Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Riepilogo

La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

Abstract

L'immunoistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche strutture tissutali, nonché l'espressione e la localizzazione delle proteine. Due approcci alternativi sono ampiamente utilizzati per gestire le sezioni di tessuto durante la procedura di colorazione, un approccio consiste nel montare le sezioni direttamente su vetrini, mentre un secondo approccio, il free-floating, consente di mantenere e colorare le sezioni fisse mentre sono sospese in soluzione. Sebbene gli approcci montati su scorrimento e fluttuanti possano produrre risultati simili, la tecnica free-floating consente una migliore penetrazione degli anticorpi e quindi dovrebbe essere il metodo di scelta quando sezioni più spesse devono essere utilizzate per la ricostruzione 3D dei tessuti, ad esempio quando l'obiettivo dell'esperimento è ottenere informazioni sulle proiezioni dendritiche e assonali nelle regioni del cervello. Inoltre, poiché le sezioni sono mantenute in soluzione, una singola aliquota può facilmente ospitare da 30 a 40 sezioni, la cui gestione è meno laboriosa, in particolare negli studi biomedici su larga scala. Qui, illustriamo come applicare il metodo free-floating alla colorazione immunoistochimica fluorescente, con particolare attenzione alle sezioni cerebrali. Discuteremo anche di come la tecnica del flottante libero possa essere facilmente modificata per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori e adattata ad altri tessuti, nonché ad altre colorazioni a base istochimica, come l'ematossilina e l'eosina e il violetto cresilico, purché i campioni di tessuto siano correttamente fissati, tipicamente con paraformaldeide o formalina.

Introduzione

L'immunocolorazione è una pratica di ricerca popolare iniziata 130 anni fa con la scoperta degli anticorpi sierici nel 1890 da parte di Von Behring¹. Durante i primi anni del 20^° secolo, i coloranti furono attaccati agli antigeni e successivamente agli anticorpi come un modo per quantificare e visualizzare le reazioni¹, e nel 1941 Albert Coons sviluppò le prime etichette di anticorpi fluorescenti, una scoperta che rivoluzionò la microscopia ottica ^2,3. Il termine "immunocolorazione" comprende molte tecniche che sono state sviluppate utilizzando questo principio, tra cui Western blot, citometria a flusso, ELISA, immunocitochimica e immunoistochimica ^3,4. Western blot rileva la presenza di proteine specifiche da estratti tissutali o cellulari⁵. Le proteine vengono separate per dimensione utilizzando l'elettroforesi su gel, trasferite su una membrana e sondate utilizzando anticorpi. Questa tecnica indica la presenza di proteine e quanta proteina è presente; Tuttavia, non rivela alcuna informazione sulla localizzazione della proteina all'interno di cellule o tessuti. Un altro metodo, l'immunocitochimica (ICC), etichetta le proteine all'interno delle cellule, tipicamente cellule coltivate in vitro. ICC mostra sia l'espressione proteica che la localizzazione all'interno dei compartimenti cellulari⁶. Per rilevare e visualizzare una proteina specifica a livello tissutale, viene utilizzata l'immunoistochimica (IHC).

