Coloração histológica usando seções de tecido flutuantes livres

Resumo

A técnica de flutuação livre permite que os pesquisadores realizem colorações histológicas, incluindo imuno-histoquímica em seções de tecido fixas para visualizar estruturas biológicas, tipo de célula e expressão e localização de proteínas. Esta é uma técnica histoquímica eficiente e confiável que pode ser útil para investigar uma infinidade de tecidos, como cérebro, coração e fígado.

Resumo

A imuno-histoquímica é uma técnica amplamente utilizada para visualizar estruturas teciduais específicas, bem como a expressão e localização de proteínas. Duas abordagens alternativas são amplamente utilizadas para lidar com as seções de tecido durante o procedimento de coloração, uma abordagem consiste em montar as seções diretamente em lâminas de vidro, enquanto uma segunda abordagem, a flutuação livre, permite que as seções fixas sejam mantidas e manchadas enquanto suspensas em solução. Embora as abordagens de montagem em lâmina e flutuação livre possam produzir resultados semelhantes, a técnica de flutuação livre permite uma melhor penetração de anticorpos e, portanto, deve ser o método de escolha quando seções mais espessas devem ser usadas para reconstrução 3D dos tecidos, por exemplo, quando o foco do experimento é obter informações sobre projeções dendríticas e axonais em regiões cerebrais. Além disso, uma vez que as seções são mantidas em solução, uma única alíquota pode facilmente acomodar 30 a 40 seções, cujo manuseio é menos trabalhoso, particularmente em estudos biomédicos em larga escala. Aqui, ilustramos como aplicar o método de flutuação livre à coloração imuno-histoquímica fluorescente, com um foco importante em seções cerebrais. Também discutiremos como a técnica de flutuação livre pode ser facilmente modificada para atender às necessidades individuais dos pesquisadores e adaptada a outros tecidos, bem como a outras colorações histoquímicas, como hematoxilina e eosina e violeta cresil, desde que as amostras de tecido sejam adequadamente fixadas, tipicamente com paraformaldeído ou formalina.

Introdução

A imunocoloração é uma prática de pesquisa popular que começou há 130 anos com a descoberta de anticorpos séricos em 1890 por Von Behring¹. Durante o início do^século 20, corantes foram ligados a antígenos e, posteriormente, a anticorpos como forma de quantificar e visualizar reações¹, e em 1941 Albert Coons desenvolveu os primeiros marcadores de anticorpos fluorescentes, uma descoberta que revolucionou a microscopia de luz ^2,3. O termo "imunocoloração" engloba muitas técnicas que vêm sendo desenvolvidas utilizando esse princípio, incluindo Western blot, citometria de fluxo, ELISA, imunocitoquímica e imuno-histoquímica ^3,4. Western blot detecta a presença de proteínas específicas de extratos de tecidos ou células⁵. As proteínas são separadas por tamanho usando eletroforese em gel, transferidas para uma membrana e sondadas usando anticorpos. Esta técnica indica a presença de proteína e quanta proteína está presente; no entanto, não revela qualquer informação sobre a localização da proteína dentro de células ou tecidos. Outro método, a imunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro das células, tipicamente células cultivadas in vitro. O ICC mostra tanto a expressão quanto a localização de proteínas dentro dos compartimentos celulares⁶. Para detectar e visualizar uma proteína específica no nível do tecido, a imuno-histoquímica (IHC) é utilizada.

A IHC é um método que os pesquisadores utilizam para atingir antígenos específicos dentro do tecido, aproveitando as propriedades químicas do sistema imunológico ^7,8. Ao gerar anticorpos primários e secundários específicos ligados a uma enzima ou a um corante fluorescente, antígenos de interesse podem ser marcados e revelados na maioria dos tecidos (conforme revisado em Mepham e Britten)⁹. O termo "imuno-histoquímica" por si só não especifica o método de marcação que é usado para revelar o antígeno de interesse; assim, essa terminologia é frequentemente combinada com a técnica de detecção para delinear claramente o método de marcação: imuno-histoquímica cromogênica (CIH) para indicar quando o anticorpo secundário é conjugado a uma enzima, como a peroxidase; ou IHC fluorescente para indicar quando o anticorpo secundário é conjugado a um fluoróforo, como isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou tetrametilrodamina (TRITC). A seletividade da IHC permite que clínicos e pesquisadores visualizem a expressão e a distribuição de proteínas pelos tecidos, em vários estados de saúde e doença¹⁰. No campo clínico, a IHC é comumente usada para diagnosticar o câncer, bem como para determinar diferenças em vários tipos de câncer. A IHC também tem sido usada para confirmar diferentes tipos de infecções microbianas dentro do corpo, como a hepatite B ou C¹¹. Na pesquisa biomédica, a IHC é frequentemente usada para mapear a expressão de proteínas nos tecidos e é importante na identificação de proteínas anormais observadas em estados de doença. Por exemplo, a neurodegeneração é frequentemente acompanhada pelo acúmulo de proteínas anormais no cérebro, como placas Αβ e emaranhados neurofibrilares na doença de Alzheimer. Modelos animais são frequentemente desenvolvidos para imitar esses estados patológicos, e a IHC é um método que os pesquisadores utilizam para localizar e quantificar as proteínas de interesse^10,12,13. Por sua vez, podemos aprender mais sobre as causas dessas doenças e as complicações que surgem com elas.

Há muitas etapas envolvidas na realização da IHC. Primeiro, o tecido de interesse é coletado e preparado para coloração. Indiscutivelmente, a maioria dos pesquisadores prepara amostras de tecido fixo, sendo ótima a perfusão do fixador via sistema circulatório, pois preserva a morfologia^14,15. A pós-fixação de amostras de tecido também pode ser utilizada, mas pode produzir resultados abaixo do ideal¹⁶. Os fixadores de reticulação, como o formaldeído, atuam criando ligações químicas entre proteínas no tecido¹⁷. O tecido fixo é então cortado em camadas ou seções muito finas usando um micrótomo, com muitos pesquisadores preferindo coletar seções congeladas usando um criostato. A partir daí, o tecido é coletado e montado diretamente em uma lâmina de microscópio (método montado em lâmina) ou suspenso em uma solução (método de flutuação livre), como solução salina tamponada com fosfato (PBS)¹⁸. O método de coleta utilizado é predeterminado com base nas necessidades do pesquisador, com cada um desses dois métodos apresentando suas próprias vantagens e desvantagens.

O método montado em lâmina é de longe o mais comumente usado, com um benefício importante sendo que seções muito finas (10-14 μm) podem ser preparadas, o que é importante, por exemplo, para investigar interações proteína-proteína. Há também um manuseio mínimo do espécime, o que diminui o dano potencial à integridade estrutural do tecido¹⁹. Os pesquisadores costumam usar essa técnica com tecido fresco congelado (tecido que é imediatamente congelado usando gelo seco, isopentano, etc.), o que é muito delicado em comparação com o tecido fixo e muito cuidado para evitar o descongelamento da amostra precisa ser coletado. Outra vantagem de usar seções montadas em deslizamento é que grandes volumes de soluções para coloração geralmente não são necessários⁴. Assim, os pesquisadores podem usar uma quantidade menor de anticorpos caros ou outros produtos químicos para completar a mancha. Além disso, é possível montar seções de vários grupos experimentais diferentes no mesmo slide, o que pode ser vantajoso, especialmente durante a aquisição da imagem. Por outro lado, existem algumas desvantagens de usar seções montadas em lâmina, mais notavelmente que a seção de tecido é aderida à lâmina, restringindo assim a penetração de anticorpos a um lado da seção, o que limita a espessura da seção e a representação 3D do tecido. Também pode acontecer que, durante as lavagens, as bordas do tecido e seções inteiras possam se desprender da lâmina, tornando inútil todo o experimento. Além disso, a IHC geralmente tem que ser realizada de forma relativamente rápida ao usar a abordagem montada em lâmina para evitar a degradação do epítopo do antígeno 20,21 com lâminas não processadas normalmente armazenadas a -²⁰ ou -⁸⁰ °C^, muitas vezes cobertas e armazenadas horizontalmente ou em caixas de lâmina, resultando em uma pegada de armazenamento relativamente grande. Por fim, a técnica montada em lâminas também pode ser demorada se os pesquisadores precisarem lidar com um grande número de lâminas para processar um grande número de seções de tecido.

Devido a alguns desses desafios usando o método montado em slide, uma modificação chamada método de flutuação livre tornou-se uma alternativa popular. Essa técnica entrou na literatura nas décadas de 1960-702,23,24, ganhando popularidade na década de 1980 25,26,27,28,29, e hoje é um método bem estabelecido que envolve a realização da coloração nas seções coletadas em suspensão, em vez de aderir a um slide ^12,30,31 . O método de flutuação livre não é recomendado quando as secções teciduais são inferiores a 20 μm; no entanto, em nossa experiência, é a abordagem de escolha quando seções mais espessas (40-50 μm) devem ser coradas. Um benefício distinto é que os anticorpos podem penetrar em seções flutuantes livres de todos os ângulos e gerar menos coloração de fundo devido a uma lavagem mais eficaz, resultando em melhor sinalização ao fazer imagens. Além disso, as seções são montadas nas lâminas após o processamento, eliminando assim a possibilidade de descolamento tecidual, bem como diminuindo o tempo de ocupação do criostato. O método de flutuação livre também pode ser muito menos trabalhoso, especialmente para estudos biomédicos em larga escala. Por exemplo, é possível manchar muitas (18-40) seções da mesma amostra juntas no mesmo poço, o que economiza tempo na realização das etapas de lavagem e incubação de anticorpos. Além disso, uma vez que um número maior (12-16) de seções pode ser montado por slide usando essa abordagem, muitas vezes é mais conveniente e mais rápido para o pesquisador visualizar e visualizar seções de imagem. Notavelmente, durante a montagem de fatias de tecido nas lâminas, as seções podem ser anexadas e destacadas até que a orientação desejada seja obtida. Os pesquisadores também costumam usar concentrações ligeiramente mais baixas de anticorpos usando o método de flutuação livre e, como as incubações são realizadas em tubos de microcentrífuga, os anticorpos podem ser facilmente coletados e preservados com azida de sódio para reutilização (ver Etapa 5.1). Outra vantagem é que as seções podem ser armazenadas diretamente a -80 °C em pequenos tubos de microcentrífuga com solução crioprotetora³², minimizando assim o espaço de armazenamento e maximizando a longevidade das amostras³³. Uma desvantagem de usar essa técnica é que as seções são muito manuseadas e, portanto, estão aptas a danos. Isso, no entanto, pode ser mitigado usando baixas velocidades de agitação e rotação, bem como treinando adequadamente os pesquisadores sobre como transferir as amostras e montar as seções nos slides.

Em conjunto, o IHC é uma ferramenta estabelecida e essencial para visualizar e localizar a expressão de proteínas nos campos de pesquisa clínica e biomédica. A IHC flutuante livre é um método eficiente, flexível e econômico, especialmente na realização de estudos histológicos em larga escala. Aqui, apresentamos um protocolo confiável de IHC fluorescente flutuante livre para a comunidade científica que pode ser adaptado de acordo com a IHC cromogênica e outras colorações, como hematoxilina e eosina ou coloração violeta cresil.

Protocolo

1. Preparação de tecidos para criosecção

1. Incorpore tecidos fixos em um molde de incorporação apropriado (ver Tabela de Materiais) para criar um bloco de amostra usando uma matriz de amostra apropriada (ver Tabela de Materiais) e congelar em gelo seco. Conservar os blocos de amostras a -80 °C até estarem prontos para a secção.
   NOTA: Os tecidos fixos são tipicamente preparados por perfusão de roedores adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de idade) machos ou fêmeas (ratinho ou rato)³⁴, de acordo com a autorização ética disponível, com um fixador adequado (por exemplo, formalina a 10%), seguido de tecidos pós-fixação no mesmo fixador durante 12 h a 4 °C, lavando os tecidos três vezes com 1x PBS, e colocar os tecidos em 15% e depois em 30% de sacarose em 1x PBS durante a noite ou até que os tecidos afundem³⁵. Os pesquisadores podem tentar adaptar esse protocolo geral a diferentes estágios de desenvolvimento.

2. Criosecção

1. Quando estiver pronto para a secção, aclimatete as amostras no criostato por pelo menos 1-2 h antes da secção para evitar a quebra do tecido.
2. Usando um criostato, corte o tecido em seções (20-50 μm) e colete em inserções de 6 ou 12 poços (ver Tabela de Materiais) preenchidas com 1x solução de PBS.
   NOTA: Dependendo da espessura da seção, da quantidade de tecido a ser coletado e do número de inserções de poço usadas, cada poço conterá um número variável de seções que vão de aproximadamente 10 a 40 fatias para poço. Por exemplo, se um cérebro inteiro é seccionado a 40 μm, aproximadamente 18-24 seções serão coletadas em cada poço usando inserções de 12 poços. Além disso, seções de 20 μm podem ser um pouco difíceis de manusear, portanto, 40 μm são recomendados para coloração em massa (ver Discussão).

3. Armazenando seções

1. Uma vez recolhidas, lave as seções com PBS 1x recém-preparado por 5 min. Repita 3 vezes.
2. Transfira as seções para tubos de microcentrífuga de 2 mL preenchidos com 1-1,5 mL de solução de armazenamento (para 250 mL, misture 70 g de sacarose, 75 mL de etilenoglicol e leve ao volume com tampão fosfato 0,1 M).
3. Conservar a -80 °C até estarem prontos para a coloração.

4. Manchando o Dia I

1. Retire as amostras do congelador e equilibre-se à temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
2. Despeje seções em uma inserção de poço em uma placa de 6 poços para separar a solução de armazenamento das seções.
3. Mova a inserção do poço para outro poço contendo aproximadamente 6 mL de 1x TBS. Lave 3 vezes com 1x TBS por 5 min cada em um agitador orbital usando baixa velocidade em RT.
4. Enquanto as seções estão lavando, prepare 7 mL (por amostra) de uma solução de bloqueio-permeabilizante consistindo de 1x TBS com 0,3% de Triton X-100 e 3% de soro normal (por exemplo, soro de cavalo normal). Seções de bloco por 30 min em RT no agitador orbital, usando baixa velocidade.
   NOTA: O bloqueio com soros impede a ligação inespecífica de anticorpos ao tecido ou a receptores FC não específicos – recomenda-se um soro correspondente às espécies do anticorpo secundário, mas, se não estiver disponível, qualquer soro normal de uma espécie diferente do animal hospedeiro de anticorpos primários pode ser usado. O detergente Triton X-100 permite uma melhor penetração de anticorpos através da permeabilização do tecido.
5. Preparar 1 ml por amostra de solução de anticorpos primários que consista em anticorpos primários selecionados (diluídos adequadamente) em 1x TBS com Triton X-100 a 0,3% e 1% de soro normal (ver Passo 4.4 Nota). Seções de transferência do poço inseridas em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo solução de anticorpos primários para se ligar ao(s) antígeno(s) de interesse.
   NOTA: Múltiplos anticorpos primários podem ser usados (gerados em diferentes espécies hospedeiras).
6. Coloque um tubo de microcentrífuga de 2 mL com seções em um misturador rotativo usando baixa velocidade (por exemplo, velocidade 7 rpm) e incube durante a noite por 12-16 h a 4 °C.

5. Manchar o Dia II

1. No dia seguinte, despeje seções em um poço inserido em uma placa de 6 poços para separar as seções da solução primária de anticorpos.
   NOTA: A solução de anticorpos pode ser recolhida e reutilizada; adicionar 0,02% (p/v) de azida de sódio para inibir o crescimento microbiano.
2. Lavar as secções 3 vezes com 1x TBS no RT (30 s para as primeiras 2 lavagens e 10 min para a lavagem final).
3. Preparar 1 ml por amostra de solução de anticorpos secundários que consista em anticorpo secundário apropriado (diluído em conformidade) em 1x TBS com Triton X-100 a 0,3% e soro normal a 1% (solução de escudo da luz).
   NOTA: A marcação indireta com um anticorpo secundário conjugado amplifica o sinal e permite a visualização colorimétrica ou fluorescente do alvo da proteína.
4. Transfira as seções para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo solução de anticorpos secundários. Incubar por 2 h em RT em agitador orbital usando baixa velocidade (solução de escudo da luz).
5. Despeje seções em uma inserção de poço em uma placa de 6 poços para separar as seções da solução secundária de anticorpos.
6. Continuando a proteger as amostras da luz, lave 2 vezes com 1x TBS por 30 s no RT. Em seguida, lave por 15 min em 1x TBS, adicione DAPI (1-0,1 μg / ml), se desejar.

6. Montagem

1. Despeje seções em uma câmara histológica retangular de vidro preenchida três quartos com 1x TBS.
2. Submerja um slide de vidro no 1x TBS e use um pincel fino para persuadir as seções em direção ao slide.
3. Toque suavemente nas seções no slide, certificando-se de que não haja rugas ou dobras.
4. Repita até que todas as seções sejam montadas no(s) slide(s).
   NOTA: Quando um cérebro inteiro, por exemplo, é seccionado a 40 μm, coletado em inserções de 12 poços com uma alíquota contendo 18-24 seções; fatias são normalmente montadas em 1-2 slides, mas menos seções também podem ser montadas por slide, dependendo da preferência do pesquisador.

7. Deslizamento da tampa

1. Depois que as seções forem secas na(s) lâmina(s), cerca de 10-15 minutos no RT ou até que as seções pareçam opacas (lembre-se de proteger as lâminas da luz), aplique um meio de montagem aquoso apropriado (endurecimento ou não endurecimento). O antidesbotamento é preferido se estiver usando um anticorpo secundário conjugado fluorescente.
   NOTA: A qualidade de fluorescência pode ser menor ao usar um meio de montagem de endurecimento, mas as lâminas devem durar mais tempo.
2. Usando uma pinça, coloque uma tampa em cima do meio. Cubra com papel de filtro e pressione firmemente para remover o excesso de meio de montagem.
   NOTA: Se estiver usando um suporte sem endurecimento, pinte as bordas da tampa deslizante com esmalte de unhas transparente para selar.
3. Seções de imagem usando um microscópio apropriado. Conservar numa caixa de deslizamento escura a 4 °C.
   NOTA: As seções podem ser fotografadas usando uma variedade de microscópios, como varredura a laser confocal e fluorescência de campo largo invertida ou vertical, em ampliações (por exemplo, 10x, 20x, 40x) com base nas necessidades do pesquisador.

Resultados

O esquema geral do uso do método de flutuação livre para realizar um ensaio imuno-histoquímico fluorescente é ilustrado na Figura 1. Um exemplo representativo de IHC fluorescente usando o método de flutuação livre no cérebro de camundongos examinando a expressão da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é mostrado na Figura 2 em ampliação mais baixa e maior para ilustrar a qualidade geral da coloração. Essa abordagem também é apropriada para rev...

Discussão

A imuno-histoquímica (IHC) é uma técnica versátil que se tornou crucial na identificação da expressão e localização de proteínas dentro de seções de tecidos. Este ensaio é usado em toda a comunidade científica para entender melhor as características do tecido em todos os estágios da função normal para os estados de doença. A IHC é empregada em uma variedade de campos, desde o diagnóstico clínico de doenças como o câncer até as descobertas iniciais em pesquisas pré-clínicas^10,3...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042