כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

Summary

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה נפוצה לדמיין מבני רקמות ספציפיים, כמו גם ביטוי חלבונים ולוקליזציה. שתי גישות חלופיות נמצאות בשימוש נרחב לטיפול בקטעי הרקמה במהלך הליך הצביעה, גישה אחת כוללת הרכבה ישירה של החלקים על שקופיות זכוכית, ואילו גישה שנייה, הציפה החופשית, מאפשרת לשמור על חלקים קבועים ולהכתים אותם כשהם תלויים בתמיסה. למרות שגישות המותקנות על שקופיות וצפות חופשיות עשויות להניב תוצאות דומות, טכניקת הציפה החופשית מאפשרת חדירת נוגדנים טובה יותר ולכן צריכה להיות השיטה המועדפת כאשר חלקים עבים יותר ישמשו לשחזור תלת-ממדי של הרקמות, למשל כאשר מוקד הניסוי הוא להשיג מידע על הקרנות דנדריטיות ואקסונליות באזורי מוח. בנוסף, מכיוון שהסעיפים נשמרים בתמיסה, אליציטוט יחיד יכול להכיל בקלות 30 עד 40 חלקים, שהטיפול בהם פחות מייגע, במיוחד במחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. במאמר זה נמחיש כיצד ליישם את שיטת הציפה החופשית על צביעה פלואורסצנטית של אימונוהיסטוכימיה, תוך התמקדות בעיקר במקטעי מוח. נדון גם כיצד ניתן לשנות בקלות את טכניקת הציפה החופשית כך שתתאים לצרכים האישיים של החוקרים ותותאם לרקמות אחרות, כמו גם לכתמים היסטוכימיים אחרים, כגון המטוקסילין ואאוזין וקרסיל סגול, כל עוד דגימות הרקמה קבועות כראוי, בדרך כלל עם פרפורמלדהיד או פורמלין.

Introduction

Immunostaining היא פרקטיקה מחקרית פופולרית שהחלה לפני 130 שנה עם גילוי נוגדנים בסרום בשנת 1890 על ידי Von Behring¹. בתחילת המאה^ה-20 הוצמדו צבעים לאנטיגנים ומאוחר יותר לנוגדנים כדרך לכמת ולדמיין תגובות¹, ובשנת 1941 פיתח אלברט קונס את תוויות הנוגדנים הפלואורסצנטיות הראשונות, תגלית שחוללה מהפכה במיקרוסקופ אור ^2,3. המונח "immunostaining" מקיף טכניקות רבות שפותחו באמצעות עיקרון זה, כולל כתם מערבי, ציטומטריית זרימה, ELISA, אימונוציטוכימיה ואימונוהיסטוכימיה ^3,4. כתם מערבי מזהה נוכחות של חלבונים ספציפיים מתמציות רקמות או תאים⁵. חלבונים מופרדים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל, מועברים לקרום ונבדקים באמצעות נוגדנים. טכניקה זו מצביעה על נוכחות של חלבון וכמה חלבון קיים; עם זאת, הוא אינו חושף מידע על לוקליזציה של החלבון בתוך תאים או רקמות. שיטה אחרת, אימונוציטוכימיה (ICC), מסמנת חלבונים בתוך תאים, בדרך כלל תאים המעובדים במבחנה. ICC מראה הן ביטוי חלבונים והן לוקליזציה בתוך תאים⁶. כדי לזהות ולדמיין חלבון מסוים ברמת הרקמה, נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה (IHC).

IHC היא שיטה שחוקרים משתמשים בה כדי להתמקד באנטיגנים ספציפיים בתוך רקמות, תוך ניצול התכונות הכימיות של מערכת החיסון ^7,8. על ידי יצירת נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים הקשורים לאנזים או לצבע פלואורסצנטי, אנטיגנים בעלי עניין יכולים להיות מסומנים ומתגלים ברוב הרקמות (כפי שנסקר ב- Mepham ו- Britten)⁹. המונח "אימונוהיסטוכימיה" כשלעצמו אינו מפרט את שיטת הסימון המשמשת לחשיפת האנטיגן המעניין; לפיכך, מינוח זה משולב לעתים קרובות עם טכניקת הזיהוי כדי להגדיר בבירור את שיטת התיוג: אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית (CIH) כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לאנזים, כגון פרוקסידאז; או IHC פלואורסצנטי כדי לציין מתי הנוגדן המשני מצומד לפלואורופור, כגון פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) או טטרמתילרודאמין (TRITC). הסלקטיביות של IHC מאפשרת לרופאים ולחוקרים לדמיין ביטוי ופיזור חלבונים ברקמות, במצבי בריאות ומחלות שונים¹⁰. בתחום הקליני, IHC משמש בדרך כלל לאבחון סרטן, כמו גם לקביעת הבדלים בסוגים שונים של סרטן. IHC שימש גם כדי לאשר סוגים שונים של זיהומים מיקרוביאליים בגוף, כגון הפטיטיס B או C¹¹. במחקר ביו-רפואי, IHC משמש לעתים קרובות למיפוי ביטוי חלבונים ברקמות והוא חשוב בזיהוי חלבונים חריגים הנראים במצבי מחלה. לדוגמה, ניוון עצבי מלווה לעתים קרובות בהצטברות של חלבונים חריגים במוח, כגון פלאקים Αβ וסבכים נוירופיברילריים במחלת אלצהיימר. מודלים של בעלי חיים מפותחים לעתים קרובות כדי לחקות מצבים פתולוגיים אלה, ו-IHC היא שיטה אחת שבה משתמשים החוקרים כדי לאתר ולכמת את החלבונים המעניינים 10,12,13. בתורו, אנו יכולים ללמוד יותר על הגורמים למחלות אלה, ואת הסיבוכים המתעוררים איתם.

ישנם שלבים רבים הכרוכים בביצוע IHC. ראשית, רקמת העניין נאספת ומוכנה להכתמה. ניתן לטעון שרוב החוקרים מכינים דגימות רקמה קבועות, כאשר זילוח של הקיבוע באמצעות מערכת הדם הוא אופטימלי מכיוון שהוא משמר מורפולוגיה^14,15. ניתן להשתמש גם לאחר קיבוע של דגימות רקמה אך עשוי להניב תוצאות פחות מאידיאליות¹⁶. קיבוע צולב, כגון פורמלדהיד, פועל על ידי יצירת קשרים כימיים בין חלבונים ברקמה¹⁷. לאחר מכן פורסים רקמות קבועות לשכבות או מקטעים דקים מאוד באמצעות מיקרוטום, כאשר חוקרים רבים מעדיפים לאסוף חלקים קפואים באמצעות הקפאה. משם הרקמה נאספת ומורכבת ישירות על מגלשת מיקרוסקופ (שיטת החלקה על החלקה), או תלויה בתמיסה (שיטת ציפה חופשית), כגון מלח חוצץ פוספט (PBS)¹⁸. שיטת האיסוף בה נעשה שימוש נקבעת מראש על פי צרכי החוקר, כאשר כל אחת משתי שיטות אלה מציגה יתרונות וחסרונות משלה.

השיטה המותקנת בהחלקה היא ללא ספק הנפוצה ביותר, כאשר יתרון חשוב הוא שניתן להכין חלקים דקים מאוד (10-14 מיקרומטר), מה שחשוב, למשל, לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. יש גם טיפול מינימלי בדגימה, מה שמקטין את הנזק הפוטנציאלי לשלמות המבנית של הרקמה¹⁹. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בטכניקה זו עם רקמה קפואה טרייה (רקמה שמוקפאת מיד באמצעות קרח יבש, איזופנטאן וכו '), שהיא עדינה מאוד בהשוואה לרקמה קבועה ויש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע הפשרה של הדגימה. יתרון נוסף של שימוש בחלקים המותקנים על שקופיות הוא שבדרך כלל אין צורך בכמויות גדולות של פתרונות לצביעה⁴. לכן, חוקרים יכולים להשתמש בכמות קטנה יותר של נוגדנים יקרים או כימיקלים אחרים כדי להשלים את הכתם. בנוסף, ניתן להעלות קטעים ממספר קבוצות ניסוי שונות על אותה שקופית, מה שיכול להיות יתרון, במיוחד במהלך רכישת תמונה. מצד שני, ישנם כמה חסרונות בשימוש במקטעים המותקנים על שקופיות, ובראשם שקטע הרקמה מוצמד לשקופית ובכך מגביל את חדירת הנוגדנים לצד אחד של המקטע, מה שמגביל את עובי הקטע ואת הייצוג התלת ממדי של הרקמה. זה יכול לקרות גם כי במהלך שטיפות, הקצוות של הרקמה וחלקים שלמים עשויים להתנתק מן השקופית, מה שהופך את הניסוי כולו חסר תועלת. יתר על כן, IHC בדרך כלל צריך להתבצע במהירות יחסית בעת שימוש בגישה המותקנת על שקופיות כדי למנוע השפלה של אפיטופ האנטיגן 20,21 עם שקופיות לא מעובדות המאוחסנות בדרך כלל ב -²⁰ או -⁸⁰ ° C, לעתים קרובות מכוסה ומאוחסן אופקית או בתיבות שקופיות^, וכתוצאה מכך טביעת רגל אחסון גדולה יחסית. לבסוף, טכניקת ההרכבה על שקופיות יכולה גם לקחת זמן רב אם החוקרים צריכים לטפל במספר רב של שקופיות כדי לעבד מספר גדול של קטעי רקמות.

בשל חלק מהאתגרים הללו באמצעות שיטת ההרכבה על השקופיות, שינוי שנקרא שיטת הציפה החופשית הפך לחלופה פופולרית. טכניקה זו נכנסה לספרות בשנות ה-60-70 22,23,24, צברה פופולריות בשנות ה-80 25,26,27,28,29, וכיום היא שיטה מבוססת היטב הכוללת ביצוע הכתם על הקטעים שנאספו בהשעיה ולא היצמדה לשקופית ^12,30,31 . שיטת הציפה החופשית אינה מומלצת כאשר קטעי הרקמה הם פחות מ -20 מיקרומטר; עם זאת, מניסיוננו זוהי הגישה הנבחרת כאשר חלקים עבים יותר (40-50 מיקרומטר) להיות מוכתם. יתרון מובהק אחד הוא שנוגדנים יכולים לחדור חלקים צפים חופשיים מכל הזוויות וליצור פחות צביעת רקע הודות לשטיפה יעילה יותר, כל זאת וכתוצאה מכך איתות טוב יותר בעת ההדמיה. בנוסף, החלקים מותקנים על השקופיות לאחר העיבוד, ובכך מבטלים את האפשרות של ניתוק רקמות, כמו גם מפחיתים את הזמן התופס את ההקפאה. שיטת הציפה החופשית יכולה גם להיות הרבה פחות אינטנסיבית עבודה, במיוחד עבור מחקרים ביו-רפואיים בקנה מידה גדול. למשל, ניתן להכתים חלקים רבים (18-40) מאותה דגימה יחד באותה באר, מה שחוסך זמן בביצוע שלבי השטיפה והדגירה של הנוגדנים. יתר על כן, מכיוון שניתן להרכיב מספר גדול יותר (12-16) של מקטעים בכל שקופית באמצעות גישה זו, לעתים קרובות נוח ומהיר יותר לחוקר להציג ולצלם קטעים. יש לציין כי במהלך הרכבה של פרוסות רקמות על השקפים, ניתן לחבר ולנתק חלקים עד לקבלת הכיוון הרצוי. החוקרים גם משתמשים לעתים קרובות בריכוזים מעט נמוכים יותר של נוגדנים בשיטת הציפה החופשית, ומכיוון שהדגירות מבוצעות בצינורות מיקרוצנטריפוגות, ניתן לאסוף את הנוגדנים בקלות ולשמר אותם עם נתרן אזיד לשימוש חוזר (ראה שלב 5.1). יתרון נוסף הוא שניתן לאחסן את המקטעים ישירות ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות מיקרוצנטריפוגות קטנות עם תמיסה קריופרוטקגנטית³², ובכך למזער את שטח האחסון ולמקסם את תוחלת החיים של הדגימות³³. החיסרון בשימוש בטכניקה זו הוא שהקטעים מטופלים הרבה, ולכן הם נוטים לפגוע. עם זאת, ניתן להקל על כך על ידי שימוש בטלטול נמוך ובמהירויות סיבוב נמוכות, כמו גם הכשרה נכונה של החוקרים כיצד להעביר את הדגימות ולהרכיב את המקטעים על השקפים.

יחד, IHC הוא כלי מבוסס וחיוני להדמיה וללוקליזציה של ביטוי חלבונים הן בתחום המחקר הקליני והן בתחום המחקר הביו-רפואי. IHC צף חופשי היא שיטה יעילה, גמישה, כמו גם כלכלית, במיוחד בעת ביצוע מחקרים היסטולוגיים בקנה מידה גדול. כאן, אנו מציגים פרוטוקול IHC פלואורסצנטי אמין וצף חופשי עבור הקהילה המדעית שניתן להתאים בהתאם לכתמים כרומוגניים של IHC וכתמים אחרים כגון המטוקסילין ואאוסין או צביעה סגולה קרזיל.

Protocol

1. הכנת רקמות להקפאה

1. הטמיעו רקמות קבועות בתבנית הטבעה מתאימה (ראו טבלת חומרים) ליצירת גוש דגימה באמצעות מטריצת דגימות מתאימה (ראו טבלת חומרים) והקפיאו על קרח יבש. אחסנו את גושי הדגימה בטמפרטורה של -80°C עד שהם מוכנים לחתוך.
   הערה: רקמות קבועות מוכנות בדרך כלל על ידי ניקוב מכרסמים בוגרים (בני 2.5 עד 30 חודשים) זכרים או נקבות (עכבר או חולדה)³⁴, בהתאם להיתר אתי זמין, עם קיבוע מתאים (למשל 10% פורמלין), ואחריו רקמות לאחר קיבוע באותו קיבוע במשך 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, שטיפת רקמות שלוש פעמים עם PBS 1x, והנחת רקמות ב-15% ולאחר מכן 30% סוכרוז ב-1x PBS למשך הלילה או עד שהרקמות שוקעות³⁵. חוקרים עשויים לנסות להתאים את הפרוטוקול הכללי הזה לשלבי התפתחות שונים.

2. Cryosectioning

1. כאשר מוכנים לחתך, אקלום דגימות בהקפאה לפחות 1-2 שעות לפני החתך כדי למנוע ריסוק של רקמה.
2. בעזרת הקפאה, חותכים רקמות למקטעים (20-50 מיקרומטר) ואוספים פנימה 6 או 12 תוספות באר (ראה טבלת חומרים) מלאות בתמיסת PBS אחת.
   הערה: בהתאם לעובי המקטע, כמות הרקמה שיש לאסוף ומספר תוספות הבאר בהן נעשה שימוש, כל באר תכיל מספר משתנה של חתכים המשתרעים על פני כ-10 עד 40 פרוסות לבאר. לדוגמה, אם מוח שלם נחתך ב-40 מיקרומטר, ייאספו כ-18-24 מקטעים בכל באר באמצעות תוספות של 12 בארות. כמו כן, חתכים של 20 מיקרומטר יכולים להיות מעט מאתגרים לטיפול, ולכן 40 מיקרומטר מומלץ לצביעה בתפזורת (ראה דיון).

3. אחסון חלקים

1. לאחר האיסוף, לשטוף את החלקים עם 1x PBS מוכן טרי במשך 5 דקות. חזור על הפעולה 3 פעמים.
2. מעבירים את החלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל מלאים בתמיסת אחסון של 1-1.5 מ"ל (עבור 250 מ"ל, מערבבים 70 גרם סוכרוז, 75 מ"ל אתילן גליקול, ומביאים לנפח עם חיץ פוספט 0.1 M).
3. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד להכנה לצביעה.

4. יום הכתמה I

1. מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומאזנים אותן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 - 20 דקות.
2. יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד פתרון אחסון מקטעים.
3. העבירו את הכנסת הבאר לבאר אחרת המכילה כ-6 מ"ל של 1x TBS. שטפו 3 פעמים עם 1x TBS במשך 5 דקות כל אחת בשייקר מסלול במהירות נמוכה ב-RT.
4. בזמן שהמקטעים שוטפים, הכינו 7 מ"ל (לדגימה) של תמיסה חודרת-חוסמת המורכבת מ-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-3% סרום רגיל (למשל, נסיוב סוסים רגיל). חסום קטעים למשך 30 דקות ב- RT בשייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה.
   הערה: חסימה באמצעות סרה מונעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים לרקמות או קולטני Fc לא ספציפיים – מומלץ להשתמש בסרום התואם את מין הנוגדן המשני, אך אם אינו זמין, ניתן להשתמש בכל סרום רגיל ממין שונה מהחיה המארחת של הנוגדנים הראשוניים. חומר הניקוי Triton X-100 מאפשר חדירת נוגדנים טובה יותר על ידי חדירת הרקמה.
5. הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים ראשונית המורכבת מנוגדנים ראשוניים נבחרים (מדוללים כראוי) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (ראו שלב 4.4 הערה). מעבירים קטעים מבאר מוכנסים לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים ראשונית כדי להיקשר לאנטיגן(ים) המעניין.
   הערה: ניתן להשתמש במספר נוגדנים ראשוניים (שנוצרו במינים מארחים שונים).
6. מניחים צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל עם חלקים על מיקסר מסתובב במהירות נמוכה (למשל, מהירות 7 סל"ד) ודגרים למשך לילה במשך 12-16 שעות ב-4°C.

5. יום הצביעה II

1. למחרת, יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים ראשונית.
   הערה: ניתן לאסוף תמיסת נוגדנים ולעשות בה שימוש חוזר; הוסף 0.02% (w/v) נתרן אזיד כדי לעכב צמיחה מיקרוביאלית.
2. יש לכבס את המקטעים 3 פעמים עם 1x TBS ב-RT (30 שניות עבור 2 השטיפות הראשונות ו-10 דקות עבור השטיפה הסופית).
3. הכינו 1 מ"ל לכל דגימה של תמיסת נוגדנים משנית המורכבת מנוגדן משני מתאים (מדולל בהתאם) ב-1x TBS עם 0.3% Triton X-100 ו-1% סרום רגיל (תמיסת מגן מפני אור).
   הערה: תיוג עקיף עם נוגדן משני מצומד מגביר את האות ומאפשר הדמיה קולורימטרית או פלואורסצנטית של מטרת החלבון.
4. העברת קטעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכיל תמיסת נוגדנים משנית. יש לדגור במשך שעתיים ב-RT על שייקר מסלולי, תוך שימוש במהירות נמוכה (תמיסת מגן מפני אור).
5. יוצקים חלקים לתוך באר להכניס צלחת 6 באר כדי להפריד חלקים מתמיסת נוגדנים משנית.
6. כדי להמשיך להגן על הדגימות מפני אור, שטפו פעמיים עם 1x TBS במשך 30 שניות ב-RT. לאחר מכן שטפו במשך 15 דקות בכף אחת, הוסיפו DAPI (1-0.1 מיקרוגרם/מ"ל) אם רוצים.

6. הרכבה

1. יוצקים חלקים לתוך תא היסטולוגי זכוכית, מלבני מלא שלושה רבעים עם 1x TBS.
2. השקיעו שקופית זכוכית ב-1x TBS והשתמשו במברשת צבע עדינה כדי לשדל את המקטעים לכיוון השקופית.
3. הקש בעדינות על המקטעים על השקופית, וודא שאין קמטים או קפלים.
4. חזור על הפעולה עד שכל המקטעים יוטענו בשקופיות.
   הערה: כאשר מוח שלם, למשל, נחתך ב 40 מיקרומטר, נאסף ב 12 תוספות באר עם aliquot אחד המכיל 18-24 חלקים; פרוסות מותקנות בדרך כלל על 1-2 שקופיות, אך ניתן גם להרכיב פחות מקטעים בכל שקופית, בהתאם להעדפת החוקר.

7. כיסויים

1. לאחר ייבוש המקטעים על המגלשה(ים), כ-10-15 דקות ב-RT או עד שהמקטעים נראים אטומים (זכרו להגן על שקופיות מפני אור), מרחו אמצעי הרכבה מימי מתאים (התקשות או אי-התקשות). אנטי-דהייה עדיפה אם משתמשים בנוגדן משני מצומד פלואורסצנטי.
   הערה: איכות הפלואורסצנטיות עשויה להיות פחותה בעת שימוש באמצעי הרכבה מתקשה, אך שקופיות אמורות להחזיק מעמד זמן רב יותר.
2. בעזרת פינצטה, מניחים כיסוי על גבי המדיום. כסו בנייר סינון ולחצו בחוזקה כלפי מטה כדי להסיר אמצעי הרכבה עודפים.
   הערה: אם אתם משתמשים בתושבת שאינה מתקשה, צבעו את קצוות השקופית המכוסה בלק שקוף לאיטום.
3. קטעי תמונה באמצעות מיקרוסקופ מתאים. יש לאחסן בקופסת שקופיות חשוכה בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן לצלם מקטעים באמצעות מגוון מיקרוסקופים, כגון סריקת לייזר פלואורסצנטית קונפוקלית והפוכה או זקופה, בהגדלות (למשל, 10x, 20x, 40x) בהתאם לצרכי החוקר.

תוצאות

התוכנית הכוללת של השימוש בשיטת הציפה החופשית לביצוע בדיקה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מודגמת באיור 1. דוגמה מייצגת של IHC פלואורסצנטי המשתמש בשיטת הציפה החופשית במוח עכבר הבוחן ביטוי חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) מוצגת באיור 2 בהגדלה נמוכה וגבוהה יותר כ?...

Discussion

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה רב-תכליתית שהפכה לחיונית בזיהוי ביטוי חלבונים ולוקליזציה בתוך חלקי רקמות. בדיקה זו משמשת ברחבי הקהילה המדעית כדי להבין עוד יותר מאפיינים של רקמה משלבים של תפקוד תקין למצבי מחלה. IHC מועסק במגוון תחומים, החל מאבחון קליני של מחלות כגון סרטן ועד תגליות ראשוניות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042