önce gerekli malzemeyi laminar akış kaputunun içine yerleştirin.

2. İmmünositokimya boyama için hücre kültürü

1. Hücreleri eritin (Bu çalışmada C2C12, MEF, NHLF ve deri fibroblastları) standart teknikler kullanarak ve hazırlanan ortamın ~10-12 mL'si ile desteklenen bir T75 şişesinde plakalayın. Hücreler %70 birleştiğinde %37 °C/5% CO₂/90% bağıl nem (RH) ile kuluçkaya yatırın.
2. Hücreleri kuvözden çıkarın ve laminar akış kaputuna yerleştirin. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile kısa bir süre 2x durula. T75 şişesine ~2 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin ve ~5 dk boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Hücre ayrışmasını izlemek için ters mikroskobu periyodik olarak kontrol edin.
   NOT: Kuluçka süresi hücre hattına bağlıdır ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmelidir.
3. Kültür medyasının 10 mL'lik hücrelerini yavaşça askıya alın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için dikkatlice pipetleme. Gerekirse şişeyi tekrar durula.
4. Hücre süspansiyonuna 50 mL konik tüp ve santrifüjde ~200 x g'de5 dk yerleştirin. Supernatant decant, kültür medya 10 mL ekleyin ve yavaşça pelet askıya. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini alın ve trypan mavisi ile 1:1 oranında karıştırın ve standart yönteme göre bir sitometrede sayın.
5. Cımbız kullanarak 6 kuyuluk tabak her kuyu nun içine bir kapak kaydırın. Kuyulara ~2 mL dökerek kapakları jelatinle kaplar. Bu hücrelerin kapakları eklemek yardımcı olacaktır. Jelatin çözeltisini çıkarın ve birkaç dakika havanın kurumasına izin verin. Kapaklar artık hücrelerin ekimi için hazır. Hemen ekime başlayın.
6. Her kuyuya 100.000 fibroblast tohum ve 2 mL kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 °C/5%₂CO 2/90% RH'de kuluçkaya yatırın. Bu noktada, hücreler kullanıcının ihtiyaçlarına göre tedavi edilebilir. Silyasyon indüklemek için tedaviler daha önce tarif edilmiştir^4,5.
   NOT: İlk tohumlama sayısı hücrelerin iki katına çıkarma süresine bağlıdır ve buna göre belirlenmelidir.

