면역 형광에 의한 1 차 적인 섬모의 간단한 검출

요약

1 차적인 섬모는 센티미터와 관련되었던 세포 외 구조물입니다. 면역 형광 염색에 의한 1 차 적인 섬모 검출은 매우 높은 품질의 심상을 초래하는 비교적 간단한 절차입니다. 이 프로토콜에서, 1 차적인 섬모를 표현하는 섬유아세포는 형광 또는 공초점 현미경으로 고정되고, 면역 염색되고, 심상화되었습니다.

초록

1 차 적인 섬모는 세포 주기 진행 도중 동적으로 통제됩니다, 특히 세포 주기의 G0/G1 단계 도중, 미토시스의 앞에 resorbed되고. 1 차 섬모는 전송 전자 현미경 검사법, 3D 이미징, 또는 1 차 섬모의 자동 검출을 위한 소프트웨어를 사용하는 것을 포함하여 고도로 정교한 방법으로 시각화될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 수행하기 위해서는 1차 섬모의 면역형성 염색이 필요하다. 이 간행물은 아세틸화 알파 튜룰린 (axoneme)과 감마 튜룰린 (기저 몸)을 염색하여 체외에서 1 차 섬모를 쉽게 검출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 면역 형광 염색 프로토콜은 비교적 간단하고 고품질의 이미지를 초래합니다. 본 프로토콜은 1차 섬모를 발현하는 4개의 세포주(C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)가 어떻게 고정되고 면역염색되고 형광 또는 공초점 현미경으로 이미지되었는지를 설명합니다.

서문

1 차 적인 섬모는 세포의 어머니 중심과 관련 되 었던 감각, 독방, 막 바인딩, 비 momotile 구조. 1 차 섬모는 적혈구, 백혈구^1,및 간세포^2를제외한 대부분의 척추 동물 세포에서 발견된다. 1차 섬모는 마이크로튜부에 의해 구성된 길쭉한 축소메로 형성되며, 그 주요 성분은 α-tubulin이다. 축 사 메는 기저체에서 성장, 이는 γ-tubulin에서 구조화. 기본 섬모의 길이는 2-10 μm 사이다릅니다. 그러나, 그 치수는 글리시션, 기아, 저산소증, 세포독성 스트레스, 또는 이온화 방사선^{3,,4,,5,,6,,7에}노출 된 후 변경 될 수 있습니다. 일반적으로, 세포는 세포 증식 및 분화^8,,9에중요한 형태 발생 및 세포 신호 경로에 관여하는 단 하나의 1 차실을 갖는다.

1차 섬모는 세포 주기 진행 중에, 특히 G0/G1 단계 동안 동적으로 조절되며, HDAC6(히스톤 deacetylase 6)^10에의해 매개되는 튜룰린 탈염과 관련된 과정에서 미토시스를 입력하기 전에 재조판된다. 1차 섬모 재흡수의 정확한 순간은 오로라 A, Plk1, TcTex-1 11,^1112,13과같은 이 과정에 직접 관여하는 유전자의 세포 유형 및 발현에 따라 달라집니다.^,, 세포 유형에 따라, 1 차 적인 섬모는 수용체의 다른 모형을 표현합니다, 이온 채널, 및 액티브 신호 통로. 이들은 증식및 생존에 영향을 미치는 가장 중요한 신호 수용체를 포함, EGFR, PDGFR, 및 FGFR. 또한 고슴도치, 노치 및 Wnt. 이러한 수용체 및 신호 경로 덕분에 하나 이상의 장기의 기능에 영향을 줄 수 있는 신호 경로 중 일부가 포함되어 있으며, 1차 섬모는 또한 화학 감각 기능을 수행합니다. 이 기능을 통해 1 차 적인 섬모 는 노치에 대 한 특정 리간드를 감지 할 수 있습니다., 호르몬, 그리고 세로토닌 또는 somatostatin 같은 생물학적 활성 물질. 다른 길이의 기본 섬모에 의해 전시 된 다른 특정 기능은 온도, 중력 및 진동^(14)의변화에 대한 반응을 포함한다.

1차 섬모는 라이브 시각화, 전송 전자 현미경, 3D 이미징, 또는 1차^,섬모5,^{15,,5,16,17의}자동 검출을 위한 소프트웨어에 의해 다양한 방법을 통해 시각화될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 고도로 전문화 하 고 지속적인 연구 연구의 모든 단계에서 기본, 신속 하 고 쉬운 방법을 필요. 기재된 배양된 세포에서 1차 섬모를 검출하기 위한 쉽고 유용한 방법이기 다.

프로토콜

1. 문화 매체, 솔루션 및 요리 준비

1. 커버립(22 x 22mm)을 자동 클래브합니다. 6 개의 잘 접시를 준비하십시오. 태아 소 혈청 (FBS) 및 항생제 페니실린 / 연쇄 절제술을 하고 문체 배지를 실온 (RT)으로 따뜻하게합니다. 트립신-EDTA 사용 (0.25%) 및 1x PBS (칼슘과 마그네슘을 곁들인 인산염 완충식식염)이 세포를 통과한다.
2. dH₂O (800 mg의 PFA 에서 dH₂O)로 신선한 4 % 파라 포름알데히드 (PFA)를 준비하십시오. PFA는 각 실험에 대해 신선하게 준비해야 합니다. 후드에서 30 분 동안 55 °C에서 용액을 저어 가열합니다. RT에서 냉각하십시오. 용액이 명확해질 때까지 1M 수산화 나트륨을 추가하십시오(pH = 7.2-7.4). 최대 1 주일 동안 4 °C에 보관하십시오.
   참고: PFA는 독성; 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 화학 후드에 준비합니다.
3. 문화 매체 500mL, DMEM(덜벡코의 수정 독수리 매체)은 10% FBS, 1% 페니실린/연쇄절제술, 글루타민 2%를 함유하고 있습니다.
4. 멸균 dH₂O (130 mg의 젤라틴 130 mg dH₂O)로 13 mL의 젤라틴 용액13 mL을 준비하십시오. 6 웰 플레이트에 각 웰마다 1 % 젤라틴 2 mL을 사용합니다. 멸균을 유지합니다.
5. 70% 에탄올을 사용하여 라미나르 플로우 후드를 청소하십시오. 실험을 시작하기 전에 라미나르 흐름 후드 내부에 필요한 재료를 배치합니다.

2. 면역 세포 화학 염색을위한 세포 배양

1. 표준 기술을 사용하여 세포(본 연구에서 C2C12, MEF, NHLF 및 피부 섬유아세포)를 해동하고 준비된 매체의 ~10-12mL로 보충된 T75 플라스크에서 이를 플레이트한다. 세포가 70%에 도달할 때까지₂37°C/5% CO 2/90%의 상대 습도(RH)에서 배양한다.
2. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 라미나르 흐름 후드에 배치합니다. 배양 매체를 제거하고 1x PBS로 세포를 2배 짧게 헹구는 다. T75 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA의 ~2mL를 넣고 ~5분 동안 37°C에서 배양한다. 세포 분리를 모니터링하기 위해 반전 된 현미경에 주기적으로 확인하십시오.
   참고: 잠복기 시간은 세포주에 따라 다르므로 경험적으로 결정되어야 합니다.
3. 10mL의 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재봉, 조심스럽게 파이펫팅하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 필요한 경우 플라스크를 다시 헹구십시오.
4. 셀 서스펜션을 50mL 원심관과 원심분리기를 ~200 x g에서 5분 동안 배치합니다. 상류제를 데칭하고, 문화 매체의 10mL를 추가하고, 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 셀 서스펜션의 20 μL을 복용하고 1:1 비율로 트립팬 블루와 혼합하고 표준 방법에 따라 사이토미터에 세십시오.
5. 핀셋을 사용하여 6 웰 플레이트의 각 웰 안에 하나의 커버 슬립을 놓습니다. 웰에 ~ 2 mL을 부어 젤라틴으로 커버립을 코팅합니다. 이렇게 하면 세포가 커버립에 부착하는 데 도움이 됩니다. 젤라틴 용액을 제거하고 몇 분 동안 공기 건조하게하십시오. 커버립은 이제 세포의 재배를 위한 준비가 되었습니다. 즉시 재배를 시작합니다.
6. 각 우물에 100,000 섬유 아세포를 씨앗과 문화 매체의 2 mL을 추가합니다. 37°C/5% CO 2/90% RH에서₂24시간 동안 세포를 배양한다. 이 시점에서, 세포는 사용자의 요구에 따라 처리될 수 있다. 섬모를 유도하는 치료법은 이전에^4,,5로기술되었다.
   참고: 초기 시드 번호는 셀의 두 배 시간에 따라 달라지며 그에 따라 결정되어야 합니다.

3. 체외에서 1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색

1. RT에 4% 파라포름알데히드를 따뜻하게 하십시오. 파스퇴르 파이펫, 1x PBS(RT), 폐기물 용기, 15mL 원문 관, 마이크로파이프(0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1,000 μL) 및 팁. 인큐베이터에서 세포를 가져 와서 벤치에 놓습니다.
   참고: 염색 절차는 멸균 조건에서 수행 될 필요가 없습니다. 모든 솔루션은 RT에 있어야 합니다.
2. 각 우물에서 미디어를 제거합니다. 커버슬립을 우물 안에 둡니다. 매우 부드럽게 1 x PBS의 2 mL로 셀 3 x를 씻으십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 웰에 4% PFA의 2mL을 추가하여 세포를 수정합니다. RT에서 10분 동안 배양하십시오. PFA를 제거하고 1배 PBS로 3배 세척합니다.
   참고: 항상 충분한 볼륨을 사용하여 인큐베이션 기간 동안 전체 커버슬립을 덮습니다. 세포를 건조시키지 마십시오. 커버슬립에 직접 솔루션을 붓지 마십시오.
3. 사용하기 10분 전에 13mL로 0.5% 트리톤 X-100을 준비한다. 각 웰에 2mL를 추가합니다. 15분 동안 배양합니다. 1x PBS로 부드럽게 4배 세탁하십시오.
   참고: Triton X-100은 RT에서 PBS에서 불용성입니다.
4. 사용 5 분 전에 염소 세럼을 해동하십시오. 염소 세럼을 블로킹 솔루션으로 1:20 비율로 1x PBS로 희석합니다. 각 커버슬립에 150 μL을 추가하고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
   참고: 필요한 경우 차단 기간을 최대 60분까지 연장합니다. 염소 세럼으로 차단 한 후 세포를 씻지 마십시오.
5. 1 차 적인 항체를 해동 (즉, 안티 아세틸화 알파 tubulin 및 항 감마 tubulin) 5 분 사용 전에. 1x PBS에서 항체를 1:800 비율로 마우스 안티 아세틸화 알파 튜룰린과 토끼 항감마 튜룰린을 1:300 비율로 희석시킨다. 차단 솔루션을 제거합니다. 씻지 마십시오. 커버립에 항체 희석제 150μL을 넣고 RT에서 60분 동안 배양합니다.
   참고: 1차 항체 용액의 500-1,000 μL을 하룻밤 동안 배양하는 경우 파라핀 필름으로 6웰 플레이트를 밀봉하고 4°C에 보관하십시오. 또는, 150 μL의 항체를 사용하고 습도 챔버에서 배양한다.
6. 1 차적인 항체를 제거합니다. 1x PBS 2mL로 커버립을 3x매우 부드럽게 씻으십시오. Cy3 양 항마우스와 알렉사 플루오488 염소 항토끼를 1:300 비율로 희석하여 1x PBS에서 이차 항체를 준비한다. 커버립에 이차 항체 희석제 150 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 45 분 동안 배양하십시오.
   참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 배양하십시오. 이차 항체의 그밖 조합은 필요에 따라 이용될 수 있습니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 DAPI(4', 6-디아미드노-2-페닐린돌) 솔루션을 준비합니다. -20°C에 초과 알리쿼트를 저장합니다. 1x PBS의 50mL에서 주식 알리쿼트(1:5,000)에서 10 μL을 희석시희석한다. 커버립에 이 희석 2mL를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
   참고: 광표백을 피하기 위해 어둠 속에서 세포를 배양하는 것이 중요합니다. DAPI 희석은 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
8. 2 개의 바늘, 슬라이드, 핀셋 및 장착 미디어를 준비합니다. 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
9. 우물에서 DAPI 솔루션을 제거합니다. 1x PBS로 3배 세척합니다. 각 슬라이드에 마운팅 미디어를 한 방울 만 넣습니다. 바늘을 사용하여 우물 바닥에서 커버슬립을 부드럽게 들어 올립니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립을 뒤집어 마운팅 미디어를 부드럽게 놓습니다. 조심스럽게 거품을 제거합니다.
10. 슬라이드를 빛으로부터 보호하고 4 °C에서 밤새 보관하십시오.
11. 높은 배율로 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 1 차 적인 섬모를 시각화하십시오.
    참고: 슬라이드는 최대 2개월 동안 4°C의 어둠 속에서 저장할 수 있습니다.

결과

1 차 적인 섬모의 면역 형광 염색은 고품질 심상을 초래하는 상대적으로 간단한 절차입니다. 이러한 실험에서, 1차 섬모를 발현하는 섬유아세포는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 형광 또는 공초점 현미경으로 고정, 면역염색, 이미지화되었다. 1차 실륨은 아세틸화된 α-tubulin 및 γ-tubulin을 사용하여 검출되었다. 1차 섬모의 평가는 다양한 수준에서 수행될 수 있으며 이와 관련하여 임의의 변화는 ?...

토론

몇몇 저자는 1 차적인 섬모의 검출을 위한 다양한 방법을 기술했습니다, 때때로⁶또한 그들의 검출^{6,20,,21,,22에}영향을 미칠 수 있는 각종 고정 방법을 기술합니다. 에 관계없이 탐지를 위한 완전하고 간단한 프로토콜을 찾기가 어렵습니다. 이러한 방법의 준비 가용성은 의심 할 여지없이 1 차 섬모 조사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco