自由浮遊組織切片を用いた組織学的染色

要約

フリーフローティング技術により、研究者は固定組織切片で免疫組織化学を含む組織学的ベースの染色を行い、生物学的構造、細胞タイプ、タンパク質の発現と局在を視覚化できます。これは効率的で信頼性の高い組織化学的手法であり、脳、心臓、肝臓などの多数の組織の調査に役立ちます。

要約

免疫組織化学は、特定の組織構造、ならびにタンパク質の発現および局在を視覚化するために広く使用されている技術です。染色手順中に組織切片を処理するために2つの代替アプローチが広く使用されており、1つのアプローチは切片をスライドガラスに直接取り付けることで構成され、2番目のアプローチであるフリーフローティングは、溶液に懸濁しながら固定切片を維持および染色することができます。スライドマウント法とフリーフローティング法でも同様の結果が得られる可能性がありますが、フリーフローティング法は抗体の浸透性が向上するため、組織の3D再構築に厚い切片を使用する場合、たとえば実験の焦点が脳領域の樹状突起および軸索投影に関する情報を得ることである場合に選択する方法です。さらに、切片は溶液中に保たれるため、1つのアリコートで30〜40の切片を容易に収容でき、特に大規模な生物医学研究では取り扱いの手間がかかりません。ここでは、蛍光免疫組織化学染色へのフリーフローティング法の適用方法を、脳切片を中心に説明します。また、組織サンプルがパラホルムアルデヒドまたはホルマリンで適切に固定されている限り、研究者の個々のニーズに合わせてフリーフローティング技術を簡単に変更し、他の組織やヘマトキシリン、エオシン、クレジルバイオレットなどの他の組織化学ベースの染色に適応させる方法についても説明します。

概要

免疫染色は、130年前の1890年にフォンベーリング¹によって血清抗体が発見されたことから始まった人気のある研究慣行です。20^世紀初頭、反応を定量および視覚化する方法として色素が抗原に結合し、後に抗体に付着し¹、1941年にアルバートクーンズは最初の蛍光抗体標識を開発し、光学^{顕微鏡法に}革命をもたらした発見^2,3。「免疫染色」という用語は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む、この原理を用いて開発された多くの技術を包含する^3,4。ウェスタンブロットは、組織または細胞抽出物から特定のタンパク質の存在を検出します⁵.タンパク質は、ゲル電気泳動を使用してサイズ別に分離され、メンブレンに転写され、抗体を使用してプローブされます。この手法は、タンパク質の存在とタンパク質が存在する量を示します。しかしながら、それは細胞または組織内のタンパク質の局在に関する情報を明らかにしない。別の方法である免疫細胞化学(ICC)は、細胞内のタンパク質、典型的にはインビトロで培養された細胞を標識する。ICCは、細胞コンパートメント内のタンパク質発現と局在の両方を示します⁶。特定のタンパク質を組織レベルで検出および視覚化するために、免疫組織化学(IHC)が利用されます。

IHCは、免疫系の化学的性質を利用して、組織内の特定の抗原を標的とするために研究者が使用する方法です^7,8。酵素または蛍光色素のいずれかに結合した特異的な一次抗体および二次抗体を生成することにより、目的の抗原を標識し、ほとんどの組織で明らかにすることができます(Mepham and Brittenでレビューされています)⁹。「免疫組織化学」という用語自体は、目的の抗原を明らかにするために使用される標識方法を指定しません。したがって、この用語は、標識方法を明確に描写するために検出技術と組み合わせることがよくあります:二次抗体がペルオキシダーゼなどの酵素に結合していることを示す発色免疫組織化学(CIH)。または蛍光IHCは、二次抗体がフルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはテトラメチルローダミン(TRITC)などのフルオロフォアに結合している場合を示します。IHCの選択性により、臨床医や研究者は、さまざまな健康状態や疾患状態にわたる組織全体のタンパク質の発現と分布を視覚化できます¹⁰。臨床分野では、IHCは一般的に癌の診断やさまざまな種類の癌の違いを判断するために使用されます。IHCは、B型肝炎や^C11型肝炎など、体内のさまざまな種類の微生物感染を確認するためにも使用されています。生物医学研究では、IHCは組織内のタンパク質発現をマッピングするためによく使用され、病状に見られる異常なタンパク質を特定するのに重要です。例えば、神経変性は、アルツハイマー病におけるΑβプラークや神経原線維変化などの異常なタンパク質の脳内の蓄積を伴うことが多い。動物モデルは、これらの病理学的状態を模倣するために開発されることが多く、IHCは、研究者が目的のタンパク質を見つけて定量するために使用する1^{つの方法です10、12、13}。次に、これらの病気の原因とそれらに伴って発生する合併症についてもっと学ぶことができます。

IHCの実行には多くのステップがあります。まず、目的の組織を回収し、染色の準備をします。おそらくほとんどの研究者は固定組織サンプルを準備し、循環器系を介した固定液の灌流は形態を保存するため最適です^14,15。組織サンプルの事後固定も使用され得るが、理想的よりも低い結果をもたらす可能性がある¹⁶。ホルムアルデヒドなどの架橋固定剤は、組織¹⁷内のタンパク質間に化学結合を作り出すことによって作用する。次に、固定された組織はミクロトームを使用して非常に薄い層または切片にスライスされ、多くの研究者はクライオスタットを使用して凍結切片を収集することを好みます。そこから組織を採取し、顕微鏡スライドに直接取り付けるか(スライドマウント法)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの溶液に懸濁します(フリーフローティング法)¹⁸。使用される収集方法は、研究者のニーズに基づいて事前に決定されており、これら2つの方法のそれぞれが独自の長所と短所を示しています。

スライドマウント法は群を抜いて最も一般的に使用されており、非常に薄い切片(10〜14μm)を調製できることが重要な利点であり、これは例えばタンパク質間相互作用を調べるために重要です。標本の取り扱いも最小限であり、これは組織¹⁹の構造的完全性に対する潜在的な損傷を減少させる。研究者は、固定組織と比較して非常にデリケートであり、サンプルの解凍を防ぐために多くの注意を払う必要がある新鮮な凍結組織(ドライアイス、イソペンタンなどを使用してすぐに凍結される組織)でこの技術を使用することがよくあります。スライドマウント切片を使用するもう一つの利点は、染色のための大量の溶液が通常必要とされないことです⁴。したがって、研究者は少量の高価な抗体または他の化学物質を使用して染色を完成させることができます。さらに、複数の異なる実験グループのセクションを同じスライドにマウントすることが可能であり、特に画像取得時に有利です。一方、スライドマウント切片を使用することにはいくつかの欠点があり、最も顕著なのは、組織切片がスライドに接着されているため、抗体の浸透が切片の片側に制限され、切片の厚さと組織の3D表現が制限されることです。また、洗浄中に、組織の端とセクション全体がスライドから剥がれ、実験全体が役に立たなくなることもあります。さらに、IHCは通常、抗原エピトープ^20,21の分解を回避するためにスライドマウントアプローチを使用する場合、比較的迅速に実行する必要があり、未処理のスライドは通常-²⁰または-80°Cで保存され、多くの場合、カバースリップして水平またはスライドボックスに保存され、比較的大きな保存フットプリントになります。最後に、研究者が多数の組織切片を処理するために多数のスライドを処理する必要がある場合、スライドマウント技術は時間がかかる可能性もあります。

スライドマウント方式を使用したこれらの課題のいくつかのために、フリーフローティング方式と呼ばれる修正が一般的な代替手段になりました。この技術は1960-70年代に文献に登場しました22,23,24、1980年代に人気を博しました25,26,27,28,29、そして現在では、スライドに付着するのではなく、懸濁液で収集された切片に染色を行うことを含む確立された方法です^12,30,31.フリーフローティング法は、組織切片が20μm未満の場合は推奨されません。しかし、私たちの経験では、より厚い(40〜50μm)切片を染色する場合に最適なアプローチです。明確な利点の1つは、抗体があらゆる角度から浮遊切片に浸透し、より効果的な洗浄によりバックグラウンド染色が少なくなり、イメージング時のシグナル伝達が向上することです。さらに、切片は処理後にスライドに取り付けられるため、組織が剥離する可能性を排除し、クライオスタットを占有する時間を短縮します。フリーフローティング法はまた、特に大規模な生物医学研究のために、はるかに労働集約的ではない可能性があります。例えば、同じサンプルの多くの(18〜40)切片を同じウェルで一緒に染色することが可能であり、洗浄ステップと抗体インキュベーションステップの両方を実行する時間を節約できます。さらに、このアプローチを使用すると、スライドごとにより多くの(12〜16)セクションをマウントできるため、研究者がセクションを表示して画像化する方が便利で迅速であることがよくあります。特に、スライドへの組織スライスの取り付け中に、所望の配向が得られるまで切片を着脱することができる。研究者はまた、フリーフローティング法を使用してわずかに低濃度の抗体を使用することが多く、インキュベーションはマイクロ遠心チューブで行われるため、抗体を簡単に収集してアジ化ナトリウムで保存して再利用できます(ステップ5.1を参照)。別の利点は、凍結保護剤溶液³²と共に切片を小型の微小遠心管に-80°Cで直接保存することができ、それによって貯蔵スペースを最小限に抑え、サンプル³³の寿命を最大化することである。この手法を使用することの欠点は、セクションが頻繁に処理されるため、損傷を受けやすいことです。ただし、これは、低い振とう速度と回転速度を使用し、サンプルを移してセクションをスライドに取り付ける方法を研究者に適切にトレーニングすることで軽減できます。

IHCは、臨床研究分野と生物医学研究分野の両方でタンパク質発現を視覚化および局在化するための確立された不可欠なツールです。フリーフローティングIHCは、特に大規模な組織学的研究を行う場合、効率的で柔軟性があり、経済的な方法です。ここでは、発色性IHCやヘマトキシリンやエオジン、クレシルバイオレット染色などの他の染色に適応できる、科学界向けの信頼性の高い浮遊蛍光IHCプロトコルを紹介します。

プロトコル

1.凍結切片のための組織調製

1. 固定組織を適切な埋め込み型(材料表を参照)に埋め込み、適切な試験片マトリックス(材料表を参照)を使用して試験片ブロックを作成し、ドライアイス上で凍結します。切断の準備ができるまで、試料ブロックを-80°Cで保管します。
   注:固定組織は通常、成人(生後約2.5〜30か月)の雄または雌のげっ歯類(マウスまたはラット)³⁴を、利用可能な倫理的許可に従って、適切な固定剤(10%ホルマリンなど)で灌流し、続いて同じ固定液で4°Cで12時間固定後固定し、1x PBSで組織を3回洗浄することによって調製されます。 組織を15%、次に30%スクロースを1x PBSに一晩または組織が沈むまで^{配置します35}。研究者は、この一般的なプロトコルをさまざまな開発段階に適応させようとするかもしれません。

2.凍結切片

1. 切片の準備ができたら、組織の粉砕を防ぐために、切片化の前に少なくとも1〜2時間クライオスタットでサンプルを順応させます。
2. クライオスタットを使用して、組織を切片(20〜50 μm)に切断し、1x PBS溶液で満たされた6または12ウェルインサート( 材料の表を参照)に収集します。
   注:セクションの厚さ、収集する組織の量、および使用するウェルインサートの数に応じて、各ウェルには、ウェル用に約10〜40スライスにまたがる可変数のセクションが含まれます。たとえば、脳全体を40μmで切片化する場合、12ウェルインサートを使用して各ウェルに約18〜24の切片が収集されます。また、20 μmの切片は取り扱いがやや難しい場合があるため、バルク染色には40 μmをお勧めします(「説明」を参照)。

3. セクションの保存

1. 採取したら、作りたての1x PBSで切片を5分間洗浄します。3回繰り返します。
2. 切片を1〜1.5 mLの保存溶液で満たされた2 mLの微量遠心チューブに移します(250 mLの場合、70 gのスクロース、75 mLのエチレングリコールを混合し、0.1 Mリン酸バッファーで容量にします)。
3. 染色の準備ができるまで-80°Cで保存してください。

4.染色I日目

1. 冷凍庫からサンプルを取り出し、室温(RT)で10〜20分間平衡化します。
2. セクションを6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、保存液をセクションから分離します。
3. ウェルインサートを、約6 mLの1x TBSを含む別のウェルに移動します。 RTで低速で低速を使用して、オービタルシェーカーで1x TBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
4. 切片を洗浄している間に、0.3%Triton X-100を含む1x TBSと3%正常血清(例:.、正常ウマ血清)からなるブロッキング透過液7 mL(サンプルあたり)を調製します。低速を使用して、オービタルシェーカーのRTで30分間セクションをブロックします。
   注:血清によるブロッキングは、組織または非特異的Fc受容体への抗体の非特異的結合を防ぎます–二次抗体の種と一致する血清が推奨されますが、利用できない場合は、一次抗体宿主動物とは異なる種からの任意の正常血清を使用できます。界面活性剤Triton X-100は、組織を透過させることにより、抗体の浸透を改善します。
5. 選択した一次抗体(適切に希釈)からなる一次抗体溶液のサンプルあたり1 mLを、0.3%Triton X-100および1%正常血清を含む1x TBSで調製します(ステップ4.4注を参照)。ウェルインサートから一次抗体溶液を含む2 mLマイクロ遠心チューブに切片を移し、目的の抗原に結合させます。
   注:複数の一次抗体を使用できます(異なる宿主種で生成)。
6. 切片付きの2 mLマイクロ遠心チューブを低速(速度7 rpmなど)を使用して回転ミキサーに置き、4°Cで12〜16時間一晩インキュベートします。

5.染色2日目

1. 翌日、切片を6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、一次抗体溶液から切片を分離します。
   注:抗体溶液は収集して再利用できます。微生物の増殖を抑制するために0.02%(w / v)アジ化ナトリウムを追加します。
2. RTで1x TBSでセクションを3回洗浄します(最初の2回の洗浄で30秒、最後の洗浄で10分)。
3. 0.3%Triton X-100および1%正常血清(光からの遮蔽液)を含む1x TBS中の適切な二次抗体(それに応じて希釈)からなる二次抗体溶液をサンプルあたり1 mL調製します。
   注:結合二次抗体による間接標識は、シグナルを増幅し、タンパク質標的の比色または蛍光可視化を可能にします。
4. 二次抗体溶液を入れた2 mLの微量遠心チューブに切片を移します。低速(光からの遮蔽溶液)を使用して、オービタルシェーカーのRTで2時間インキュベートします。
5. 切片を6ウェルプレートのウェルインサートに注ぎ、二次抗体溶液から切片を分離します。
6. サンプルを光から遮蔽し続け、RTで2x TBSで30秒間30回洗浄します。次に、1x TBSで15分間洗浄し、必要に応じてDAPI(1〜0.1 μg / ml)を追加します。

6. 取り付け

1. 1x TBSで4分の3を満たしたガラス製の長方形の組織学的チャンバーに切片を注ぎます。
2. スライドガラスを1x TBSに沈め、細かい絵筆を使用してセクションをスライドに向かって同軸にします。
3. セクションをスライドにそっとタップし、しわや折り目がないことを確認します。
4. すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで繰り返します。
   注:たとえば、脳全体を40 μmで切片化し、18〜24の切片を含む1つのアリコートを含む12ウェルインサートに収集します。スライスは通常1〜2枚のスライドに取り付けられますが、研究者の好みに応じて、スライドごとにマウントできるセクションの数を減らすこともできます。

7.カバースリップ

1. セクションをスライド上で乾燥させた後、RTで約10〜15分、またはセクションが不透明になるまで(スライドを光から保護することを忘れないでください)、適切な水性封入剤(硬化または非硬化)を塗布します。退色防止は、蛍光標識二次抗体を用いる場合が好ましい。
   注意: 硬化剤を使用すると蛍光品質が低下する場合がありますが、スライドは長持ちします。
2. ピンセットを使用して、メディアの上にカバーガラスを置きます。ろ紙で覆い、しっかりと押し下げて余分な封入剤を取り除きます。
   注意: 非硬化マウントを使用する場合は、カバースリップスライドの端を透明なマニキュアでペイントしてシールします。
3. 適当な顕微鏡を用いた切片の画像。4°Cの暗いスライドボックスに保管してください。
   注:切片は、レーザー走査型共焦点および倒立または直立広視野蛍光などのさまざまな顕微鏡を使用して、研究者のニーズに基づいて倍率(10倍、20倍、40倍など)で画像化できます。

結果

蛍光免疫組織化学的アッセイを実行するためにフリーフローティング法を用いることの全体スキームを図1に例示する。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)発現を調べるマウス脳におけるフリーフローティング法を用いた蛍光IHCの代表例を、染色の全体的な品質を説明するために、低倍率および高倍率の両方で図2に示す。このアプローチは、低発現?...

ディスカッション

免疫組織化学(IHC)は、組織切片内のタンパク質発現と局在を特定する上で重要になっている汎用性の高い技術です。このアッセイは、正常な機能の段階から病状までの組織の特徴をさらに理解するために、科学界全体で使用されています。IHCは、がんなどの疾患の臨床診断から前臨床研究における最初の発見まで、さまざまな分野で採用されています^10,36

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042