Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement

Résumé

La technique de flottaison libre permet aux chercheurs d’effectuer des colorations histologiques, y compris l’immunohistochimie, sur des coupes de tissus fixes afin de visualiser les structures biologiques, le type cellulaire et l’expression et la localisation des protéines. Il s’agit d’une technique histochimique efficace et fiable qui peut être utile pour étudier une multitude de tissus, tels que le cerveau, le cœur et le foie.

Résumé

L’immunohistochimie est une technique largement utilisée pour visualiser des structures tissulaires spécifiques ainsi que l’expression et la localisation des protéines. Deux approches alternatives sont largement utilisées pour manipuler les sections de tissu pendant la procédure de coloration, une approche consiste à monter les sections directement sur des lames de verre, tandis qu’une seconde approche, la flottante, permet de maintenir et de colorer les sections fixes en suspension. Bien que les approches montées sur glissière et flottantes puissent donner des résultats similaires, la technique de flottaison libre permet une meilleure pénétration des anticorps et devrait donc être la méthode de choix lorsque des sections plus épaisses doivent être utilisées pour la reconstruction 3D des tissus, par exemple lorsque l’objectif de l’expérience est d’obtenir des informations sur les projections dendritiques et axonales dans les régions du cerveau. De plus, comme les sections sont maintenues en solution, une seule partie aliquote peut facilement accueillir 30 à 40 sections, dont la manipulation est moins laborieuse, notamment dans les études biomédicales à grande échelle. Ici, nous illustrons comment appliquer la méthode de flottaison libre à la coloration immunohistochimique fluorescente, en mettant l’accent sur les sections du cerveau. Nous discuterons également de la façon dont la technique de flottaison libre peut facilement être modifiée pour répondre aux besoins individuels des chercheurs et adaptée à d’autres tissus ainsi qu’à d’autres colorations histochimiques, telles que l’hématoxyline, l’éosine et le violet de crésyle, à condition que les échantillons de tissus soient correctement fixés, généralement avec du paraformaldéhyde ou du formol.

Introduction

L’immunomarquage est une pratique de recherche populaire qui a commencé il y a 130 ans avec la découverte des anticorps sériques en 1890 par Von Behring¹. Au début du 20e^siècle, des colorants ont été attachés à des antigènes et plus tard à des anticorps afin de quantifier et de visualiser les réactions¹, et en 1941 Albert Coons a développé les premiers marqueurs d’anticorps fluorescents, une découverte qui a révolutionné la microscopie optique ^2,3. Le terme « immunomarquage » englobe de nombreuses techniques qui ont été développées en utilisant ce principe, y compris le transfert Western, la cytométrie en flux, l’ELISA, l’immunocytochimie et l’immunohistochimie ^3,4. Le transfert Western détecte la présence de protéines spécifiques provenant d’extraits tissulaires ou cellulaires⁵. Les protéines sont séparées par taille à l’aide d’une électrophorèse sur gel, transférées sur une membrane et sondées à l’aide d’anticorps. Cette technique indique la présence de protéines et la quantité de protéines présentes; Cependant, il ne révèle aucune information sur la localisation de la protéine dans les cellules ou les tissus. Une autre méthode, l’immunocytochimie (ICC), marque les protéines dans les cellules, généralement des cellules cultivées in vitro. ICC montre à la fois l’expression et la localisation des protéines dans les compartiments cellulaires⁶. Pour détecter et visualiser une protéine spécifique au niveau tissulaire, l’immunohistochimie (IHC) est utilisée.

IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour cibler des antigènes spécifiques dans les tissus, en tirant parti des propriétés chimiques du système immunitaire ^7,8. En générant des anticorps primaires et secondaires spécifiques liés à une enzyme ou à un colorant fluorescent, les antigènes d’intérêt peuvent être marqués et révélés dans la plupart des tissus (comme indiqué dans Mepham et Britten)⁹. Le terme « immunohistochimie » en lui-même ne précise pas la méthode de marquage utilisée pour révéler l’antigène d’intérêt; ainsi, cette terminologie est souvent combinée avec la technique de détection pour délimiter clairement la méthode de marquage : immunohistochimie chromogène (ICH) pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme, telle que la peroxydase ; ou IHC fluorescent pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore, tel que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la tétraméthylrhodamine (TRITC). La sélectivité de l’IHC permet aux cliniciens et aux chercheurs de visualiser l’expression et la distribution des protéines dans les tissus, à travers divers états de santé et de maladie¹⁰. Dans le domaine clinique, IHC est couramment utilisé pour diagnostiquer le cancer, ainsi que pour déterminer les différences dans divers types de cancer. IHC a également été utilisé pour confirmer différents types d’infections microbiennes dans le corps, telles que l’hépatite B ou C¹¹. Dans la recherche biomédicale, l’IHC est souvent utilisé pour cartographier l’expression des protéines dans les tissus et est important pour identifier les protéines anormales observées dans les états pathologiques. Par exemple, la neurodégénérescence s’accompagne souvent d’une accumulation de protéines anormales dans le cerveau, telles que des plaques Αβ et des enchevêtrements neurofibrillaires dans la maladie d’Alzheimer. Des modèles animaux sont souvent développés pour imiter ces états pathologiques, et IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour localiser et quantifier les protéines d’intérêt^10,12,13. À notre tour, nous pouvons en apprendre davantage sur les causes de ces maladies et les complications qui en découlent.

L’exécution de l’IHC comporte de nombreuses étapes. Tout d’abord, le tissu d’intérêt est recueilli et préparé pour la coloration. On peut soutenir que la plupart des chercheurs préparent des échantillons de tissus fixes, la perfusion du fixateur via le système circulatoire étant optimale car elle préserve la morphologie^14,15. La post-fixation d’échantillons de tissus peut également être utilisée, mais peut donner des résultats inférieurs à l’idéal¹⁶. Les fixateurs de réticulation, tels que le formaldéhyde, agissent en créant des liaisons chimiques entre les protéines du tissu¹⁷. Les tissus fixes sont ensuite découpés en couches ou sections très minces à l’aide d’un microtome, de nombreux chercheurs préférant collecter des sections congelées à l’aide d’un cryostat. De là, le tissu est recueilli et soit monté directement sur une lame de microscope (méthode montée sur lame), soit suspendu dans une solution (méthode flottante), telle qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)¹⁸. La méthode de collecte utilisée est prédéterminée en fonction des besoins du chercheur, chacune de ces deux méthodes présentant ses propres avantages et inconvénients.

La méthode montée sur lame est de loin la plus couramment utilisée, avec un avantage important étant que des sections très minces (10-14 μm) peuvent être préparées, ce qui est important, par exemple, pour étudier les interactions protéine-protéine. La manipulation de l’échantillon est également minimale, ce qui réduit les dommages potentiels à l’intégrité structurelle du tissu¹⁹. Les chercheurs utilisent souvent cette technique avec des tissus frais congelés (tissus immédiatement congelés à l’aide de glace sèche, d’isopentane, etc.), ce qui est très délicat par rapport aux tissus fixes et il faut prendre beaucoup de précautions pour empêcher la décongélation de l’échantillon. Un autre avantage de l’utilisation de sections montées sur glissière est que de grands volumes de solutions pour la coloration ne sont généralement pas nécessaires⁴. Ainsi, les chercheurs peuvent utiliser une plus petite quantité d’anticorps coûteux ou d’autres produits chimiques pour compléter la coloration. De plus, il est possible de monter des sections de plusieurs groupes expérimentaux différents sur la même diapositive, ce qui peut être avantageux, en particulier lors de l’acquisition d’images. D’autre part, l’utilisation de sections montées sur lame présente certains inconvénients, notamment le fait que la section de tissu est collée à la lame, limitant ainsi la pénétration des anticorps d’un côté de la section, ce qui limite l’épaisseur de la section et la représentation 3D du tissu. Il peut également arriver que pendant les lavages, les bords du tissu et des sections entières se détachent de la lame, rendant inutile toute l’expérience. De plus, l’IHC doit généralement être effectuée relativement rapidement lors de l’utilisation de l’approche montée sur lame pour éviter la dégradation de l’épitope de l’antigène 20,21 avec des lames non traitées généralement stockées à -²⁰ ou -⁸⁰ ° C, souvent glissées et stockées horizontalement ou dans des boîtes à lames^, ce qui entraîne un encombrement de stockage relativement important. Enfin, la technique montée sur lame peut également prendre beaucoup de temps si les chercheurs doivent manipuler un grand nombre de lames pour traiter un grand nombre de sections de tissus.

En raison de certains de ces défis utilisant la méthode montée sur glissière, une modification appelée méthode flottante est devenue une alternative populaire. Cette technique est entrée dans la littérature dans les années 1960-70 22,23,24, gagnant en popularité dans les années 1980 25,26,27,28,29, et est maintenant une méthode bien établie qui consiste à effectuer la coloration sur les sections collectées en suspension plutôt que d’adhérer à une lame ^12,30,31 . La méthode de flottaison libre n’est pas recommandée lorsque les coupes de tissu sont inférieures à 20 μm; Cependant, d’après notre expérience, c’est l’approche de choix lorsque des sections plus épaisses (40-50 μm) doivent être colorées. Un avantage distinct est que les anticorps peuvent pénétrer les sections flottantes sous tous les angles et générer moins de coloration de fond en raison d’un lavage plus efficace, ce qui entraîne une meilleure signalisation lors de l’imagerie. De plus, les sections sont montées sur les lames après le traitement, éliminant ainsi la possibilité de détachement des tissus et réduisant le temps d’occupation du cryostat. La méthode de flottaison libre peut également être beaucoup moins exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études biomédicales à grande échelle. Par exemple, il est possible de colorer plusieurs sections (18-40) du même échantillon dans le même puits, ce qui permet de gagner du temps dans les étapes de lavage et d’incubation des anticorps. De plus, étant donné qu’un plus grand nombre (12-16) de sections peuvent être montées par diapositive en utilisant cette approche, il est souvent plus pratique et plus rapide pour le chercheur de visualiser et d’imager les sections. Notamment, lors du montage des tranches de tissu sur les lames, les sections peuvent être attachées et détachées jusqu’à ce que l’orientation souhaitée soit obtenue. Les chercheurs utilisent aussi souvent des concentrations légèrement inférieures d’anticorps en utilisant la méthode de flottaison libre, et comme les incubations sont effectuées dans des tubes de microcentrifugation, les anticorps peuvent être facilement recueillis et conservés avec de l’azoture de sodium pour la réutilisation (voir l’étape 5.1). Un autre avantage est que les sections peuvent être directement stockées à -80 °C dans de petits tubes microcentrifugés avec une solution cryoprotectrice³², minimisant ainsi l’espace de stockage et maximisant la longévité des échantillons³³. Un inconvénient de l’utilisation de cette technique est que les sections sont beaucoup manipulées et sont donc susceptibles d’être endommagées. Cependant, cela peut être atténué en utilisant de faibles vitesses d’agitation et de rotation ainsi qu’en formant correctement les chercheurs à transférer les échantillons et à monter les sections sur les lames.

Pris ensemble, IHC est un outil établi et essentiel pour visualiser et localiser l’expression des protéines dans les domaines de la recherche clinique et biomédicale. L’IHC flottant est une méthode efficace, flexible et économique, en particulier lors de la réalisation d’études histologiques à grande échelle. Ici, nous présentons un protocole IHC fluorescent flottant fiable pour la communauté scientifique qui peut être adapté en conséquence pour l’IHC chromogène et d’autres colorations telles que l’hématoxyline et l’éosine ou la coloration au violet de crésyle.

Protocole

1. Préparation tissulaire pour la cryosectionnement

1. Incorporer les tissus fixes dans un moule d’encastrement approprié (voir le tableau des matériaux) pour créer un bloc d’échantillon à l’aide d’une matrice d’échantillons appropriée (voir le tableau des matériaux) et congeler sur de la glace sèche. Conserver les blocs d’échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être sectionnés.
   NOTE: Les tissus fixes sont généralement préparés par des rongeurs adultes (environ 2,5 à 30 mois) mâles ou femelles (souris ou rat)³⁴, conformément au permis éthique disponible, avec un fixateur approprié (par exemple 10% de formol), suivi de post-fixation dans le même fixateur pendant 12 h à 4 °C, en lavant les mouchoirs trois fois avec 1x PBS, et placer les tissus dans 15% puis 30% de saccharose dans 1x PBS pour la nuit ou jusqu’à ce que les tissus coulent³⁵. Les chercheurs peuvent essayer d’adapter ce protocole général à différents stades de développement.

2. Cryosectionnement

1. Lorsque vous êtes prêt à sectionner, acclimater les échantillons dans le cryostat pendant au moins 1 à 2 heures avant la section, afin d’éviter l’éclatement des tissus.
2. À l’aide d’un cryostat, couper le tissu en sections (20-50 μm) et recueillir dans des inserts de 6 ou 12 puits (voir le tableau des matériaux) remplis de 1x solution de PBS.
   REMARQUE : Selon l’épaisseur de la section, la quantité de tissu à recueillir et le nombre d’inserts de puits utilisés, chaque puits contiendra un nombre variable de sections allant d’environ 10 à 40 tranches pour le puits. Par exemple, si un cerveau entier est sectionné à 40 μm, environ 18 à 24 sections seront collectées dans chaque puits à l’aide d’inserts de 12 puits. De plus, les sections de 20 μm peuvent être quelque peu difficiles à manipuler, c’est pourquoi 40 μm sont recommandés pour la coloration en vrac (voir Discussion).

3. Stockage des sections

1. Une fois recueillies, laver les sections avec 1x PBS fraîchement préparé pendant 5 min. Répétez 3 fois.
2. Transférer les sections dans des tubes microcentrifugés de 2 mL remplis de 1 à 1,5 mL de solution de stockage (pour 250 mL, mélanger 70 g de saccharose, 75 mL d’éthylène glycol et porter au volume avec un tampon phosphate de 0,1 M).
3. Conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être taché.

4. Jour de coloration I

1. Retirer les échantillons du congélateur et équilibrer à température ambiante (TR) pendant 10 à 20 min.
2. Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer la solution de stockage des sections.
3. Déplacer l’insert de puits vers un autre puits contenant environ 6 mL de 1x TBS. Laver 3 fois avec 1x TBS pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital en utilisant basse vitesse à RT.
4. Pendant le lavage des sections, préparer 7 mL (par échantillon) d’une solution bloquante-perméabilisante composée de 1 TBS avec 0,3 % de Triton X-100 et 3 % de sérum normal (p. ex. sérum normal pour cheval). Bloquer les sections pendant 30 min à RT sur agitateur orbital, en utilisant basse vitesse.
   REMARQUE: Le blocage avec des sérums empêche la liaison non spécifique d’anticorps aux tissus ou aux récepteurs Fc non spécifiques – un sérum correspondant à l’espèce de l’anticorps secondaire est recommandé, mais s’il n’est pas disponible, tout sérum normal d’une espèce différente de l’animal hôte d’anticorps primaire peut être utilisé. Le détergent Triton X-100 permet une meilleure pénétration des anticorps en perméabilisant le tissu.
5. Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps primaires composée d’anticorps primaires sélectionnés (dilués de manière appropriée) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (voir étape 4.4 Note). Transférer les sections de l’insert de puits dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps primaires pour se lier au(x) antigène(s) d’intérêt.
   REMARQUE : Plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés (générés chez différentes espèces hôtes).
6. Placer un tube microcentrifuge de 2 mL avec des sections sur un mélangeur rotatif à basse vitesse (p. ex., vitesse 7 tr/min) et incuber pendant une nuit pendant 12 à 16 h à 4 °C.

5. Jour II de la coloration

1. Le lendemain, verser des sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps primaires.
   NOTE: La solution d’anticorps peut être recueillie et réutilisée; Ajouter 0,02 % (p/v) d’azoture de sodium pour inhiber la croissance microbienne.
2. Lavez les sections 3 fois avec 1x TBS à TA (30 s pour les 2 premiers lavages et 10 min pour le lavage final).
3. Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps secondaires composée d’anticorps secondaires appropriés (dilués en conséquence) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (solution protectrice de la lumière).
   REMARQUE : Le marquage indirect avec un anticorps secondaire conjugué amplifie le signal et permet une visualisation colorimétrique ou fluorescente de la protéine cible.
4. Transvaser les sections dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps secondaire. Incuber pendant 2 h à RT sur agitateur orbital à basse vitesse (solution de protection de la lumière).
5. Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps secondaire.
6. En continuant à protéger les échantillons de la lumière, laver 2 fois avec 1x TBS pendant 30 s à TA. Ensuite, laver pendant 15 min dans 1x TBS, ajouter DAPI (1-0,1 μg/ml) si désiré.

6. Montage

1. Versez des sections dans une chambre histologique rectangulaire en verre remplie aux trois quarts de 1x TBS.
2. Immergez une lame de verre dans le TBS 1x et utilisez un pinceau fin pour amadouer les sections vers la glissière.
3. Tapotez doucement les sections sur la lame, en vous assurant qu’il n’y a pas de rides ou de plis.
4. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les sections soient montées sur la ou les diapositives.
   REMARQUE : Lorsqu’un cerveau entier, par exemple, est sectionné à 40 μm, recueilli dans des inserts de 12 puits avec une partie aliquote contenant 18 à 24 sections; Les tranches sont généralement montées sur 1-2 lames, mais moins de sections peuvent également être montées par diapositive selon les préférences du chercheur.

7. Glissade de couverture

1. Après le séchage des sections sur la ou les lames, environ 10 à 15 minutes à TA ou jusqu’à ce que les sections semblent opaques (n’oubliez pas de protéger les lames de la lumière), appliquez un support de montage aqueux approprié (durcissement ou non). L’antidécoloration est préférable si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué fluorescent.
   REMARQUE: La qualité de fluorescence peut être inférieure lors de l’utilisation d’un support de montage durcisseur, mais les lames doivent durer plus longtemps.
2. À l’aide d’une pince à épiler, placez une housse sur le support. Couvrir avec du papier filtre et appuyer fermement pour enlever l’excès de support de montage.
   REMARQUE: Si vous utilisez un support non durcissant, peignez les bords de la lame couverclée avec du vernis à ongles transparent pour sceller.
3. Coupes d’images à l’aide d’un microscope approprié. Conserver dans une boîte à diapositive sombre à 4 °C.
   REMARQUE : Les coupes peuvent être imagées à l’aide de divers microscopes, tels que la fluorescence confocale et à grand champ à balayage laser inversée ou verticale, à des grossissements (p. ex., 10x, 20x, 40x) en fonction des besoins du chercheur.

Résultats

Le schéma général de l’utilisation de la méthode flottante pour effectuer un test immunohistochimique fluorescent est illustré à la figure 1. Un exemple représentatif d’IHC fluorescente utilisant la méthode de flottaison libre dans le cerveau de souris examinant l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est présenté à la figure 2 à un grossissement inférieur et supérieur pour illustrer la qualité globale de la coloration. ...

Discussion

L’immunohistochimie (IHC) est une technique polyvalente qui est devenue cruciale dans l’identification de l’expression et de la localisation des protéines dans les sections de tissus. Ce test est utilisé dans toute la communauté scientifique pour mieux comprendre les caractéristiques des tissus à travers les stades de la fonction normale jusqu’aux états pathologiques. IHC est employé dans une variété de domaines allant du diagnostic clinique de maladies telles que le cancer aux découvertes initiales dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042