3. Primer siliain in vitro immünükoporesan boyantisi

1. %4'lük paraformaldehiti RT'ye ısıtın Pasteur pipetleri, 1x PBS (RT), atık konteyneri, 15 mL konik tüpler, mikropipetler (0,5-10 μL, 20-200 μL ve 100-1000 μL) ve ipuçlarını hazırlayın. Kuvözdeki hücreleri alın ve banka yerleştirin.
   NOT: Boyama işleminin steril koşullarda yapılması gerekmez. Tüm çözümler RT'de olmalıdır.
2. Her kuyudan ortamı kaldırın. Kapak kapağını kuyunun içinde bırak. Hücreleri 2 mL 1x PBS ile 3x yavaşça yıkayın. Pasteur pipeti kullanarak, hücreleri onarmak için her kuyuya 2 mL %4 PFA ekleyin. RT.'de 10 dakika kuluçkaya yat. PFA'yı çıkarın ve 1x PBS ile 3x yıkayın.
   NOT: Kuluçka dönemlerinde tüm kapak kaymasını kapsayacak kadar her zaman yeterli hacim kullanın. Asla hücrelerin kurumasına izin verme. Çözeltilerin hiçbirini doğrudan kapak kapağına dökmeyin.
3. Kullanmadan önce 13 mL 1x PBS 10 dk %0,5 Triton X-100 hazırlayın. Her kuyuya 2 mL ekleyin. 15 dakika kuluçka. 1x PBS ile 4 x hafifçe yıkayın.
   NOT: Triton X-100, PBS'de ÇÖZÜNmez, RT. %0.5 Triton X-100 çözeltisini 37 °C'ye kadar su banyosunda çözünür.
4. Kullanmadan önce keçi serumu 5 dk eritin. Keçi serumunu 1x PBS'de 1:20 oranında bloke edici bir çözelti olarak seyreltin. Her kapak slip'e 150 μL ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Gerekirse blokaj süresini 60 dk'ya kadar uzatın. Keçi serumu ile bloke sonra hücreleri yıkamayın.
5. Birincil antikorları (yani, anti-acetylated alfa tubulin ve anti-gama tubulin) 5 dk kullanmadan önce eritin. Antikorları 1x PBS'de ayrı ayrı şu şekilde seyreltin: fare 1:800 oranında asetilalfa tubulin ve 1:300 oranında tavşan anti-gama tubulin. Engelleme çözümlerini kaldırın. Yıkamayın. Kapaklara her iki antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin ve RT'de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bir gecede kuluçkaya yatan primer antikor solüsyonlarının 500-1.000 μL'sini kullanıyorsanız, 6 kuyu plakasını parafin filmli kapatın ve 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, nem odasında 150 μL antikor ve kuluçka kullanın.
6. Birincil antikorları çıkarın. 2 mL 1x PBS ile kapakları çok hafifçe 3x yıkayın. 1:300 oranında Ayrı Cy3 koyun anti-fare ve Alexa Fluor488 keçi anti-tavşan seyrelterek 1x PBS ikincil antikorlar hazırlayın. Kapaklara her iki sekonder antikor seyreltmesinin 150 μL'sini ekleyin. Karanlıkta RT 45 dakika kuluçka.
   NOT: Fotobeyazlama önlemek için karanlıkta kuluçka. Gerektiğinde diğer ikincil antikor kombinasyonları kullanılabilir.
7. Üreticinin talimatlarına göre bir DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindole) çözeltisi hazırlayın. Fazla aliquotları -20 °C'de saklayın. 1x PBS'nin 50 mL'inde bir stok aliquot'undan (1:5.000) 10 μL seyreltin. Bu seyreltmenin 2 mL'sini kapaklara ekleyin. Karanlıkta RT 5 dakika kuluçka.
   NOT: Fotobeyaztlamayı önlemek için karanlıkta ki hücreleri kuluçkaya yatırmak önemlidir. DAPI seyreltme 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
8. Hazırlamak 2 iğneler, slaytlar, cımbız ve montaj medya. Slaytları etiketle.
9. DAPI çözümlerini kuyulardan çıkarın. 1x PBS ile 3x yıkayın. Her slayta bir damla montaj ortamı koyun. Kapağı kuyunun dibinden hafifçe kaldırmak için iğneyi kullanın. Cımbızkullanarak kapağı çevirin ve yavaşça montaj ortamının üzerine yerleştirin. Dikkatlice herhangi bir kabarcıklar kaldırın.
10. Slaytları ışıktan koruyun ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
11. Primer silya görselleştirmek için yüksek büyütme ile bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın.
    NOT: Slaytlar karanlıkta 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.

Sonuçlar

Primer silianın immünoresan boyama yüksek kaliteli görüntüler le sonuçlanan nispeten basit bir işlemdir. Bu deneylerde, primer silya ifade eden fibroblastlar, yukarıda açıklanan protokole göre floresan veya konfokal mikroskopiçinde sabit, immünoskoplu ve görüntülendi. Primer cilyum asetilatlı α-tubulin ve γ-tubulin kullanılarak saplandı. Primer silianın değerlendirilmesi çeşitli düzeylerde yapılabilir ve bu konudaki herhangi bir değişiklik iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalma ile bağlan...

Tartışmalar

Çeşitli yazarlar birincil silya tespiti için çeşitli yöntemler açıklanan, bazen de kendi algılama etkileyebilir çeşitli fiksasyon yöntemleri açıklayan^6,20,21,22. Ne olursa olsun, algılama için tam ve basit bir protokol bulmak zordur. Böyle bir yöntemin hazır kullanılabilirliği şüphesiz birincil silya soruşturma çalışmasına büyük yardımcı olacaktır, özellikle ar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco