Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Riepilogo

Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.

Abstract

Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.

Introduzione

Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti¹e degli epariti². Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico o dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti^3,4,5,6,7. Di solito, le cellule hanno un solo cilio primario, che è coinvolto nella morfogenesi e nei percorsi di segnalazione cellulare importanti per la proliferazione cellulare e la differenziazione^8,9.

Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1, e riassorbite prima di entrare nella mitosi in un processo associato alla deacetilazione della tubulina mediata da HDAC6 (deacetilase istone 6)¹⁰. Il momento esatto della riassorbimento delle ciglia primarie dipende dal tipo di cellula e dall'espressione dei geni direttamente coinvolti in questo processo, come Aurora A, Plk1, TcTex-1^11,12,13. A seconda del tipo di cellula, le ciglia primarie esprimono diversi tipi di recettori, canali ioni e percorsi di segnalazione attivi. Questi includono i più importanti recettori di segnalazione che influenzano la proliferazione e la sopravvivenza, EGFR, PDGFR, e FGFR. Sono inclusi anche alcuni dei percorsi di segnalazione che possono influenzare la funzione di uno o più organi, tra cui Riccio, Notch, e Wnt. Grazie a questi recettori e vie di segnalazione, le ciglia primarie svolgono anche una funzione chemiosensoriale. Questa funzione consente alle ciglia primarie di rilevare ligand specifici per Notch, ormoni, e sostanze biologicamente attive come serotonina o somatostatina. Altre funzioni specifiche esposte da ciglia primarie di diverse lunghezze includono la reazione ai cambiamenti di temperatura, gravità e osmolalità¹⁴.

Le ciglia primarie possono essere visualizzate attraverso vari metodi, come la visualizzazione dal vivo, la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o il software per il rilevamento automatico delle ciglia^{primarie 5,15,16,17}. Tuttavia, questi metodi sono altamente specializzati e la ricerca in corso ha bisogno di metodi di base, veloci e facili per colorare le ciglia primarie in ogni fase della ricerca. Descritto è un metodo facile e utile per il rilevamento delle ciglia primarie nelle cellule culture.

Protocollo

1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti

1. Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.
2. Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH₂O (800 mg di PFA in 20 mL di dH₂O). Il PFA deve essere preparato per ogni esperimento. Mescolare e riscaldare la soluzione a 55 gradi centigradi per 30 minuti nel cofano. Raffreddare a RT. Aggiungere 1 M di idrossido di sodio fino a quando la soluzione diventa chiara (pH - 7,2–7,4). Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.
   Nota: PFA è tossico; indossare sempre adeguate attrezzature di protezione personale e prepararsi nel cappuccio chimico.
3. Preparare 500 mL di mezzi di coltura, DMEM (mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco) contenente il 10% di FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 2% di glutammina.
4. Preparare 13 mL di soluzione di gelatina dell'1% in dH₂O sterile (130 mg di gelatina in 13 mL di dH₂O). Utilizzare 2 mL di 1% gelatina per ogni pozzo in un piatto 6 bene. Mantenere sterile.
5. Pulire il cofano a flusso laminare con il 70% di etanolo. Posizionare il materiale richiesto all'interno del cofano di flusso laminare prima di iniziare l'esperimento.

2. Coltura cellulare per la colorazione dell'immunocitochimica

1. Scongelare le cellule (in questo studio C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti della pelle) utilizzando tecniche standard e placcarle in una fiaschetta T75 integrata con 10-12 mL dei supporti preparati. Incubare a 37 gradi centigradi/5% di CO₂/90% di umidità relativa (RH) fino a quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza.
2. Rimuovere le cellule dall'incubatrice e posizionarle nel cofano a flusso laminare. Rimuovere i supporti di coltura e risciacquare brevemente le cellule 2x con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di 0,25% di trypsin-EDTA nella fiaschetta T75 e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Controllare periodicamente il microscopio invertito per monitorare il distacco delle cellule.
   NOTA: il tempo di incubazione dipende dalla linea della cella e pertanto deve essere determinato empiricamente.
3. Risundere delicatamente le cellule in 10 mL di supporti di coltura, pipettando con attenzione per creare una sospensione a singola cella. Se necessario, sciacquare nuovamente il pallone.
4. Posizionare la sospensione della cella in un tubo conico di 50 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g. Decantare il supernatant, aggiungere 10 mL di mezzi di coltura, e delicatamente rispendere il pellet. Prendere 20 L della sospensione cellulare e mescolare in un rapporto 1:1 con blu trypan e contare in un citometro seguendo il metodo standard.
5. Mettere un coperture all'interno di ogni pozzo di un piatto 6 ben con una pinzetta. Rivestire le coperture con gelatina versando 2 mL nei pozzetti. Questo aiuterà le celle ad attaccarsi alle coperture. Togliere la soluzione di gelatina e lasciare asciugare l'aria per qualche minuto. Le coperture sono ora pronte per la coltivazione delle cellule. Avviare immediatamente la coltivazione.
6. Semina 100.000 fibroblasti in ogni pozzo e aggiungi 2 mL di media culturali. Incubare le cellule per 24 h a 37 s /5% CO₂/90% RH. A questo punto, le cellule possono essere trattate in base alle esigenze dell'utente. I trattamenti per indurre la ciliazione sono stati descritti in precedenza^4,5.
   NOTA: Il numero di seeding iniziale dipende dal tempo di raddoppio delle celle e deve essere determinato di conseguenza.

3. Colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie in vitro

1. Riscaldare la paraformaldeide del 4% a RT. Preparare le pipette Pasteur, 1x PBS (RT), il contenitore dei rifiuti, i tubi conici da 15 mL, le micropipette (0,5–10 L, 20–200 L e 100–1.000 L) e le punte. Prendi le cellule dall'incubatrice e posizionale nella panca.
   NOTA: La procedura di colorazione non deve essere eseguita in condizioni sterili. Tutte le soluzioni devono essere disponibili in RT.
2. Rimuovere i supporti da ogni pozzo. Lasciare il coperto all'interno del pozzo. Lavare delicatamente le celle 3x con 2 mL di 1x PBS. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere 2 mL del 4% PFA in ogni pozzo per fissare le cellule. Incubare per 10 min a RT. Rimuovere il PFA e lavare 3x con 1x PBS.
   NOTA: Utilizzare sempre un volume sufficiente per coprire l'intero coperti durante i periodi di incubazione. Non lasciare mai asciugare le cellule. Non versare mai nessuna delle soluzioni direttamente sul coperto.
3. Preparare 0,5% Triton X-100 in 13 mL di 1x PBS 10 min prima dell'uso. Aggiungere 2 mL in ogni pozzo. Incubare per 15 min. Lavare delicatamente 4x con 1x PBS.
   NOTA: Triton X-100 è insolubile in PBS a RT. Riscaldare la soluzione Triton X-100 dello 0,5% a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per scioglierla.
4. Scongelare il siero di capra 5 minuti prima dell'uso. Diluire il siero di capra in 1x PBS in un rapporto 1:20 come soluzione di blocco. Aggiungere 150 L a ciascuna coverslip e incubare per 20 min a RT.
   NOTA: Prolungare il periodo di blocco fino a 60 min se necessario. Non lavare le cellule dopo aver bloccato con siero di capra.
5. Scongelare gli anticorpi primari (ad esempio, tubulina alfa anti-acetilatata e tubulina anti-gamma) 5 minuti prima dell'uso. Diluire gli anticorpi separatamente in 1x PBS come segue: tubulina alfa anti-acetilatata del topo in un rapporto 1:800 e tubulina anti-gamma del coniglio in un rapporto 1:300. Rimuovere la soluzione di blocco. Non lavare. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni anticorpo alle coperture e incubare per 60 min a RT.
   NOTA: Se l'incubazione durante la notte utilizza 500–1.000 L delle soluzioni anticorpale primarie, sigillare la piastra del pozzo 6 con pellicola di paraffina e conservarlo a 4 gradi centigradi. In alternativa, utilizzare 150 L di anticorpi e incubare in una camera di umidità.
6. Rimuovere gli anticorpi primari. Lavare i coperture molto delicatamente 3x con 2 mL di 1x PBS. Preparare gli anticorpi secondari in 1x PBS diluendo separatamente Cy3 pecora anti-topo e Alexa Fluor488 capra anti-coniglio in un rapporto 1:300. Aggiungere 150 L di entrambe le diluizioni secondarie degli anticorpi alle coperture. Incubare per 45 minuti a RT al buio.
   NOTA: Incubare al buio per evitare la fotobleaching. Altre combinazioni di anticorpi secondari possono essere utilizzate in base alle esigenze.
7. Preparare una soluzione DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) secondo le istruzioni del produttore. Conservare le aliquots in eccesso a -20 gradi centigradi. Diluire 10 L da un aliquot azionario (1:5.000) in 50 mL di 1x PBS. Aggiungere 2 mL di questa diluizione alle coperture. Incubare per 5 minuti a RT al buio.
   NOTA: È importante incubare le cellule al buio per evitare il fotobleaching. La diluizione DAPI può essere conservata a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
8. Preparare 2 aghi, scivoli, pinzette e supporti di montaggio. Etichettare le diapositive.
9. Rimuovere la soluzione DAPI dai pozzetti. Lavare 3x con 1x PBS. Inserire una goccia di supporto di montaggio su ogni diapositiva. Utilizzare l'ago per sollevare delicatamente il coperture dal fondo del pozzo. Capovolgere il coperto utilizzando le pinzette e posizionarlo delicatamente sopra la goccia del supporto di montaggio. Rimuovere con attenzione eventuali bolle.
10. Proteggere i vetrini dalla luce e conservarli durante la notte a 4 gradi centigradi.
11. Utilizzare un microscopio fluorescente o confocale con ingrandimento elevato per visualizzare le ciglia primarie.
    NOTA: Le diapositive possono essere conservate al buio a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.

Risultati

La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in que...

Discussione

Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il loro^{rilevamento 6,20,21,22}. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco