Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Primäre Zilien sind extrazelluläre Strukturen, die mit dem Centriole verbunden sind. Der primäre Ziliennachweis durch immunfluoreszierende Färbung ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu extrem hochwertigen Bildern führt. In diesem Protokoll wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop abgebildet.

Zusammenfassung

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusfortschritts dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen des Zellzyklus, die vor der Mitose resoorbiert werden. Primäre Zilien können mit hochentwickelten Methoden visualisiert werden, einschließlich Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung oder mit Software zur automatischen Detektion von Primärzilien. Jedoch, immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist erforderlich, um diese Methoden durchzuführen. Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur einfachen Detektion von primären Zilien in vitro durch Färbung von acetyliertem Alpha-Tubulin (Axonem) und Gamma-Tubulin (Basalkörper). Dieses immunfluoreszierende Färbeprotokoll ist relativ einfach und führt zu qualitativ hochwertigen Bildern. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie vier Zelllinien (C2C12, MEF, NHLF und Hautfibroblasten), die primäre Zilien exdrücken, mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop fixiert, immungefärbt und abgebildet wurden.

Einleitung

Primäre Zilien sind sensorische, einsame, membrangebundene, nichtmotile Strukturen, die mit dem Mutterzenriole der Zelle assoziiert sind. Primäre Zilien sind auf den meisten Wirbeltierzellen mit Ausnahme von roten Blutkörperchen, Adipozyten¹und Hepatozyten²gefunden. Primäre Zilien werden als läntiges Axonem gebildet, das aus Mikrotubuli besteht, deren Hauptbestandteil das -Tubulin ist. Das Axonem wächst aus dem Basalkörper, der aus dem Tubulin strukturiert ist. Die Länge der primären Zilien variiert zwischen 2–10 m; jedoch können sich seine Abmessungen während der Glykolation, des Hungers, der Hypoxie, des zytotoxischen Stresses oder nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung^{ändern 3,4,5,6,7}. In der Regel haben Zellen nur ein primäres Cilium, das an Morphogenese und Zellsignalbahnen beteiligt ist, die für die Zellproliferation und -differenzierung wichtig sind^8,9.

Primäre Zilien werden während des Zellzyklusverlaufs dynamisch reguliert, insbesondere während der G0/G1-Phasen, und vor dem Eintritt in die Mitose in einem Prozess im Zusammenhang mit der Tubulin-Deacetylierung, die durch HDAC6 (Histondeacetylase 6)¹⁰vermittelt wird, resosorbiert. Das genaue Moment der primären Zilienresorption hängt vom Zelltyp und der Expression von Genen ab, die direkt an diesem Prozess beteiligt sind, wie Aurora A, Plk1, TcTex-11^11,12,13. Je nach Zelltyp exprimieren die primären Zilien verschiedene Arten von Rezeptoren, Ionenkanälen und aktiven Signalsignalen. Dazu gehören die wichtigsten Signalrezeptoren, die Proliferation und Überleben beeinflussen, EGFR, PDGFR, und FGFR. Ebenfalls enthalten sind einige der Signalwege, die die Funktion eines oder mehrerer Organe beeinflussen können, einschließlich Igel, Kerb, und Wnt. Dank dieser Rezeptoren und Signalwege, die primäre Zilien führen auch eine chemosensorische Funktion. Diese Funktion ermöglicht primäre Zilien, spezifische Liganden für Kerbe, Hormone und biologisch aktive Substanzen wie Serotonin oder Somatostatin zu erkennen. Andere spezifische Funktionen, die von primären Zilien unterschiedlicher Länge gezeigt werden, sind die Reaktion auf Temperatur-, Schwerkraft- und Osmolalitätsänderungen¹⁴.

Primäre Zilien können durch verschiedene Methoden visualisiert werden, wie Live-Visualisierung, Transmissionselektronenmikroskopie, 3D-Bildgebung, oder durch Software für die automatische Detektion von primären Zilien^5,15,16,17. Diese Methoden sind jedoch hochspezialisierte und laufende Forschung braucht grundlegende, schnelle und einfache Methoden für die Färbung primäre Zilien in jeder Phase der Forschung. Beschrieben ist eine einfache und nützliche Methode zum Nachweis von primären Zilien in kultivierten Zellen.

Protokoll

1. Zubereitung von Kulturmedien, Lösungen und Gerichten

1. Autoclave die Abdeckungen (22 x 22 mm). Bereiten Sie 6 Brunnenplatten vor. Fetales Rinderserum (FBS) und Antibiotikum Penicillin/Streptomycin auftauen und das Kulturmedium auf Raumtemperatur (RT) erwärmen. Trypsin-EDTA verwenden (0,25%) und 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline mit Kalzium und Magnesium) um die Zellen zu durchführen.
2. Frisches 4% Paraformaldehyd (PFA) in dH₂O (800 mg PFA in 20 ml dH₂O) zubereiten. Die PFA muss für jedes Experiment frisch vorbereitet werden. Die Lösung bei 55 °C 30 min in der Haube umrühren und erhitzen. Abkühlen bei RT. 1 M Natriumhydroxid hinzufügen, bis die Lösung klar wird (pH = 7.2–7.4). Bei 4 °C bis zu 1 Woche lagern.
   Hinweis: PFA ist giftig; tragen Sie immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung und bereiten Sie sich in der chemischen Kapuze vor.
3. Bereiten Sie 500 ml Kulturmedien, DMEM (Dulbecco es Modified Eagle es Medium) mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin und 2% Glutamin vor.
4. Bereiten Sie 13 ml 1% Gelatinelösung in steriler dH₂O (130 mg Gelatine in 13 ml dH₂O) vor. Verwenden Sie 2 ml 1% Gelatine für jeden Brunnen in einer 6-Well-Platte. Steril halten.
5. Reinigen Sie die laminare Durchflusshaube mit 70% Ethanol. Legen Sie das benötigte Material in die laminare Durchflusshaube, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.

2. Zellkultur für immunzytochemische Färbung

1. Tauen Sie die Zellen (in dieser Studie C2C12, MEF, NHLF, und Haut-Fibroblasten) mit Standard-Techniken und Platte sie in einem T75-Kolben mit 10-12 ml der vorbereiteten Medien ergänzt. Inkubieren Sie bei 37 °C/5% CO₂/90% relative Luftfeuchtigkeit (RH), bis die Zellen 70% Zusammenfluss erreichen.
2. Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie in die laminare Strömungshaube. Entfernen Sie die Kulturmedien und spülen Sie die Zellen kurz 2x mit 1x PBS. Fügen Sie dem T75-Kolben 2 ml von 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und brüten bei 37 °C für 5 min. Überprüfen Sie regelmäßig das invertierte Mikroskop, um die Zellablösung zu überwachen.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit hängt von der Zelllinie ab und muss daher empirisch bestimmt werden.
3. Setzen Sie die Zellen in 10 ml Kulturmedien vorsichtig wieder aus, indem Sie sorgfältig pipetieren, um eine einzelzellige Suspension zu erstellen. Spülen Sie den Kolben bei Bedarf erneut aus.
4. Legen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml konisches Rohr und eine Zentrifuge für 5 min bei 200 x g. Dekantieren Sie den Überstand, fügen Sie 10 ml Kulturmedien hinzu, und setzen Sie das Pellet vorsichtig wieder auf. Nehmen Sie 20 l der Zellsuspension und mischen Sie im Verhältnis 1:1 mit Trypan blau und zählen Sie in einem Zytometer nach der Standardmethode.
5. Legen Sie einen Deckelrutsch in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit pinzytte. Mantel Sie die Abdeckungen mit Gelatine, indem Sie 2 ml in die Brunnen gießen. Dies wird den Zellen helfen, sich an die Abdeckungen anzuheften. Entfernen Sie die Gelatinelösung und lassen Sie die Luft für ein paar Minuten trocknen. Die Abdeckungen sind nun bereit für die Kultivierung der Zellen. Beginnen Sie sofort mit dem Anbau.
6. Samen 100.000 Fibroblasten in jedem Brunnen und fügen Sie 2 ml Kulturmedien. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C/5% CO₂/90% RH. An diesem Punkt können die Zellen entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers behandelt werden. Behandlungen zur Verzierung von Ziliarziation wurden zuvor beschrieben^4,5.
   HINWEIS: Die anfängliche Saatnummer hängt von der Verdoppelungszeit der Zellen ab und sollte entsprechend bestimmt werden.

3. Immunfluoreszenzfärbung der primären Zilien in vitro

1. Erwärmen Sie das 4% Paraformaldehyd auf RT. Bereiten Pasteur Pipetten, 1x PBS (RT), Abfallbehälter, 15 ml konische Rohre, Mikropipetten (0,5–10 l, 20–200 l und 100–1.000 l) und Spitzen vor. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und legen Sie sie auf die Bank.
   HINWEIS: Das Färbeverfahren muss nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle Lösungen müssen bei RT sein.
2. Entfernen Sie Medien aus jedem Brunnen. Lassen Sie den Deckel im Inneren des Brunnens. Waschen Sie die Zellen sehr schonend 3x mit 2 ml 1x PBS. Mit einer Pasteur Pipette, fügen Sie 2 ml von 4% PFA in jedem Brunnen, um die Zellen zu fixieren. 10 min bei RT inkubieren. PFA entfernen und 3x mit 1x PBS waschen.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer ein ausreichendes Volumen, um den gesamten Coverslip während der Inkubationszeiten abzudecken. Lassen Sie die Zellen niemals trocknen. Gießen Sie niemals eine der Lösungen direkt auf den Deckel.
3. Bereiten Sie 0,5% Triton X-100 in 13 ml 1x PBS 10 min vor Gebrauch vor. Fügen Sie 2 ml in jeden Brunnen. 15 min inkubieren. 4x mit 1x PBS vorsichtig waschen.
   HINWEIS: Triton X-100 ist in PBS bei RT unlöslich. Erhitzen Sie die 0,5% Triton X-100 Lösung auf 37 °C in einem Wasserbad, um sie aufzulösen.
4. Ziege Serum vor Gebrauch auftauen 5 min. Verdünnen Sie das Ziegenserum in 1x PBS im Verhältnis 1:20 als Sperrlösung. Fügen Sie 150 L zu jedem Coverslip hinzu und brüten Sie 20 min bei RT.
   HINWEIS: Verlängern Sie die Sperrzeit bei Bedarf um bis zu 60 min. Waschen Sie die Zellen nach der Blockierung nicht mit Ziegenserum.
5. Die primären Antikörper (d. h. Anti-Acetylat-Alpha-Tubulin und Anti-Gamma-Tubulin) 5 min vor Gebrauch auftauen. Verdünnen Sie die Antikörper separat in 1x PBS wie folgt: Maus Anti-Acetyliertes Alpha-Tubulin im Verhältnis 1:800 und Kaninchen-Anti-Gamma-Tubulin im Verhältnis 1:300. Entfernen Sie die Blockierungslösung. Nicht waschen. Fügen Sie 150 l beider Antikörperverdünnungen zu den Abdeckungen hinzu und brüten Sie 60 min bei RT.
   HINWEIS: Wenn Sie über Nacht 500–1.000 l der primären Antikörperlösungen inkubieren, versiegeln Sie die 6 Well-Platte mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bei 4 °C. Alternativ können Sie 150 l Antikörper verwenden und in einer Feuchtigkeitskammer brüten.
6. Entfernen Sie die primären Antikörper. Waschen Sie die Abdeckungen sehr vorsichtig 3x mit 2 ml 1x PBS. Bereiten Sie die sekundären Antikörper in 1x PBS durch getrennte Verdünnung Cy3 Schafe Anti-Maus und Alexa Fluor488 Ziege Anti-Kaninchen in einem Verhältnis von 1:300. Fügen Sie den Abdeckungen 150 l der beiden sekundären Antikörperverdünnungen hinzu. 45 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Inkubieren Sie im Dunkeln, um Photobleichungen zu vermeiden. Andere Kombinationen von sekundären Antikörpern können bei Bedarf verwendet werden.
7. Bereiten Sie eine DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Bewahren Sie die überschüssigen Aliquots bei -20 °C auf. Verdünnen Sie 10 l aus einem Lager-Aliquot (1:5.000) in 50 ml 1x PBS. Fügen Sie 2 ml dieser Verdünnung zu den Abdeckungen hinzu. Inkubieren Sie für 5 min bei RT im Dunkeln.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen im Dunkeln zu inkubieren, um Photobleichungen zu vermeiden. Die DAPI-Verdünnung kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
8. Bereiten Sie 2 Nadeln, Dias, Pinzetten und Montagemedien vor. Beschriften Sie die Folien.
9. Entfernen Sie die DAPI-Lösung aus den Brunnen. Waschen Sie 3x mit 1x PBS. Legen Sie einen Tropfen Montagemedien auf jede Folie. Verwenden Sie die Nadel, um den Deckelrutsch sanft vom Boden des Brunnens zu heben. Drehen Sie den Coverslip mit der Pinzette und legen Sie ihn vorsichtig über den Tropfen der Montagemedien. Entfernen Sie vorsichtig alle Blasen.
10. Schützen Sie die Dias vor Licht und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C.
11. Verwenden Sie ein fluoreszierendes oder konfokales Mikroskop mit hoher Vergrößerung, um die primäre Zilien zu visualisieren.
    HINWEIS: Die Dias können bis zu 2 Monate bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

Ergebnisse

Die immunfluoreszierende Färbung der primären Zilien ist ein relativ einfaches Verfahren, das zu qualitativ hochwertigen Bildern führt. In diesen Experimenten wurden Fibroblasten, die primäre Zilien exdrücken, fixiert, immungefärbt und in einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop nach dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Das primäre Cilium wurde mit Acetylat-Tubulin und -Tubulin nachgewiesen. Die Bewertung der primären Zilien kann auf verschiedenen Ebenen durchgeführt werden und jede Änderung in ...

Diskussion

Mehrere Autoren haben verschiedene Methoden für den Nachweis von primären Zilien beschrieben, manchmal auch verschiedene Fixierungsmethoden beschreiben, die ihre Erkennung beeinflussen können^6,20,21,22. Unabhängig davon ist es schwierig, ein vollständiges und einfaches Protokoll für die Erkennung zu finden. Die Verfügbarkeit einer solchen Methode wäre zweifellos eine große Hilfe für d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco