Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Özet

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Özet

İmmünohistokimya, spesifik doku yapılarının yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Boyama prosedürü sırasında doku kesitlerini işlemek için iki alternatif yaklaşım yaygın olarak kullanılmaktadır, bir yaklaşım bölümleri doğrudan cam slaytlara monte etmekten oluşurken, ikinci bir yaklaşım olan serbest yüzen, çözelti içinde askıya alınırken sabit bölümlerin korunmasına ve boyanmasına izin verir. Slayta monte edilmiş ve serbest yüzen yaklaşımlar benzer sonuçlar verebilse de, serbest yüzen teknik daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir ve bu nedenle dokuların 3D rekonstrüksiyonu için daha kalın bölümler kullanılacaksa, örneğin deneyin odak noktası beyin bölgelerindeki dendritik ve aksonal projeksiyonlar hakkında bilgi edinmek olduğunda tercih edilen yöntem olmalıdır. Ek olarak, bölümler çözelti içinde tutulduğundan, tek bir aliquot, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalarda, kullanımı daha az zahmetli olan 30 ila 40 bölümü kolayca barındırabilir. Burada, serbest yüzen yöntemin floresan immünohistokimya boyamasına nasıl uygulanacağını ve beyin bölümlerine odaklanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, serbest yüzen tekniğin, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl kolayca değiştirilebileceğini ve doku örnekleri tipik olarak paraformaldehit veya formalin ile düzgün bir şekilde sabitlendiği sürece, hematoksilin ve eozin ve cresyl violet gibi diğer histokimyasal bazlı boyamaların yanı sıra diğer dokulara nasıl uyarlanabileceğini de tartışacağız.

Giriş

İmmünoboyama, 130 yıl önce 1890 yılında Von Behring¹ tarafından serum antikorlarının keşfi ile başlayan popüler bir araştırma uygulamasıdır. 20. yüzyılın başlarında, boyalar reaksiyonları ölçmenin ve görselleştirmenin bir yolu olarak antijenlere ve daha sonra antikorlara bağlandı¹ ve 1941'de Albert Coons, ışık mikroskobu ^2,3'te devrim yaratan bir keşif olan ilk floresan antikor etiketlerini geliştirdi^. "İmmünoboyama" terimi, Western blot, flow cytometry, ELISA, immünositokimya ve immünohistokimya ^3,4 dahil olmak üzere bu prensip kullanılarak geliştirilen birçok tekniği kapsar. Western blot, doku veya hücre ekstraktlarından spesifik proteinlerin varlığını tespit eder⁵. Proteinler jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır, bir zara aktarılır ve antikorlar kullanılarak incelenir. Bu teknik, proteinin varlığını ve ne kadar protein bulunduğunu gösterir; Bununla birlikte, proteinin hücreler veya dokular içindeki lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi ortaya koymaz. Başka bir yöntem olan immünositokimya (ICC), hücrelerdeki proteinleri, tipik olarak in vitro olarak yetiştirilen hücreleri etiketler. ICC, hücresel bölmelerde hem protein ekspresyonunu hem de lokalizasyonu gösterir⁶. Doku düzeyinde spesifik bir proteini tespit etmek ve görselleştirmek için immünohistokimya (IHC) kullanılır.

IHC, araştırmacıların bağışıklık sisteminin kimyasal özelliklerinden yararlanarak doku içindeki spesifik antijenleri hedeflemek için kullandıkları bir yöntemdir ^7,8. Bir enzime veya floresan boyaya bağlı spesifik birincil ve ikincil antikorlar üretilerek, ilgilenilen antijenler çoğu dokuda etiketlenebilir ve ortaya çıkarılabilir (Mepham ve Britten'de gözden geçirildiği gibi)⁹. "İmmünohistokimya" terimi tek başına, ilgilenilen antijeni ortaya çıkarmak için kullanılan etiketleme yöntemini belirtmez; Bu nedenle, bu terminoloji genellikle etiketleme yöntemini açıkça tanımlamak için tespit tekniği ile birleştirilir: ikincil antikorun peroksidaz gibi bir enzime ne zaman konjuge olduğunu belirtmek için kromojenik immünohistokimya (CIH); veya ikincil antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) veya tetrametilrodamin (TRITC) gibi bir florofora konjuge olduğunu belirtmek için floresan IHC. IHC'nin seçiciliği, klinisyenlerin ve araştırmacıların dokular boyunca, çeşitli sağlık ve hastalık durumlarında protein ekspresyonunu ve dağılımını görselleştirmelerini sağlar¹⁰. Klinik alanda, IHC yaygın olarak kanseri teşhis etmek ve çeşitli kanser türlerindeki farklılıkları belirlemek için kullanılır. IHC ayrıca Hepatit B veya C¹¹ gibi vücuttaki farklı mikrobiyal enfeksiyon türlerini doğrulamak için de kullanılmıştır. Biyomedikal araştırmalarda, IHC genellikle dokulardaki protein ekspresyonunu haritalamak için kullanılır ve hastalık durumlarında görülen anormal proteinleri tanımlamada önemlidir. Örneğin, nörodejenerasyona genellikle Alzheimer hastalığında Αβ plakları ve nörofibriler yumaklar gibi beyinde anormal proteinlerin birikmesi eşlik eder. Hayvan modelleri genellikle bu patolojik durumları taklit etmek için geliştirilir ve IHC, araştırmacıların ilgilendikleri proteinleri bulmak ve ölçmek için kullandıkları bir yöntemdir^10,12,13. Buna karşılık, bu hastalıkların nedenleri ve onlarla ortaya çıkan komplikasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.

IHC'nin gerçekleştirilmesinde birçok adım vardır. İlk olarak, ilgilenilen doku toplanır ve boyama için hazırlanır. Muhtemelen çoğu araştırmacı sabit doku örnekleri hazırlar, fiksatifin dolaşım sistemi yoluyla perfüzyonu, morfolojiyi koruduğu için optimal ^14,15'tir. Doku örneklerinin fiksasyonu sonrası da kullanılabilir, ancak ideal sonuçlardan daha az sonuç verebilir¹⁶. Formaldehit gibi çapraz bağlanan fiksatörler, dokudaki proteinler arasında kimyasal bağlar oluşturarak hareket eder¹⁷. Sabit doku daha sonra bir mikrotom kullanılarak çok ince tabakalara veya bölümlere dilimlenir, birçok araştırmacı bir kriyostat kullanarak dondurulmuş bölümleri toplamayı tercih eder. Buradan doku toplanır ve ya doğrudan bir mikroskop slaydına (slayta monte edilmiş yöntem) monte edilir ya da fosfat tamponlu salin (PBS) ¹⁸ gibi bir çözelti içinde askıya alınır (serbest yüzen yöntem). Kullanılan toplama yöntemi, araştırmacının ihtiyaçlarına göre önceden belirlenir ve bu iki yöntemin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar.

Kızağa monte edilen yöntem açık ara en yaygın kullanılanıdır, önemli bir yararı çok ince kesitlerin (10-14 μm) hazırlanabilmesidir, bu da örneğin protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemlidir. Ayrıca, numunenin minimum düzeyde işlenmesi vardır, bu da dokunun yapısal bütünlüğüne potansiyel hasarı azaltır¹⁹. Araştırmacılar genellikle bu tekniği sabit dokuya kıyasla çok hassas olan taze dondurulmuş doku (kuru buz, isopentan vb. kullanılarak hemen dondurulan doku) ile kullanırlar ve numunenin çözülmesini önlemek için çok özen gösterilmesi gerekir. Kızağa monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bir diğer avantajı, boyama için büyük hacimli çözeltilerin genellikle gerekli olmamasıdır⁴. Böylece, araştırmacılar lekeyi tamamlamak için daha az miktarda pahalı antikor veya diğer kimyasalları kullanabilirler. Ek olarak, birkaç farklı deney grubundan bölümleri aynı slayta monte etmek mümkündür, bu da özellikle görüntü yakalama sırasında avantajlı olabilir. Öte yandan, slayda monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır, özellikle doku bölümünün slayda yapıştırılması, böylece bölümün bir tarafına antikor penetrasyonunu kısıtlaması, bu da kesit kalınlığını ve dokunun 3D gösterimini sınırlar. Ayrıca, yıkama sırasında, dokunun kenarlarının ve tüm bölümlerin slayttan ayrılabileceği ve tüm deneyi işe yaramaz hale getirebileceği de olabilir. Dahası, tipik olarak -20 veya -80 ° C'de saklanan, genellikle örtülmüş ve yatay olarak veya slayt kutularında saklanan işlenmemiş slaytlarla antijen epitop ^20,21'in bozulmasını önlemek için slayta monte edilmiş yaklaşım kullanıldığında IHC genellikle nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, bu da nispeten büyük bir depolama ayak izi ile sonuçlanır. Son olarak, slayta monte tekniği, araştırmacıların çok sayıda doku bölümünü işlemek için çok sayıda slaytı ele almaları gerekiyorsa da zaman alıcı olabilir.

Slayta monte edilmiş yöntemi kullanan bu zorlukların bazıları nedeniyle, serbest yüzen yöntem adı verilen bir değişiklik popüler bir alternatif haline gelmiştir. Bu teknik 1960-70'lerde literatüre girdi 22,23,24, 1980'lerde popülerlik kazandı 25,26,27,28,29 ve şimdi ^12,30,31 numaralı slayta yapışmak yerine süspansiyonda toplanan bölümlerdeki lekeyi gerçekleştirmeyi içeren köklü bir yöntemdir. . Doku kesitleri 20 μm'den az olduğunda serbest yüzen yöntem önerilmez; Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, daha kalın (40-50 μm) kesitlerin boyanması gerektiğinde tercih edilen yaklaşımdır. Belirgin bir yararı, antikorların serbest yüzen bölümlere tüm açılardan nüfuz edebilmesi ve daha etkili yıkama nedeniyle daha az arka plan lekelenmesi üretebilmesidir, bu da görüntüleme sırasında daha iyi sinyal vermeyle sonuçlanır. Ek olarak, bölümler işlemden sonra slaytlara monte edilir, böylece doku dekolmanı olasılığını ortadan kaldırır ve kriyostatı işgal eden süreyi azaltır. Serbest yüzen yöntem, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalar için çok daha az emek yoğun olabilir. Örneğin, aynı numuneden birçok (18-40) bölümün aynı kuyuda bir araya getirilmesi mümkündür, bu da hem yıkama hem de antikor inkübasyon adımlarının gerçekleştirilmesinde zaman kazandırır. Ayrıca, bu yaklaşım kullanılarak slayt başına daha fazla sayıda (12-16) bölüm monte edilebildiğinden, araştırmacının bölümleri görüntülemesi ve görüntülemesi genellikle daha uygun ve daha hızlıdır. Özellikle, doku dilimlerinin slaytlara montajı sırasında, istenen yön elde edilene kadar bölümler takılabilir ve ayrılabilir. Araştırmacılar ayrıca serbest yüzen yöntemi kullanarak genellikle biraz daha düşük antikor konsantrasyonları kullanırlar ve inkübasyonlar mikrosantrifüj tüplerinde gerçekleştirildiğinden, antikorlar yeniden kullanım için sodyum azid ile kolayca toplanabilir ve korunabilir (bakınız Adım 5.1). Diğer bir avantaj, kesitlerin kriyoprotektan çözeltisi³² ile küçük mikrosantrifüj tüplerinde -80 ° C'de doğrudan saklanabilmesidir, böylece depolama alanını en aza indirir ve numunelerin ömrünü en üst düzeye çıkarır³³. Bu tekniği kullanmanın bir dezavantajı, bölümlerin çok fazla ele alınması ve bu nedenle hasara yatkın olmasıdır. Bununla birlikte, bu, düşük sallanma ve dönme hızları kullanılarak ve ayrıca araştırmacıları numunelerin nasıl aktarılacağı ve bölümlerin slaytlara nasıl monte edileceği konusunda uygun şekilde eğiterek hafifletilebilir.

Birlikte ele alındığında, IHC hem klinik hem de biyomedikal araştırma alanlarında protein ekspresyonunu görselleştirmek ve lokalize etmek için yerleşik, gerekli bir araçtır. Serbest yüzen IHC, özellikle büyük ölçekli histolojik çalışmalar gerçekleştirirken verimli, esnek ve ekonomik bir yöntemdir. Burada, bilimsel topluluk için kromojenik IHC ve hematoksilin ve eozin veya cresyl violet boyama gibi diğer boyamalar için uygun şekilde uyarlanabilen güvenilir bir serbest yüzen floresan IHC protokolü sunuyoruz.

Protokol

1. Kriyoseksiyon için doku hazırlığı

1. Uygun bir numune matrisi kullanarak bir numune bloğu oluşturmak için sabit dokuları uygun bir gömme kalıbına gömün (bkz. Malzeme Tablosu) ve kuru buz üzerinde dondurun. Numune bloklarını kesitlenmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
   NOT: Sabit dokular tipik olarak, yetişkin (yaklaşık 2,5 – 30 aylık) erkek veya dişi kemirgenlerin (fare veya sıçan)³⁴, mevcut etik izne uygun olarak, uygun bir fiksatif (örneğin% 10 formalin) ile perfüze edilmesiyle, ardından 4 ° C'de 12 saat boyunca aynı fiksatif içinde sabitleme sonrası dokular, 1x PBS ile üç kez yıkanarak hazırlanır. ve dokuları% 15 ve% 30 oranında sakkaroz, gece boyunca veya dokular batana kadar 1x PBS'de^{sakkaroz 35}. Araştırmacılar bu genel protokolü farklı gelişim aşamalarına uyarlamaya çalışabilirler.

2. Kriyoseksiyon

1. Kesitlemeye hazır olduğunda, dokunun parçalanmasını önlemek için kesitlemeden önce kriyostattaki numuneleri en az 1-2 saat iklimlendirin.
2. Bir kriyostat kullanarak, dokuyu bölümlere ayırın (20-50 μm) ve 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş 6 veya 12 delikli eklerde toplayın (bkz.
   NOT: Kesit kalınlığına, ne kadar doku toplanacağına ve kullanılan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak, her kuyu kuyu için yaklaşık 10 ila 40 dilim arasında değişen sayıda kesit içerecektir. Örneğin, tüm beyin 40 μm'de kesitlenirse, 12 delikli ekler kullanılarak her bir kuyuda yaklaşık 18-24 bölüm toplanacaktır. Ayrıca, 20 μm kesitlerin kullanımı biraz zor olabilir, bu nedenle toplu boyama için 40 μm önerilir (bkz.

3. Bölümlerin depolanması

1. Toplandıktan sonra, bölümleri taze hazırlanmış 1x PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
2. Bölümleri 1-1.5 mL depolama çözeltisi ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın (250 mL için, 70 g sakaroz, 75 mL etilen glikol karıştırın ve 0.1 M fosfat tamponu ile hacme getirin).
3. Boyama için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Boyama Günü I

1. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika boyunca dengeleyin.
2. Depolama solüsyonunu bölümlerden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu ucuna dökün.
3. Kuyu ucunu yaklaşık 6 mL 1x TBS içeren başka bir kuyuya taşıyın. RT'de düşük hız kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 1x TBS ile 3 kez yıkayın.
4. Bölümler yıkanırken,% 0.3 Triton X-100 ve% 3 normal serum (örneğin, normal at serumu) ile 1x TBS'den oluşan bir bloke geçirgenlik çözeltisinden 7 mL (numune başına) hazırlayın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca bölümleri engelleyin.
   NOT: Sera ile blokaj, antikorların dokuya veya spesifik olmayan Fc-reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını önler – ikincil antikor türleriyle eşleşen bir serum önerilir, ancak mevcut değilse, birincil antikor konakçı hayvandan farklı bir türden herhangi bir normal serum kullanılabilir. Deterjan Triton X-100, dokuyu geçirgenleştirerek daha iyi antikor penetrasyonu sağlar.
5. % 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum ile 1x TBS'de seçilmiş birincil antikordan (uygun şekilde seyreltilmiş) oluşan primer antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın (bakınız Adım 4.4 Not). Kuyu girişinden kesitleri, ilgilenilen antijen (ler) e bağlanmak için birincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   NOT: Birden fazla primer antikor kullanılabilir (farklı konakçı türlerde üretilir).
6. Düşük hız (örneğin, 7 rpm hız) kullanan döner bir karıştırıcı üzerine kesitli 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.

5. Boyama Günü II

1. Ertesi gün, bölümleri birincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.
   NOT: Antikor çözeltisi toplanabilir ve tekrar kullanılabilir; mikrobiyal büyümeyi inhibe etmek için% 0.02 (w / v) sodyum azid ekleyin.
2. RT'de 1x TBS ile bölümleri 3 kez yıkayın (ilk 2 yıkama için 30 s ve son yıkama için 10 dakika).
3. % 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum (ışıktan kalkan çözeltisi) ile 1x TBS'de uygun sekonder antikordan (buna göre seyreltilmiş) oluşan ikincil antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın.
   NOT: Konjuge sekonder antikor ile dolaylı etiketleme, sinyali yükseltir ve protein hedefinin kolorimetrik veya floresan görselleştirmesine izin verir.
4. Kesitleri ikincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan kalkan çözeltisi).
5. Bölümleri ikincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.
6. Numuneleri ışıktan korumaya devam ederek, RT'de 30 s için 1x TBS ile 2 kez yıkayın. Daha sonra 1x TBS'de 15 dakika yıkayın, isterseniz DAPI (1-0.1 μg / ml) ekleyin.

6. Montaj

1. Bölümleri bir bardağa dökün, dikdörtgen histolojik oda dörtte üçünü 1x TBS ile doldurun.
2. Bir cam slaytı 1x TBS'ye batırın ve bölümleri slayda doğru koaksiyel hale getirmek için ince bir boya fırçası kullanın.
3. Bölümlere slaytın üzerine hafifçe dokunarak kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olun.
4. Tüm bölümler slayt(lar)a monte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
   NOT: Örneğin, tüm bir beyin 40 μm'de kesitlendiğinde, 18-24 bölüm içeren bir aliquot ile 12 kuyucuklu eklerde toplandığında; dilimler tipik olarak 1-2 slayta monte edilir, ancak araştırmacının tercihine bağlı olarak slayt başına daha az bölüm de monte edilebilir.

7. Kapak kaydırma

1. Kesitler slayt(lar)ın üzerine kurutulduktan sonra, RT'de yaklaşık 10-15 dakika veya kesitler opak görünene kadar (slaytları ışıktan korumayı unutmayın), uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın (sertleştirme veya sertleştirmeyen). Antifading, floresan konjuge sekonder antikor kullanılıyorsa tercih edilir.
   NOT: Sertleştirme montaj ortamı kullanılırken floresan kalitesi daha düşük olabilir, ancak kızaklar daha uzun süre dayanmalıdır.
2. Cımbız kullanarak, ortamın üstüne bir kapak parçası yerleştirin. Kapağı filtre kağıdıyla örtün ve fazla montaj ortamını çıkarmak için sıkıca bastırın.
   NOT: Sertleşmeyen bir montaj parçası kullanıyorsanız, kapağın kaydırılmış sürgüsünün kenarlarını sızdırmaz hale getirmek için şeffaf oje ile boyayın.
3. Uygun bir mikroskop kullanarak görüntü bölümleri. 4 °C'de karanlık bir slayt kutusunda saklayın.
   NOT: Bölümler, lazer tarama konfokal ve ters veya dik geniş alan floresansı gibi çeşitli mikroskoplar kullanılarak, araştırmacının ihtiyaçlarına göre büyütmelerde (örneğin, 10x, 20x, 40x) görüntülenebilir.

Sonuçlar

Bir floresan immünohistokimyasal tahlil gerçekleştirmek için serbest yüzen yöntemin kullanılmasının genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ekspresyonunu inceleyen fare beyninde serbest yüzen yöntemi kullanan floresan IHC'nin temsili örneği, boyamanın genel kalitesini göstermek için Şekil 2'de hem daha düşük hem de daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Bu yaklaşım, Şekil 3...

Tartışmalar

İmmünohistokimya (IHC), doku kesitlerinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tanımlamada çok önemli hale gelen çok yönlü bir tekniktir. Bu tahlil, normal fonksiyon aşamalarından hastalık durumlarına kadar dokunun özelliklerini daha iyi anlamak için bilimsel topluluk genelinde kullanılır. IHC, kanser gibi hastalıkların klinik teşhisinden klinik öncesi araştırmalardaki ilk keşiflere kadar çeşitli alanlarda kullanılmaktadır^10,36.

...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042