IHC è un metodo che i ricercatori utilizzano per colpire antigeni specifici all'interno del tessuto, sfruttando le proprietà chimiche del sistema immunitario ^7,8. Generando anticorpi primari e secondari specifici legati a un enzima o a un colorante fluorescente, gli antigeni di interesse possono essere marcati e rivelati nella maggior parte dei tessuti (come esaminato in Mepham e Britten)⁹. Il termine "immunoistochimica" di per sé non specifica il metodo di etichettatura utilizzato per rivelare l'antigene di interesse; pertanto, questa terminologia è spesso combinata con la tecnica di rilevamento per delineare chiaramente il metodo di etichettatura: immunoistochimica cromogenica (CIH) per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un enzima, come la perossidasi; o IHC fluorescente per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un fluoroforo, come l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selettività dell'IHC consente a medici e ricercatori di visualizzare l'espressione e la distribuzione delle proteine in tutti i tessuti, attraverso vari stati di salute e malattia¹⁰. Nel regno clinico, IHC è comunemente usato per diagnosticare il cancro, così come per determinare le differenze in vari tipi di cancro. IHC è stato utilizzato anche per confermare diversi tipi di infezioni microbiche all'interno del corpo, come l'epatite B o C¹¹. Nella ricerca biomedica, l'IHC è spesso usato per mappare l'espressione proteica nei tessuti ed è importante nell'identificare le proteine anormali osservate negli stati patologici. Ad esempio, la neurodegenerazione è spesso accompagnata dall'accumulo di proteine anormali nel cervello, come placche αβ e grovigli neurofibrillari nella malattia di Alzheimer. I modelli animali sono spesso sviluppati per imitare questi stati patologici, e IHC è un metodo che i ricercatori usano per localizzare e quantificare le proteine di interesse^10,12,13. A sua volta, possiamo saperne di più sulle cause di queste malattie e sulle complicazioni che sorgono con loro.

Ci sono molti passaggi coinvolti nell'esecuzione di IHC. In primo luogo, il tessuto di interesse viene raccolto e preparato per la colorazione. Probabilmente la maggior parte dei ricercatori prepara campioni di tessuto fissi, con la perfusione del fissativo attraverso il sistema circolatorio che è ottimale in quanto conserva la morfologia^14,15. Può essere utilizzata anche la post-fissazione di campioni di tessuto, ma può produrre risultati non ideali¹⁶. I fissativi reticolanti, come la formaldeide, agiscono creando legami chimici tra le proteine nel tessuto¹⁷. Il tessuto fisso viene quindi tagliato in strati o sezioni molto sottili usando un microtomo, con molti ricercatori che preferiscono raccogliere sezioni congelate usando un criostato. Da lì il tessuto viene raccolto e montato direttamente su un vetrino da microscopio (metodo montato su vetrino) o sospeso in una soluzione (metodo free-floating), come la soluzione salina tamponata fosfato (PBS)¹⁸. Il metodo di raccolta utilizzato è predeterminato in base alle esigenze del ricercatore, con ciascuno di questi due metodi che presenta i propri vantaggi e svantaggi.

Il metodo montato su slitta è di gran lunga il più comunemente usato, con un importante vantaggio che possono essere preparate sezioni molto sottili (10-14 μm), il che è importante, ad esempio, per studiare le interazioni proteina-proteina. C'è anche una manipolazione minima del campione, che riduce i potenziali danni all'integrità strutturale del tessuto¹⁹. I ricercatori usano spesso questa tecnica con tessuto fresco congelato (tessuto che viene immediatamente congelato usando ghiaccio secco, isopentano, ecc.), che è molto delicato rispetto al tessuto fisso e deve essere presa molta attenzione per evitare lo scongelamento del campione. Un altro vantaggio dell'utilizzo di sezioni montate su scorrimento è che di solito non sono richiesti grandi volumi di soluzioni per la colorazione⁴. Pertanto, i ricercatori possono utilizzare una quantità minore di anticorpi costosi o altre sostanze chimiche per completare la macchia. Inoltre, è possibile montare sezioni di diversi gruppi sperimentali sulla stessa diapositiva, il che può essere vantaggioso, specialmente durante l'acquisizione delle immagini. D'altra parte, ci sono alcuni svantaggi nell'utilizzo di sezioni montate su slitta, in particolare che la sezione di tessuto è aderente al vetrino, limitando così la penetrazione degli anticorpi su un lato della sezione, che limita lo spessore della sezione e la rappresentazione 3D del tessuto. Può anche accadere che durante i lavaggi, i bordi del tessuto e intere sezioni possano staccarsi dal vetrino, rendendo inutile l'intero esperimento. Inoltre, l'IHC di solito deve essere eseguita in tempi relativamente brevi quando si utilizza l'approccio montato su vetrino per evitare la degradazione dell'epitopo dell'antigene 20,21 con vetrini non trasformati tipicamente conservati a -²⁰ o -⁸⁰ °C, spesso coperti e conservati orizzontalmente o in scatole di scorrimento^, con conseguente ingombro di stoccaggio relativamente grande. Infine, la tecnica di montaggio su slitta può anche richiedere molto tempo se i ricercatori devono gestire un gran numero di vetrini per elaborare un gran numero di sezioni di tessuto.

A causa di alcune di queste sfide utilizzando il metodo montato su slitta, una modifica chiamata metodo free-floating è diventata un'alternativa popolare. Questa tecnica è entrata in letteratura negli anni 1960-70 22,23,24, guadagnando popolarità negli anni 1980 25,26,27,28,29, ed è ora un metodo consolidato che prevede l'esecuzione della macchia sulle sezioni raccolte in sospensione piuttosto che aderire a una diapositiva ^12,30,31 . Il metodo free-floating non è raccomandato quando le sezioni di tessuto sono inferiori a 20 μm; Tuttavia, nella nostra esperienza è l'approccio di scelta quando le sezioni più spesse (40-50 μm) devono essere colorate. Un chiaro vantaggio è che gli anticorpi possono penetrare sezioni fluttuanti da tutte le angolazioni e generare meno colorazione dello sfondo grazie a un lavaggio più efficace, il tutto con conseguente migliore segnalazione durante l'imaging. Inoltre, le sezioni vengono montate sui vetrini dopo la lavorazione, eliminando così la possibilità di distacco del tessuto e diminuendo il tempo di occupazione del criostato. Il metodo free-floating può anche essere molto meno laborioso, specialmente per studi biomedici su larga scala. Ad esempio, è possibile colorare molte sezioni (18-40) dello stesso campione insieme nello stesso pozzetto, risparmiando tempo nell'esecuzione sia del lavaggio che delle fasi di incubazione degli anticorpi. Inoltre, poiché un numero maggiore (12-16) di sezioni può essere montato per diapositiva utilizzando questo approccio, è spesso più conveniente e veloce per il ricercatore visualizzare e visualizzare le sezioni. In particolare, durante il montaggio di fette di tessuto sui vetrini, le sezioni possono essere attaccate e staccate fino ad ottenere l'orientamento desiderato. I ricercatori usano spesso anche concentrazioni leggermente inferiori di anticorpi usando il metodo del flottante e, poiché le incubazioni vengono eseguite in provette da microcentrifuga, gli anticorpi possono essere facilmente raccolti e conservati con azoturo di sodio per il riutilizzo (vedi Passo 5.1). Un altro vantaggio è che le sezioni possono essere conservate direttamente a -80 °C in piccole provette di microcentrifuga con soluzione crioprotettiva³², riducendo così al minimo lo spazio di stoccaggio e massimizzando la longevità dei campioni³³. Uno svantaggio dell'utilizzo di questa tecnica è che le sezioni vengono gestite molto e quindi sono suscettibili di danneggiarsi. Questo, tuttavia, può essere mitigato utilizzando basse velocità di scuotimento e rotazione, nonché formando adeguatamente i ricercatori su come trasferire i campioni e montare le sezioni sui vetrini.

Nel loro insieme, IHC è uno strumento consolidato ed essenziale per visualizzare e localizzare l'espressione proteica sia nel campo della ricerca clinica che biomedica. L'IHC fluttuante è un metodo efficiente, flessibile ed economico, specialmente quando si eseguono studi istologici su larga scala. Qui, presentiamo un protocollo IHC fluorescente affidabile per la comunità scientifica che può essere adattato di conseguenza per IHC cromogenico e altre colorazioni come l'ematossilina e l'eosina o la colorazione viola cresilico.

Protocollo

1. Preparazione tissutale per criosezione

1. Incorporare tessuti fissi in uno stampo di incorporamento appropriato (vedi Tabella dei materiali) per creare un blocco di campioni utilizzando una matrice di campioni appropriata (vedi Tabella dei materiali) e congelare su ghiaccio secco. Conservare i blocchi di campioni a -80 °C fino al momento della sezione.
   NOTA: I tessuti fissi sono tipicamente preparati perfondendo roditori maschi o femmine adulti (di circa 2,5 – 30 mesi) (topo o ratto)³⁴, in conformità con il permesso etico disponibile, con un fissativo appropriato (ad esempio formalina al 10%), seguito da tessuti post-fissaggio nello stesso fissativo per 12 ore a 4 °C, lavando i tessuti tre volte con 1x PBS, e mettendo i tessuti nel 15% e poi nel 30% di saccarosio in 1x PBS per una notte o fino a quando i tessuti affondano³⁵. I ricercatori possono cercare di adattare questo protocollo generale alle diverse fasi di sviluppo.

2. Criosezione

1. Quando sono pronti per la sezione, acclimatare i campioni nel criostato per almeno 1-2 ore prima del sezionamento per prevenire la frantumazione del tessuto.
2. Utilizzando un criostato, tagliare il tessuto in sezioni (20-50 μm) e raccogliere in inserti da 6 o 12 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) riempiti con 1x soluzione PBS.
   NOTA: A seconda dello spessore della sezione, della quantità di tessuto da raccogliere e del numero di inserti del pozzo utilizzati, ogni pozzetto conterrà un numero variabile di sezioni che vanno da circa 10 a 40 fette per pozzo. Ad esempio, se un intero cervello è sezionato a 40 μm, circa 18-24 sezioni saranno raccolte in ciascun pozzetto utilizzando inserti a 12 pozzetti. Inoltre, le sezioni da 20 μm possono essere piuttosto difficili da gestire, quindi si consiglia di 40 μm per la colorazione di massa (vedi Discussione).

3. Memorizzazione delle sezioni

1. Una volta raccolte, lavare le sezioni con 1x PBS appena preparato per 5 minuti. Ripeti 3 volte.
2. Trasferire le sezioni in provette da microcentrifuga da 2 mL riempite con 1-1,5 mL di soluzione di stoccaggio (per 250 mL, mescolare 70 g di saccarosio, 75 mL di glicole etilenico e portare a volume con tampone fosfato 0,1 M).
3. Conservare a -80 °C fino al momento della colorazione.

4. Giorno di colorazione I

1. Prelevare i campioni dal congelatore ed equilibrarli a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 minuti.
2. Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare la soluzione di stoccaggio dalle sezioni.
3. Spostare l'inserto del pozzetto in un altro pozzetto contenente circa 6 ml di 1x TBS. Lavare 3 volte con 1x TBS per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale usando bassa velocità a RT.
4. Durante il lavaggio delle sezioni, preparare 7 ml (per campione) di una soluzione bloccante-permeabilizzante costituita da 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale al 3% (ad es. siero di cavallo normale). Bloccare le sezioni per 30 minuti a RT sullo shaker orbitale, utilizzando la bassa velocità.
   NOTA: Il blocco con i sieri impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai tessuti o ai recettori Fc non specifici – si raccomanda un siero corrispondente alla specie dell'anticorpo secondario, ma se non disponibile, può essere utilizzato qualsiasi siero normale di una specie diversa dall'animale ospite dell'anticorpo primario. Il detergente Triton X-100 consente una migliore penetrazione degli anticorpi permeabilizzando il tessuto.
5. Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale primaria costituita da anticorpi primari selezionati (diluiti in modo appropriato) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (vedere la nota del punto 4.4). Trasferire le sezioni dal pozzetto inserite in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale primaria per legarsi all'antigene o agli antigeni di interesse.
   NOTA: Possono essere utilizzati più anticorpi primari (generati in diverse specie ospiti).
6. Posizionare una provetta da microcentrifuga da 2 mL con sezioni su un miscelatore rotante a bassa velocità (ad esempio, velocità 7 rpm) e incubare per una notte per 12-16 ore a 4 °C.

5. Colorazione Giorno II

1. Il giorno seguente, versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale primaria.
   NOTA: La soluzione anticorpale può essere raccolta e riutilizzata; Aggiungere 0,02% (p/v) di azoturo di sodio per inibire la crescita microbica.
2. Lavare le sezioni 3 volte con 1x TBS a RT (30 s per i primi 2 lavaggi e 10 minuti per il lavaggio finale).
3. Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale secondaria costituita da un anticorpo secondario appropriato (diluito di conseguenza) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (soluzione di schermatura dalla luce).
   NOTA: La marcatura indiretta con un anticorpo secondario coniugato amplifica il segnale e consente la visualizzazione colorimetrica o fluorescente del bersaglio proteico.
4. Trasferire le sezioni in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale secondaria. Incubare per 2 ore a RT su agitatore orbitale a bassa velocità (soluzione di schermatura dalla luce).
5. Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale secondaria.
6. Continuando a schermare i campioni dalla luce, lavare 2 volte con 1x TBS per 30 s a RT. Quindi lavare per 15 minuti in 1x TBS, aggiungere DAPI (1-0,1 μg / ml) se lo si desidera.

6. Montaggio

1. Versare le sezioni in una camera istologica rettangolare di vetro riempita per tre quarti con 1x TBS.
2. Immergere un vetrino in 1x TBS e utilizzare un pennello fine per convincere le sezioni verso la diapositiva.
3. Picchiettare delicatamente le sezioni sulla diapositiva, assicurandosi che non ci siano rughe o pieghe.
4. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le sezioni sono montate sulle diapositive.
   NOTA: Quando un intero cervello, ad esempio, è sezionato a 40 μm, raccolto in 12 pozzetti si inserisce con un'aliquota contenente 18-24 sezioni; Le sezioni sono in genere montate su 1-2 diapositive, ma è possibile montare anche meno sezioni per diapositiva a seconda delle preferenze del ricercatore.

7. Scivolamento di copertura

1. Dopo che le sezioni sono state asciugate sui vetrini, circa 10-15 minuti a RT o fino a quando le sezioni appaiono opache (ricordarsi di schermare i vetrini dalla luce), applicare un mezzo di montaggio acquoso appropriato (indurimento o non indurimento). L'antisbiadimento è preferibile se si utilizza un anticorpo secondario coniugato fluorescente.
   NOTA: la qualità della fluorescenza può essere inferiore quando si utilizza un mezzo di montaggio di indurimento, ma le guide dovrebbero durare più a lungo.
2. Usando una pinzetta, posiziona un coprislip sopra il mezzo. Coprire con carta da filtro e premere con decisione per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso.
   NOTA: Se si utilizza un supporto non indurente, dipingere i bordi della slitta coperta con smalto trasparente per sigillare.
3. Sezioni di immagini utilizzando un microscopio appropriato. Conservare in una scatola scura a 4 °C.
   NOTA: Le sezioni possono essere visualizzate utilizzando una varietà di microscopi, come la scansione laser confocale e la fluorescenza a campo largo invertita o verticale, ad ingrandimenti (ad esempio, 10x, 20x, 40x) in base alle esigenze del ricercatore.

Risultati

Lo schema generale dell'utilizzo del metodo free-floating per eseguire un test immunoistochimico fluorescente è illustrato nella Figura 1. Un esempio rappresentativo di IHC fluorescente che utilizza il metodo del fluttuante nel cervello di topo che esamina l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è mostrato nella Figura 2 sia a ingrandimento inferiore che superiore per illustrare la qualità complessiva della colorazione. Questo approccio è...

Discussione

L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica versatile che è diventata cruciale nell'identificazione dell'espressione e della localizzazione delle proteine all'interno delle sezioni tissutali. Questo test viene utilizzato in tutta la comunità scientifica per comprendere ulteriormente le caratteristiche del tessuto attraverso le fasi della normale funzione fino agli stati di malattia. IHC è impiegato in una varietà di campi dalla diagnosi clinica di malattie come il cancro alle scoperte iniziali nella ricerca preclinica

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042