Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции

Резюме

Первичные реснички являются внеклеточными структурами, связанными с центриолом. Первичное обнаружение ресничок с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания является относительно простой процедурой, которая приводит к чрезвычайно высококачественным изображениям. В этом протоколе фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе.

Аннотация

Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1 клеточного цикла, ресорбируются до митоза. Первичные реснички можно визуализировать с помощью очень сложных методов, включая электронную микроскопию передачи, 3D-изображение или программное обеспечение для автоматического обнаружения первичных ресничок. Тем не менее, иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок необходимо для выполнения этих методов. Эта публикация описывает протокол для легкого обнаружения первичных ресничок in vitro путем окрашивания ацетилированного альфа-тубулина (аксонема) и гамма-тубулина (базального тела). Этот иммунофлюоресцентный протокол окрашивания относительно прост и приводит к высококачественным изображениям. В настоящем протоколе описывается, как четыре клеточные линии (C2C12, MEF, NHLF и фибробласты кожи), выражают первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены флуоресцентным или конфокальные микроскопы.

Введение

Первичные реснички сенсорные, одиночные, мембранные, немотильные структуры, связанные с матери центриоля клетки. Первичные реснички находятся на большинстве позвоночных клеток, за исключением красных кровяных телец,^{адипоцитов 1}, и гепатоцитов². Первичные реснички образуются как удлиненный аксонем, состоящий из микротрубочек, основным компонентом которых является З-тубулин. Аксонем растет из базального тела, которое структурировано из З-тубулина. Длина первичных ресничок колеблется от 2 до 10 мкм; однако, его размеры могут меняться во время гликилирования, голодания, гипоксии, цитотоксического стресса, или после воздействия ионизирующего излучения^{3,,4,,5,,6,,7.} Как правило, клетки имеют только один первичный цилий, который участвует в морфогенезе и клеточной сигнализации пути важны для пролиферации^{клеток и дифференциации 8,9}.

Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1, и ресорбируются перед входом в митоз в процессе, связанном с деацетилированием тубулина при посредничестве HDAC6 (гистон диацетилаза 6)¹⁰. Точный момент первичной ресорбции реций зависит от типа клетки и экспрессии генов, непосредственно участвующих в этом процессе, таких как Аврора A, Plk1, TcTex-1^11,12,13. В зависимости от типа клетки, первичные реснички выражают различные типы рецепторов, ионных каналов и активных сигнальных путей. К ним относятся наиболее важные сигнальные рецепторы, влияющие на пролиферацию и выживание, EGFR, PDGFR и FGFR. Также включены некоторые из сигнальных путей, которые могут повлиять на функцию одного или нескольких органов, в том числе Ежик, Нотч, и Wnt. Благодаря этим рецепторам и сигнальных путей, первичные реснички также выполнять химиосенсорную функцию. Эта функция позволяет первичным реснички обнаружить конкретные лиганды для Notch, гормоны, и биологически активных веществ, таких как серотонин или соматостатин. Другие специфические функции, выставленные первичными реснички разной длины включают реакцию на изменения температуры, гравитации и осмолальности^14.

Первичные реснички могут быть визуализированы с помощью различных методов, таких как живая визуализация, электронная микроскопия передачи, 3D-изображение, или с помощью программного^{обеспечения для автоматического обнаружения первичных ресничок 5,15,16,17}. Тем не менее, эти методы являются высокоспециализированными и текущих исследований потребностей основных, быстрых и простых методов для окрашивания первичных ресничок на каждом этапе исследований. Описанный является простым и полезным методом для обнаружения первичных ресничок в культурных клетках.

протокол

1. Подготовка культурных средств массовой информации, решений и блюд

1. Автоклав крышки (22 х 22 мм). Приготовьте 6 хорошо пластин. Оттепель плода бычьей сыворотки (FBS) и антибиотик пенициллин / стрептомицин и тепло культуры средней до комнатной температуры (RT). Использование трипсина-ЭДТА (0.25%) и 1x PBS (фосфат буферный солевой раствор с кальцием и магнием) для прохождения клеток.
2. Приготовьте свежий 4% параформальдегид (PFA) в dH₂O (800 мг ПФА в 20 мл dH₂O). PFA должен быть только что подготовлен к каждому эксперименту. Перемешать и нагреть раствор при температуре 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут в капюшоне. Охладить на RT. Добавить 1 М гидроксида натрия, пока раствор не станет ясным (рН 7,2-7,4). Хранить при 4 градусов по Цельсию в течение 1 недели.
   Примечание: PFA является токсичным; всегда носите адекватное средства индивидуальной защиты и подготовить в химическом капюшоне.
3. Подготовка 500 МЛ культуры средств массовой информации, DMEM (Dulbecco в модифицированной иглы среды) содержащие 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, и 2% глутамина.
4. Приготовьте 13 мл 1% желатинового раствора в стерильном dH₂O (130 мг желатина в 13 мл dH₂O). Используйте 2 мл 1% желатина для каждой хорошо в 6 хорошо пластины. Держите стерильными.
5. Очистите капот ламинарного потока с использованием 70% этанола. Поместите необходимый материал внутри капота ламинарного потока перед началом эксперимента.

2. Культура клеток для окрашивания иммуноцитохимии

1. Оттепель клеток (в данном исследовании C2C12, MEF, NHLF, и фибробласты кожи) с использованием стандартных методов и пластины их в колбе T75 дополнены 10-12 мл подготовленных средств массовой информации. Инкубация при 37 градусах по Цельсию/5% CO₂/90% относительная влажность (RH) до тех пор, пока клетки не достигнут 70% слияния.
2. Удалите клетки из инкубатора и поместите их в капот ламинарного потока. Удалите культурные средства массовой информации и промыть клетки кратко 2x с 1x PBS. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу T75 и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Периодически проверяйте перевернутый микроскоп для мониторинга отслоения клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от клеточной линии и, следовательно, должно быть определено эмпирически.
3. Аккуратно перерасходовать клетки в 10 мл культурных средств массовой информации, трубы тщательно, чтобы создать одну подвеску клетки. При необходимости снова промыть колбу.
4. Поместите подвеску клетки в коническую трубку и центрифугу 5 мл при 200 х г. Декант супернатант, добавить 10 мл культуры средств массовой информации, и осторожно повторно гранулы. Возьмите 20 МКЛ клеточной суспензии и смешайте в соотношении 1:1 с трипан-синим и посчитайте в цитометре по стандартному методу.
5. Поместите один coverslip внутри каждого хорошо 6 хорошо пластины с помощью пинцета. Пальто крышки с желатином, наливая 2 мл в колодцы. Это поможет клеткам прикрепиться к крышкам. Снимите раствор желатина и дайте высохнуть воздухом в течение нескольких минут. Крышки теперь готовы к выращиванию клеток. Немедленно начните культивирование.
6. Семя 100000 фибробластов в каждой хорошо и добавить 2 мл культурных средств массовой информации. Инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию/5% CO₂/90% RH. На данный момент, клетки могут рассматриваться в соответствии с потребностями пользователя. Лечение, чтобы вызвать цилиацию были ранее^{описаны 4,5}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный номер посева зависит от времени удвоения клеток и должен быть определен соответствующим образом.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок in vitro

1. Тепло 4% параформальдегида к RT. Подготовка Пастер пипетки, 1x PBS (RT), контейнер для отходов, 15 МЛ конические трубки, микропипеты (0,5-10 йл, 20-200 МЛ, и 100-1000 йл) и советы. Возьмите клетки из инкубатора и поместите их на скамейку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура окрашивания не должна проводиться в стерильных условиях. Все решения должны быть на RT.
2. Удалите мультимедиа из каждого хорошо. Оставьте крышку внутри колодец. Очень аккуратно мыть клетки 3x с 2 мл 1x PBS. Используя пипетку Pasteur, добавьте 2 мл 4% PFA в каждую колодец, чтобы исправить клетки. Инкубировать в течение 10 минут на RT. Удалить PFA и мыть 3x с 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте достаточный объем, чтобы покрыть весь обложку в инкубационые периоды. Никогда не позволяйте клеткам высохнуть. Никогда не наливайте ни одного из решений непосредственно на крышку.
3. Подготовка 0,5% Triton X-100 в 13 мл 1x PBS 10 мин перед использованием. Добавить 2 мл в каждый колодец. Инкубация в течение 15 мин. Вымойте осторожно 4x с 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Triton X-100 нерастворим в PBS на RT. Нагрейте 0,5% Triton X-100 раствора до 37 градусов по Цельсию в водяной бане, чтобы растворить его.
4. Сыворотка козла оттепели за 5 минут до использования. Разбавить козлиную сыворотку в 1x PBS в соотношении 1:20 в качестве блокирующего раствора. Добавьте 150 йл к каждому крышке и инкубировать в течение 20 минут на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости продлите период блокировки до 60 минут. Не мыть клетки после блокирования с козьей сыворотки.
5. Оттепель первичных антител (т.е. антиацетилированных альфа-тубулин и анти-гамма-тубулин) за 5 минут до использования. Разбавить антитела отдельно в 1x PBS следующим образом: мышь антиацетилированных альфа-тубулин в соотношении 1:800 и кролика анти-гамма тубулин в соотношении 1:300. Удалите блокирующий раствор. Не мыть. Добавьте 150 МКЛ обоих разбавлений антител в крышки и инкубировать в течение 60 мин на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если инкубация на ночь использовать 500-1000 йл первичных антител решений, печать 6 хорошо пластины с парафиновой пленкой, и хранить при 4 градусов по Цельсию. Кроме того, используйте 150 МКЛ антител и инкубировать в камере влажности.
6. Удалите первичные антитела. Вымойте крышки очень мягко 3x с 2 мл 1x PBS. Подготовка вторичных антител в 1x PBS путем отдельного разбавления Cy3 овец анти-мышь и Alexa Fluor488 коза анти-кролик в соотношении 1:300. Добавьте 150 йл обоих вторичных разбавлений антител к крышкам. Инкубировать в течение 45 минут на RT в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать в темноте, чтобы избежать фотоотбивания. Другие комбинации вторичных антител могут быть использованы по мере необходимости.
7. Подготовка решения DAPI (4', 6-diamidino-2-фенилиндол) в соответствии с инструкциями производителя. Храните лишние aliquots при -20 градусов по Цельсию. Разбавить 10 йл от акции aliquot (1:5,000) в 50 мл 1x PBS. Добавьте 2 мл этого разбавления в крышки. Инкубировать в течение 5 минут на RT в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно инкубировать клетки в темноте, чтобы избежать фотоотбивания. Разбавление DAPI может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.
8. Подготовьте 2 иглы, слайды, пинцет и монтажные средства массовой информации. Наклеить ярлык слайдов.
9. Удалите раствор DAPI из скважин. Вымойте 3x с 1x PBS. Положите одну каплю монтажных средств массовой информации на каждом слайде. Используйте иглу, чтобы аккуратно поднять крышку со дна хорошо. Переверните крышку с помощью пинцета и аккуратно поместите его над каплей монтажа мультимедиа. Аккуратно удалите пузырьки.
10. Защитите горки от света и храните их на ночь при 4 градусах Цельсия.
11. Используйте флуоресцентный или конфокальный микроскоп с высоким увеличением, чтобы визуализировать первичные реснички.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут храниться в темное время суток при 4 градусов по Цельсию в течение 2 месяцев.

Результаты

Иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок является относительно простой процедурой, которая приводит к высококачественным изображениям. В этих экспериментах фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцен...

Обсуждение

Некоторые авторы описали различные методы обнаружения первичных ресничок, иногда также описывая различные методы фиксации, которые могут повлиять на их обнаружение^6,,20,,21,22. Несмотря на это, трудно найти полный и прос...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco