Detección simple de cilios primarios por inmunofluorescencia

Resumen

Los cilios primarios son estructuras extracelulares asociadas con el centriolo. La detección de cilios primarios por tinción inmunofluorescente es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de muy alta calidad. En este protocolo, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunosutenidos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal.

Resumen

Los cilios primarios se regulan dinámicamente durante la progresión del ciclo celular, específicamente durante las fases G0/G1 del ciclo celular, siendo reabsorbidos antes de la mitosis. Los cilios primarios se pueden visualizar con métodos altamente sofisticados, incluyendo microscopía electrónica de transmisión, imágenes 3D o el uso de software para la detección automática de cilios primarios. Sin embargo, la tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es necesaria para realizar estos métodos. Esta publicación describe un protocolo para la fácil detección de cilios primarios in vitro mediante la tinción de la tubulina alfa acetilada (axoneme) y la tubulina gamma (cuerpo basal). Este protocolo de tinción inmunofluorescente es relativamente simple y da como resultado imágenes de alta calidad. El presente protocolo describe cómo cuatro líneas celulares (C2C12, MEF, NHLF y fibroblastos cutáneos) que expresaban cilios primarios fueron fijadas, inmunotendadas e imágenes con un microscopio fluorescente o confocal.

Introducción

Los cilios primarios son estructuras sensoriales, solitarias, ligadas a la membrana y no móviles asociadas con el centriole maternés de la célula. Los cilios primarios se encuentran en la mayoría de las células vertebradas con la excepción de los glóbulos rojos, adipocitos¹y hepatocitos^2. Los cilios primarios se forman como un axonemo alargado compuesto por microtúbulos, cuyo componente principal es la tubulina. El axonemo crece a partir del cuerpo basal, que está estructurado a partir de la tubulina. La longitud de los cilios primarios varía entre 2–10 m; sin embargo, sus dimensiones pueden cambiar durante la glicación, inanición, hipoxia, estrés citotóxico, o después de la exposición a la radiación ionizante^3,4,5,6,7. Por lo general, las células tienen sólo un cilium primario, que participa en la morfogénesis y las vías de señalización celular importantes para la proliferación celular y la diferenciación^8,9.

Los cilios primarios se regulan dinámicamente durante la progresión del ciclo celular, específicamente durante las fases G0/G1, y se reabsorben antes de entrar en la mitosis en un proceso asociado con la deacetilación de la tubulina mediada por HDAC6 (histona deacetilasa 6)¹⁰. El momento exacto de la resorción primaria de los cilios depende del tipo de célula y de la expresión de genes directamente implicados en este proceso, como Aurora A, Plk1, TcTex-1^11,12,,13. Dependiendo del tipo de célula, los cilios primarios expresan diferentes tipos de receptores, canales iónicos y vías de señalización activas. Estos incluyen los receptores de señalización más importantes que afectan a la proliferación y supervivencia, EGFR, PDGFR, y FGFR. También se incluyen algunas de las vías de señalización que pueden afectar la función de uno o más órganos, incluyendo erizo, muesca, y Wnt. Gracias a estos receptores y vías de señalización, los cilios primarios también realizan una función quimiosensorial. Esta función permite a los cilios primarios detectar ligandos específicos para la muesca, hormonas, y sustancias biológicamente activas como la serotonina o somatostatina. Otras funciones específicas exhibidas por cilios primarios de diferentes longitudes incluyen la reacción a los cambios de temperatura, gravedad y osmolalidad¹⁴.

Los cilios primarios se pueden visualizar a través de diversos métodos, como la visualización en vivo, la microscopía electrónica de transmisión, la imagen 3D o por software para la detección automática de cilios primarios^{5,,15,,16,,17.} Sin embargo, estos métodos son métodos de investigación altamente especializados y continuos para los métodos básicos, rápidos y fáciles para tinr a los cilios primarios en cada etapa de la investigación. Descrito es un método fácil y útil para la detección de cilios primarios en células cultivadas.

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, soluciones y platos

1. Autoclave los cubreobjetos (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de pozo. Descongelar el suero bovino fetal (FBS) y la penicilina/estreptomicina antibiótica y calentar el cultivo a temperatura media a ambiente (RT). Usar trypsin-EDTA (0,25%) y 1x PBS (solución salina tamponada de fosfato con calcio y magnesio) para pasar las células.
2. Preparar paraformaldehído fresco 4% (PFA) en dH₂O (800 mg de PFA en 20 ml de dH₂O). El PFA debe estar recién preparado para cada experimento. Revuelva y caliente la solución a 55 oC durante 30 minutos en el capó. Enfríe a RT. Añadir 1 M de hidróxido de sodio hasta que la solución quede clara (pH a 7,2–7,4). Conservar a 4oC durante un máximo de 1 semana.
   Nota: PFA es tóxico; siempre llevar equipo de protección personal adecuado y prepararse en la capucha química.
3. Preparar 500 ml de medios de cultivo, DMEM (medio de águila modificada de Dulbecco) que contiene 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, y 2% glutamina.
4. Preparar 13 ml de solución de gelatina al 1% en dH estéril₂O (130 mg de gelatina en 13 ml de dH₂O). Utilice 2 ml de gelatina al 1% para cada pozo en un plato de 6 pozos. Manténgase estéril.
5. Limpie la campana de flujo laminar con 70% de etanol. Coloque el material necesario dentro de la campana de flujo laminar antes de iniciar el experimento.

2. Cultivo celular para la tinción de inmunocitoquímica

1. Descongelar las células (en este estudio C2C12, MEF, NHLF y fibroblastos de la piel) utilizando técnicas estándar y placarlas en un matraz T75 complementado con 10-12 ml de los medios preparados. Incubar a 37oC/5% co₂/90% de humedad relativa (RH) hasta que las células alcancen el 70% de confluencia.
2. Retire las células de la incubadora y colóquelas en la campana de flujo laminar. Retire el medio de cultivo y enjuague brevemente las células 2 veces con 1x PBS. Añadir 2 ml de 0,25% de trippsina-EDTA en el matraz T75 e incubar a 37 oC durante 5 min. Compruebe periódicamente el microscopio invertido para monitorear el desprendimiento celular.
   NOTA: El tiempo de incubación depende de la línea celular y, por lo tanto, debe determinarse empíricamente.
3. Resuspender suavemente las células en 10 ml de medios de cultivo, pipeteando cuidadosamente para crear una suspensión de una sola célula. Enjuague el matraz de nuevo si es necesario.
4. Coloque la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y centrífuga durante 5 min a 200 x g. Decantar el sobrenadante, añadir 10 mL de medios de cultivo, y resuspender suavemente el pellet. Tome 20 l de la suspensión celular y mezcle en una proporción de 1:1 con el azul tripano y cuente en un citómetro siguiendo el método estándar.
5. Coloque un cubreobjetos dentro de cada pozo de una placa de 6 pozos usando pinzas. Recubrir los cubreobjetos con gelatina vertiendo 2 ml en los pozos. Esto ayudará a que las células se adhieran a los cubreobjetos. Retire la solución de gelatina y deje secar al aire durante unos minutos. Los cubreobjetos ya están listos para el cultivo de las células. Comience el cultivo inmediatamente.
6. Sembrar 100.000 fibroblastos en cada pozo y añadir 2 ml de medios de cultivo. Incubar las células durante 24 h a 37oC/5% CO₂/90% RH. En este punto, las celdas se pueden tratar de acuerdo con las necesidades del usuario. Los tratamientos para inducir la ciliación se han descrito previamente^4,5.
   NOTA: El número de siembra inicial depende del tiempo de duplicación de las celdas y debe determinarse en consecuencia.

3. Tinción inmunofluorescente de cilios primarios in vitro

1. Calentar el 4% de paraformaldehído para RT. Preparar pipetas Pasteur, 1x PBS (RT), contenedor de residuos, tubos cónicos de 15 ml, micropipetas (0,5–10 l, 20–200 l y 100–1,000 l) y puntas. Tome las células de la incubadora y colóquelas en el banco.
   NOTA: No es necesario realizar el procedimiento de tinción en condiciones estériles. Todas las soluciones deben estar en RT.
2. Retire los medios de cada pozo. Deje el cubreobjetos dentro del pozo. Lavar muy suavemente las células 3x con 2 ml de 1x PBS. Usando una pipeta Pasteur, agregue 2 mL de 4% de PFA en cada pozo para fijar las células. Incubar durante 10 min en RT. Retire la PFA y lave 3x con 1x PBS.
   NOTA: Utilice siempre un volumen suficiente para cubrir todo el cubreobjetos durante los períodos de incubación. Nunca deje que las células se sequen. Nunca vierta ninguna de las soluciones directamente en el cubreobjetos.
3. Preparar 0.5% Triton X-100 en 13 mL de 1x PBS 10 min antes de su uso. Añadir 2 ml en cada pozo. Incubar durante 15 min. Lavar suavemente 4x con 1x PBS.
   NOTA: Tritón X-100 es insoluble en PBS en RT. Caliente la solución 0.5% Triton X-100 a 37 oC en un baño de agua para disolverlo.
4. Descongelar el suero de cabra 5 min antes de su uso. Diluir el suero de cabra en 1x PBS en una proporción de 1:20 como solución de bloqueo. Añadir 150 l a cada cubreobjetos e incubar durante 20 minutos en RT.
   NOTA: Prolongue el período de bloqueo hasta 60 minutos si es necesario. No lave las células después de bloquearlas con suero de cabra.
5. Descongelar los anticuerpos primarios (es decir, tubulina alfa antiequillada y tubulina anti gamma) 5 minutos antes de su uso. Diluir los anticuerpos por separado en 1x PBS de la siguiente manera: tubulina alfa antiequiltilada de ratón en una proporción de 1:800 y tubulina anti gamma de conejo en una proporción de 1:300. Retire la solución de bloqueo. No lavar. Añadir 150 l de ambas diluciones de anticuerpos a los cubreobjetos e incubar durante 60 minutos en RT.
   NOTA: Si la incubación durante la noche utiliza 500–1,000 l de las soluciones primarias de anticuerpos, selle la placa de 6 pocillos con película de parafina y guárdela a 4oC. Alternativamente, utilice 150 l de anticuerpos e incubar en una cámara de humedad.
6. Retire los anticuerpos primarios. Lavar los cubreobjetos muy suavemente 3x con 2 ml de 1x PBS. Preparar los anticuerpos secundarios en 1x PBS diluyendo por separado Cy3 oveja anti-ratón y Alexa Fluor488 cabra anti-conejo en una proporción de 1:300. Añadir 150 l de ambas diluciones de anticuerpos secundarios a los cubreobjetos. Incubar durante 45 min en RT en la oscuridad.
   NOTA: Incubar en la oscuridad para evitar el fotoblancada. Se pueden utilizar otras combinaciones de anticuerpos secundarios según sea necesario.
7. Prepare una solución DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacene el exceso de alícuotas a -20 oC. Diluir 10 l de una alícuota de stock (1:5.000) en 50 ml de 1x PBS. Añadir 2 ml de esta dilución a los cubreobjetos. Incubar durante 5 minutos en RT en la oscuridad.
   NOTA: Es importante incubar las células en la oscuridad para evitar el fotoblancada. La dilución DAPI se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
8. Prepare 2 agujas, portaobjetos, pinzas y medios de montaje. Etiquete las diapositivas.
9. Retire la solución DAPI de los pozos. Lavar 3x con 1x PBS. Coloque una gota de medios de montaje en cada diapositiva. Utilice la aguja para levantar suavemente el cubreobjetos desde la parte inferior del pozo. Voltee el cubreobjetos con las pinzas y colóquelo suavemente sobre la gota del soporte de montaje. Retire con cuidado las burbujas.
10. Proteja los portaobjetos de la luz y guárdelos durante la noche a 4 oC.
11. Utilice un microscopio fluorescente o confocal con alto aumento para visualizar a los cilios primarios.
    NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar en la oscuridad a 4 oC durante un máximo de 2 meses.

Resultados

La tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de alta calidad. En estos experimentos, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunotuvistedos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El cilium primario se detectó utilizando la tubulina acetilada y la tubulina. La evaluación de los cilios primarios se puede realizar en varios niveles y cualquier cambio en e...

Discusión

Varios autores han descrito diversos métodos para la detección de cilios primarios, a veces también describiendo varios métodos de fijación que pueden afectar a su detección^{6,,20,,21,,22}. A pesar de todo, es difícil encontrar un protocolo completo y directo para la detección. La disponibilidad de tal método sería sin duda de gran ayuda para el estudio de la investigación de cilios pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco