Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

Resumo

Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.

Resumo

Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1 do ciclo celular, sendo resorcridas antes da mitose. Cilia primária pode ser visualizada com métodos altamente sofisticados, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D, ou usando software para a detecção automática de cílios primários. No entanto, a coloração imunofluorescente da cília primária é necessária para realizar esses métodos. Esta publicação descreve um protocolo para a fácil detecção de cílios primários in vitro, detectando tubulina alfa acetilada (axoneme) e gamma tubulin (corpo basal). Este protocolo de coloração imunofluorescente é relativamente simples e resulta em imagens de alta qualidade. O presente protocolo descreve como quatro linhas celulares (C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) expressando cílios primários foram fixas, imunos detidas e imagens com um microscópio fluorescente ou confocal.

Introdução

Os cílios primários são estruturas sensoriais, solitárias, ligadas à membrana, não-mastile associadas à centriola mãe da célula. Cilias primárias são encontradas na maioria das células vertebrados, com exceção de glóbulos vermelhos, adipócitos¹e hepatócitos². Cilia primária são formadas como um axoneme alongado composto por microtúbulos, cujo componente principal é α-tubulina. O axoneme cresce a partir do corpo basal, que é estruturado a partir de γ-tubulin. O comprimento da cília primária varia entre 2-10 μm; no entanto, suas dimensões podem mudar durante a glicação, fome, hipóxia, estresse citotóxico, ou após a exposição à radiação ionizante^3,4,5,,6,7. Geralmente, as células possuem apenas um cílio primário, que está envolvido na morfogênese e vias de sinalização celular importantes para a proliferação celular e diferenciação^8,,9.

Os cílios primários são dinamicamente regulados durante a progressão do ciclo celular, especificamente durante as fases G0/G1, e resordiram antes de entrar em mitose em um processo associado à deacetilação de tubulina mediada por HDAC6 (histone deacetylase 6)¹⁰. O momento exato da resorção de cílios primários depende do tipo celular e da expressão de genes diretamente envolvidos nesse processo, como Aurora A, Plk1, TcTex-11,^11,12,13. Dependendo do tipo celular, os cílios primários expressam diferentes tipos de receptores, canais de íons e vias de sinalização ativa. Estes incluem os receptores de sinalização mais importantes que afetam a proliferação e a sobrevivência, EGFR, PDGFR e FGFR. Também estão incluídas algumas das vias de sinalização que podem afetar a função de um ou mais órgãos, incluindo Hedgehog, Notch e Wnt. Graças a esses receptores e vias de sinalização, os cílios primários também executam uma função de quimioensory. Esta função permite que a cília primária detecte ligantes específicos para Notch, hormônios e substâncias biologicamente ativas, como serotonina ou somatostatina. Outras funções específicas exibidas por cílios primários de diferentes comprimentos incluem reação a mudanças de temperatura, gravidade e osmolalidade¹⁴.

O cílio primário pode ser visualizado através de diversos métodos, como visualização ao vivo, microscopia eletrônica de transmissão, imagem 3D ou por software para a detecção automática de cílios primários^{5,,15,,16,,17}. No entanto, esses métodos são altamente especializados e a pesquisa em andamento precisa de métodos básicos, rápidos e fáceis para coloração de cílios primários em todas as etapas da pesquisa. Descrito é um método fácil e útil para a detecção de cílios primários em células cultivadas.

Protocolo

1. Preparação de meios culturais, soluções e pratos

1. Autoclave as tampas (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de poço. Descongele o soro bovino fetal (FBS) e a penicilina/estreptomicina antibiótico e aqueça a cultura temperatura média a ambiente (TR). Use trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (salina tamponada com cálcio e magnésio) para passagem das células.
2. Prepare fresco 4% paraformaldeído (PFA) em dH₂O (800 mgs de PFA em 20 mL de dH₂O). O PFA deve estar preparado para cada experimento. Mexa e aqueça a solução a 55 °C por 30 min no capô. Esfrie na RT. Adicione 1 M de hidróxido de sódio até que a solução fique clara (pH = 7,2-7,4). Guarde a 4 °C por até 1 semana.
   Nota: PFA é tóxico; use sempre equipamentos de proteção individual adequados e prepare-se na capa química.
3. Prepare 500 mL de mídia cultural, DMEM (meio da Águia Modificada de Dulbecco) contendo 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 2% glutamina.
4. Prepare 13 mL de solução de gelatina de 1% em dH₂O (130 mg de gelatina em 13 mL de dH₂O). Use 2 mL de gelatina de 1% para cada poço em uma placa de 6 poços. Mantenha-se estéril.
5. Limpe a capa de fluxo laminar usando 70% de etanol. Coloque o material necessário dentro do capô de fluxo laminar antes de iniciar o experimento.

2. Cultura celular para coloração imunocitoquímica

1. Descongele as células (neste estudo C2C12, MEF, NHLF e fibroblastos de pele) usando técnicas padrão e as emplaque em um frasco T75 complementado com ~10-12 mL da mídia preparada. Incubar a 37 °C/5% de CO₂/90% de umidade relativa (RH) até que as células atinjam 70% de confluência.
2. Remova as células da incubadora e coloque-as na coifa de fluxo laminar. Remova a mídia de cultura e enxágue as células brevemente 2x com 1x PBS. Adicione ~2 mL de 0,25% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar a 37 °C por ~5 min. Verifique periodicamente o microscópio invertido para monitorar o descolamento celular.
   NOTA: O tempo de incubação depende da linha celular e, portanto, deve ser determinado empiricamente.
3. Resuspenque suavemente as células em 10 mL de mídia cultural, pipetting cuidadosamente para criar uma única suspensão celular. Enxágüe o frasco novamente, se necessário.
4. Coloque a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga por 5 min a ~200 x g. Decante o supernatante, adicione 10 mL de mídia cultural, e levemente resuspenque a pelota. Pegue 20 μL da suspensão celular e misture em uma proporção de 1:1 com azul trypan e conte em um citômetro seguindo o método padrão.
5. Coloque uma mancha de cobertura dentro de cada poço de uma placa de 6 poços usando pinças. Cubra as tampas com gelatina despejando ~2 mL nos poços. Isso ajudará as células a se anexarem às tampas. Retire a solução de gelatina e deixe secar o ar por alguns minutos. As tampas estão prontas para o cultivo das células. Comece o cultivo imediatamente.
6. Semente 100.000 fibroblastos em cada poço e adicione 2 mL de mídia cultural. Incubar as células por 24 h a 37 °C/5% DE CO₂/90% RH. Neste ponto, as células podem ser tratadas de acordo com as necessidades do usuário. Os tratamentos para induzir a ciliação foram descritos anteriormente^4,5.
   NOTA: O número inicial de semeadura depende do tempo de duplicação das células e deve ser determinado em conformidade.

3. Mancha imunofluorescente de cílio primário in vitro

1. Aqueça o paraformaldeído de 4% para RT. Prepare as pipetas pasteur, 1x PBS (RT), recipiente de resíduos, tubos cônicos de 15 mL, micropipettos (0,5-10 μL, 20-200 μL e 100-1.000 μL) e pontas. Pegue as células da incubadora e coloque-as no banco.
   NOTA: O procedimento de coloração não precisa ser realizado em condições estéreis. Todas as soluções devem estar na RT.
2. Remova a mídia de cada poço. Deixe a tampa dentro do poço. Lave delicadamente as células 3x com 2 mL de 1x PBS. Usando uma pipeta Pasteur, adicione 2 mL de 4% pfa em cada poço para corrigir as células. Incubar por 10 min no RT. Remova o PFA e lave 3x com 1x PBS.
   NOTA: Use sempre um volume suficiente para cobrir toda a mancha durante os períodos de incubação. Nunca deixe as células secarem. Nunca despeje nenhuma das soluções diretamente no deslizamento de tampas.
3. Prepare 0,5% Triton X-100 em 13 mL de 1x PBS 10 min antes de usar. Adicione 2 mL em cada poço. Incubar por 15 minutos. Lave suavemente 4x com 1x PBS.
   NOTA: Triton X-100 é insolúvel em PBS na RT. Aqueça a solução Triton X-100 de 0,5% a 37 °C em um banho de água para dissolvê-la.
4. Descongele o soro de cabra 5 min antes do uso. Diluir o soro de cabra em 1x PBS em uma razão de 1:20 como uma solução de bloqueio. Adicione 150 μL a cada deslizamento de cobertura e incubar por 20 minutos na RT.
   NOTA: Prolongar o período de bloqueio até 60 min, se necessário. Não lave as células depois de bloquear com soro de cabra.
5. Descongele os anticorpos primários (ou seja, tubulina alfa anti-acetilada e tubulina anti-gama) 5 minutos antes do uso. Diluir os anticorpos separadamente em 1x PBS da seguinte forma: tubulina alfa anti-acetilada do rato em uma proporção de 1:800 e tubulina anti-gama de coelho em uma proporção de 1:300. Remova a solução de bloqueio. Não lave. Adicione 150 μL de ambas as diluições de anticorpos às tampas e incubar por 60 min na RT.
   NOTA: Se a incubação durante a noite usar 500-1.000 μL das soluções primárias de anticorpos, sele a placa de 6 poços com filme de parafina e armazene a 4 °C. Alternativamente, use 150 μL de anticorpos e incubar em uma câmara de umidade.
6. Remova os anticorpos primários. Lave as tampas muito suavemente 3x com 2 mL de 1x PBS. Prepare os anticorpos secundários em 1x PBS diluindo separadamente o anti-rato de ovelha Cy3 e o anti-coelho de cabra Alexa Fluor488 em uma proporção de 1:300. Adicione 150 μL de ambas as diluições de anticorpos secundários às tampas. Incubar por 45 min no RT no escuro.
   NOTA: Incubar no escuro para evitar fotobleaching. Outras combinações de anticorpos secundários podem ser usadas conforme necessário.
7. Prepare uma solução DAPI (4', 6-diamidino-2-fenildole) de acordo com as instruções do fabricante. Armazene as alíquotas em excesso a -20 °C. Diluir 10 μL de uma alíquota de estoque (1:5.000) em 50 mL de 1x PBS. Adicione 2 mL desta diluição às tampas. Incubar por 5 min no RT no escuro.
   NOTA: É importante incubar as células no escuro para evitar fotobleaching. A diluição do DAPI pode ser armazenada a 4 °C por até 1 mês.
8. Prepare 2 agulhas, lâminas, pinças e mídia de montagem. Rotule os slides.
9. Remova a solução DAPI dos poços. Lave 3x com 1x PBS. Coloque uma gota de mídia de montagem em cada slide. Use a agulha para levantar suavemente a mancha de cobertura do fundo do poço. Gire a tampa usando a pinça e coloque-a suavemente sobre a gota da mídia de montagem. Remova cuidadosamente todas as bolhas.
10. Proteja os slides da luz e armazene-os durante a noite a 4 °C.
11. Use um microscópio fluorescente ou confocal com alta ampliação para visualizar o cílio primário.
    NOTA: Os slides podem ser armazenados no escuro a 4 °C por até 2 meses.

Resultados

A coloração imunofluorescente da cília primária é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de alta qualidade. Nesses experimentos, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal seguindo o protocolo descrito acima. O cílio primário foi detectado usando acetilado α-tubulin e γ-tubulin. A avaliação da cília primária pode ser realizada em vários níveis e qualquer mudança nesse sentido pode estar lig...

Discussão

Vários autores descreveram diversos métodos para detecção de cílios primários, às vezes também descrevendo vários métodos de fixação que podem afetar sua detecção^6,,20,,21,22. Independentemente disso, é difícil encontrar um protocolo completo e simples para detecção. A disponibilidade pronta de tal método seria, sem dúvida, de grande assistência ao estudo da investigação ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	TPP	92406	Dimensions 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG
Anti-Tubulin γ	Sigma-Aldrich	T5192	Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Myoblast (mouse)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco´s Modified Eagle´s medium	Thermo Scientific	11960044	High glucose, No glutamine, Gibco
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8662	With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	16000044	Sterile-Filtered, Gibco
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Mouse embryonic fibroblast
Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin	Sigma-Aldrich	T7451	Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse
NHLF	Lonza	CC-2512	Primary lung fibroblasts (human)
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127-500G	Powder
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Skin fibroblasts	Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové.
Square Cover Slips	Thermo Scientific	22X22-1.5	Borosilicate glass, 22x22mm, Square
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Sterile-Filtered, Gibco