JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Свободно плавающий метод позволяет исследователям выполнять гистологические окрашивания, включая иммуногистохимию на фиксированных участках ткани, для визуализации биологических структур, типа клеток, экспрессии и локализации белка. Это эффективный и надежный гистохимический метод, который может быть полезен для исследования множества тканей, таких как мозг, сердце и печень.

Аннотация

Иммуногистохимия является широко используемым методом визуализации специфических тканевых структур, а также экспрессии и локализации белка. Два альтернативных подхода широко используются для обработки участков ткани во время процедуры окрашивания, один подход заключается в монтаже секций непосредственно на стеклянных слайдах, в то время как второй подход, свободно плавающий, позволяет поддерживать и окрашивать фиксированные участки во время подвешивания в растворе. Хотя скользящие и свободно плавающие подходы могут давать аналогичные результаты, свободно плавающий метод позволяет лучше проникать антителам и, следовательно, должен быть методом выбора, когда более толстые участки должны использоваться для 3D-реконструкции тканей, например, когда основное внимание в эксперименте уделяется получению информации о дендритных и аксональных проекциях в областях мозга. Кроме того, поскольку секции хранятся в растворе, одна аликвота может легко вместить от 30 до 40 секций, обработка которых менее трудоемка, особенно в крупномасштабных биомедицинских исследованиях. Здесь мы иллюстрируем, как применять свободно плавающий метод к флуоресцентному иммуногистохимическому окрашиванию, уделяя основное внимание участкам мозга. Мы также обсудим, как свободно плавающая техника может быть легко модифицирована в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей и адаптирована к другим тканям, а также к другим гистохимическим окрашиваниям, таким как гематоксилин и эозин и крезил-фиолетовый, если образцы тканей правильно зафиксированы, как правило, с параформальдегидом или формалином.

Введение

Иммуноокрашивание является популярной исследовательской практикой, которая началась 130 лет назад с открытия сывороточных антител в 1890 году фон Берингом1. В начале20-го века красители были прикреплены к антигенам, а затем к антителам как способ количественной оценки и визуализации реакций1, а в 1941 году Альберт Кунс разработал первые флуоресцентные метки антител, открытие, которое произвело революцию в световой микроскопии 2,3. Термин «иммуноокрашивание» охватывает многие методы, которые были разработаны с использованием этого принципа, включая вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, ИФА, иммуноцитохимию и иммуногистохимию 3,4. Вестерн-блот обнаруживает присутствие специфических белков из тканевых или клеточных экстрактов5. Белки разделяются по размеру с помощью гелевого электрофореза, переносятся на мембрану и исследуются с использованием антител. Эта методика указывает на наличие белка и на то, сколько белка присутствует; однако он не раскрывает никакой информации о локализации белка внутри клеток или тканей. Другой метод, иммуноцитохимия (ICC), маркирует белки внутри клеток, обычно клеток, культивируемых in vitro. ICC показывает как экспрессию белка, так и локализацию в клеточных компартментах6. Для обнаружения и визуализации специфического белка на тканевом уровне используется иммуногистохимия (IHC).

IHC - это метод, который исследователи используют для нацеливания на специфические антигены в ткани, используя преимущества химических свойств иммунной системы 7,8. Генерируя специфические первичные и вторичные антитела, связанные либо с ферментом, либо с флуоресцентным красителем, представляющие интерес антигены могут быть помечены и выявлены в большинстве тканей (как рассмотрено в Mepham и Britten)9. Термин «иммуногистохимия» сам по себе не указывает на метод маркировки, который используется для выявления интересующего антигена; таким образом, эта терминология часто сочетается с методом обнаружения, чтобы четко очертить метод маркировки: хромогенная иммуногистохимия (CIH) для указания, когда вторичное антитело конъюгируется с ферментом, таким как пероксидаза; или флуоресцентный IHC, чтобы указать, когда вторичное антитело конъюгируется с флуорофором, таким как флуоресцеин изотиоцианат (FITC) или тетраметилродамин (TRITC). Селективность IHC позволяет клиницистам и исследователям визуализировать экспрессию и распределение белка по тканям, в различных состояниях здоровья и заболевания10. В клинической сфере IHC обычно используется для диагностики рака, а также для определения различий в различных типах рака. IHC также использовался для подтверждения различных типов микробных инфекций в организме, таких как гепатит B или C11. В биомедицинских исследованиях IHC часто используется для картирования экспрессии белка в тканях и важен для выявления аномальных белков, наблюдаемых в болезненных состояниях. Например, нейродегенерация часто сопровождается накоплением аномальных белков в головном мозге, таких как Αβ-бляшки и нейрофибриллярные клубки при болезни Альцгеймера. Затем животные модели часто разрабатываются для имитации этих патологических состояний, и IHC является одним из методов, которые исследователи используют для определения местоположения и количественной оценки интересующих белков 10,12,13. В свою очередь, мы можем узнать больше о причинах этих заболеваний, и осложнениях, которые возникают при них.

Есть много шагов, связанных с выполнением IHC. Сначала собирается интересующая ткань и подготавливается к окрашиванию. Возможно, большинство исследователей готовят фиксированные образцы тканей, при этом перфузия фиксатора через кровеносную систему является оптимальной, поскольку она сохраняет морфологию14,15. Постфиксация образцов тканей также может быть использована, но может дать менее идеальные результаты16. Сшивающие фиксаторы, такие как формальдегид, действуют путем создания химических связей между белками в ткани17. Фиксированная ткань затем нарезается на очень тонкие слои или участки с использованием микротома, причем многие исследователи предпочитают собирать замороженные участки с помощью криостата. Оттуда ткань собирают и либо монтируют непосредственно на предметное стекло микроскопа (скользящий метод), либо суспендируют в растворе (свободно плавающий метод), таком как фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)18. Используемый метод сбора предопределен исходя из потребностей исследователя, причем каждый из этих двух методов представляет свои преимущества и недостатки.

Метод, установленный на слайдах, на сегодняшний день является наиболее часто используемым, с важным преимуществом, заключающимся в том, что могут быть приготовлены очень тонкие срезы (10-14 мкм), что важно, например, для исследования белково-белковых взаимодействий. Существует также минимальное обращение с образцом, что уменьшает потенциальное повреждение структурной целостности ткани19. Исследователи часто используют эту технику со свежезамороженной тканью (тканью, которая немедленно замораживается с использованием сухого льда, изопентана и т. Д.), Которая очень деликатна по сравнению с фиксированной тканью, и необходимо проявлять большую осторожность для предотвращения оттаивания образца. Еще одним преимуществом использования скользящих секций является то, что большие объемы растворов для окрашивания обычно не требуются4. Таким образом, исследователи могут использовать меньшее количество дорогих антител или других химических веществ для завершения окрашивания. Кроме того, можно монтировать секции из нескольких различных экспериментальных групп на одном слайде, что может быть выгодно, особенно во время получения изображения. С другой стороны, есть некоторые недостатки использования секций, установленных на слайдах, в первую очередь то, что участок ткани прилипает к слайду, что ограничивает проникновение антител в одну сторону секции, что ограничивает толщину сечения и 3D-представление ткани. Также может случиться так, что во время стирки края ткани и целые срезы могут отсоединиться от слайда, сделав бесполезным весь эксперимент. Кроме того, IHC обычно должен выполняться относительно быстро при использовании подхода, установленного на слайдах, чтобы избежать деградации эпитопа антигена20,21 с необработанными слайдами, обычно хранящимися при -20 или -80 ° C, часто покрытыми и хранящимися горизонтально или в слайд-боксах, что приводит к относительно большой площади хранения. Наконец, метод крепления слайдов также может занять много времени, если исследователи должны обрабатывать большое количество слайдов для обработки большого количества участков тканей.

Из-за некоторых из этих проблем с использованием метода slide-mounted модификация, называемая свободно плавающим методом, стала популярной альтернативой. Эта техника вошла в литературу в 1960-70-хгодах 22,23,24, набрав популярность в 1980-х 25,26,27,28,29, и в настоящее время является хорошо зарекомендовавшим себя методом, который включает в себя выполнение пятна на собранных участках в суспензии, а не приклеенное к слайду 12,30,31 . Свободно плавающий метод не рекомендуется, когда срезы тканей составляют менее 20 мкм; однако, по нашему опыту, это подход выбора, когда более толстые (40-50 мкм) участки должны быть окрашены. Одним из явных преимуществ является то, что антитела могут проникать в свободно плавающие участки со всех углов и генерировать меньше фонового окрашивания из-за более эффективной промывки, что приводит к лучшей передаче сигналов при визуализации. Кроме того, секции крепятся на слайды после обработки, что исключает возможность отслоения тканей, а также уменьшает время, занимаемое криостатом. Свободно плавающий метод также может быть гораздо менее трудоемким, особенно для крупномасштабных биомедицинских исследований. Например, можно окрасить многие (18-40) секции из одного и того же образца вместе в одном колодце, что экономит время при выполнении этапов промывки и инкубации антител. Более того, поскольку с помощью этого подхода можно смонтировать большее количество (12-16) секций на слайд, исследователю часто удобнее и быстрее просматривать и обрезать разделы. Примечательно, что во время монтажа срезов ткани на слайдах секции могут быть прикреплены и отсоединены до тех пор, пока не будет достигнута желаемая ориентация. Исследователи также часто используют несколько более низкие концентрации антител с использованием свободно плавающего метода, и поскольку инкубации выполняются в микроцентрифужных трубках, антитела могут быть легко собраны и сохранены с азидом натрия для повторного использования (см. Шаг 5.1). Другим преимуществом является то, что секции могут непосредственно храниться при -80 °C в небольших микроцентрифужных трубках с раствором криопротектора32, тем самым минимизируя пространство для хранения и максимизируя долговечность образцов33. Недостатком использования этой техники является то, что секции обрабатываются много и, следовательно, подвержены повреждениям. Это, однако, можно смягчить, используя низкие скорости встряхивания и вращения, а также правильно обучая исследователей тому, как переносить образцы и монтировать секции на слайды.

Взятый вместе, IHC является признанным, важным инструментом для визуализации и локализации экспрессии белка как в клинических, так и в биомедицинских исследованиях. Свободно плавающий IHC является эффективным, гибким, а также экономичным методом, особенно при выполнении крупномасштабных гистологических исследований. Здесь мы представляем надежный свободно плавающий флуоресцентный протокол IHC для научного сообщества, который может быть соответствующим образом адаптирован для хромогенного IHC и других окрашиваний, таких как гематоксилин и эозин или крезиловое окрашивание.

протокол

1. Подготовка тканей к криосечению

  1. Встраивайте неподвижные ткани в соответствующую форму для встраивания (см. Таблицу материалов) для создания блока образцов с использованием соответствующей матрицы образца (см. Таблицу материалов) и замораживайте на сухом льду. Храните блоки образцов при температуре -80 °C до готовности к разделению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные ткани обычно получают путем перфузии взрослых (около 2,5 – 30 месяцев) самцов или самок грызунов (мыши или крыс)34, в соответствии с имеющимся этическим разрешением, соответствующим фиксатором (например, 10% формалина), с последующим постфиксирующими тканями в том же фиксаторе в течение 12 ч при 4 °C, промывая ткани три раза с 1x PBS, и помещение тканей в 15%, а затем 30% сахарозы в 1x PBS на ночь или до тех пор, пока ткани не утонут35. Исследователи могут попытаться адаптировать этот общий протокол к различным стадиям развития.

2. Криосекционирование

  1. Когда они будут готовы к разделению, акклиматизируйте образцы в криостате в течение не менее 1-2 ч перед секционированием, чтобы предотвратить разрушение ткани.
  2. С помощью криостата разрезают ткань на срезы (20-50 мкм) и собирают в 6 или 12-луночные вставки (см. Таблицу материалов), заполненные 1x раствором PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от толщины сечения, количества ткани, подлежащей сбору, и количества используемых лунок, каждая скважина будет содержать переменное количество секций, охватывающих примерно от 10 до 40 ломтиков для скважины. Например, если весь мозг разделен на 40 мкм, примерно 18-24 секции будут собраны в каждой скважине с помощью 12-луночных вставок. Кроме того, 20-мкм секции могут быть несколько сложными в обращении, поэтому 40 мкм рекомендуется для объемного окрашивания (см. Обсуждение).

3. Хранение секций

  1. После сбора промыть секции свежеприготовленными 1x PBS в течение 5 минут. Повторите 3 раза.
  2. Переложить срезы в микроцентрифужные трубки по 2 мл, заполненные 1-1,5 мл раствора для хранения (на 250 мл смешать 70 г сахарозы, 75 мл этиленгликоля и довести до объема с 0,1 М фосфатного буфера).
  3. Хранить при температуре -80 °C до готовности к окрашиванию.

4. Окрашивание День I

  1. Извлеките образцы из морозильной камеры и уравновесьте при комнатной температуре (RT) в течение 10 - 20 мин.
  2. Вылейте секции в колодец, вставьте в 6-луночную пластину, чтобы отделить раствор для хранения от секций.
  3. Переместите вставку скважины в другую скважину, содержащую примерно 6 мл 1x TBS. Промыть 3 раза 1x TBS в течение 5 минут каждая на орбитальном шейкере, используя низкую скорость при RT.
  4. Во время промывки срезов приготовьте 7 мл (на образец) блокирующего-пермеабилизирующего раствора, состоящего из 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 3% нормальной сыворотки (например, обычной конской сыворотки). Блокируйте секции в течение 30 мин на RT на орбитальном шейкере, используя низкую скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование сыворотками предотвращает неспецифическое связывание антител с тканями или неспецифическими Fc-рецепторами - рекомендуется сыворотка, соответствующая виду вторичного антитела, но если она недоступна, может быть использована любая нормальная сыворотка от вида, отличного от первичного антитела-хозяина животного. Моющее средство Triton X-100 обеспечивает лучшее проникновение антител путем проникновения в ткань.
  5. Приготовьте 1 мл на образец раствора первичного антитела, состоящего из выбранного первичного антитела (разведенного соответствующим образом) в 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 1% нормальной сывороткой (см. Шаг 4.4 Примечание). Переносные участки из скважины вставляют в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую раствор первичного антитела для связывания с интересующим антигеном (антигенами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использовано несколько первичных антител (генерируемых у разных видов хозяев).
  6. Поместите 2 мл микроцентрифужной трубки с секциями на вращающийся смеситель с использованием низкой скорости (например, скорость 7 об/мин) и инкубируйте в течение ночи в течение 12-16 ч при 4 °C.

5. Окрашивание День II

  1. На следующий день вылейте срезы в лунку, вставьте в 6-луночную пластину, чтобы отделить участки от раствора первичных антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор антител может быть собран и повторно использован; добавляют 0,02% (мас./об.) азида натрия для ингибирования роста микробов.
  2. Промыть секции 3 раза с 1x TBS на RT (30 с для первых 2 стирок и 10 мин для окончательной стирки).
  3. Готовят 1 мл на образец раствора вторичного антитела, состоящего из соответствующего вторичного антитела (разбавленного соответственно) в 1x TBS с 0,3% Triton X-100 и 1% нормальной сывороткой (защитный раствор от света).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрямая маркировка конъюгированным вторичным антителом усиливает сигнал и позволяет осуществлять колориметрическую или флуоресцентную визуализацию белковой мишени.
  4. Переведите срезы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую раствор вторичных антител. Инкубировать в течение 2 ч на RT на орбитальном шейкере с использованием низкой скорости (защитный раствор от света).
  5. Перелить срезы в лунку вставить в 6-луночную пластину для отделения срезов от раствора вторичных антител.
  6. Продолжая защищать образцы от света, промыть 2 раза 1x TBS в течение 30 с на RT. Затем промыть в течение 15 мин в 1x TBS, при желании добавить DAPI (1-0,1 мкг/мл).

6. Монтаж

  1. Перелейте срезы в стеклянную, прямоугольную гистологическую камеру, заполненную на три четверти 1x TBS.
  2. Погрузите стеклянную горку в 1x TBS и используйте тонкую кисть, чтобы склонить секции к слайду.
  3. Осторожно постучите по секциям на слайде, убедившись, что нет морщин или складок.
  4. Повторяйте до тех пор, пока все секции не будут установлены на слайд(ы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда весь мозг, например, разрезается на 40 мкм, собирают в 12-луночные вставки с одной аликвотой, содержащей 18-24 сечения; срезы обычно монтируются на 1-2 слайдах, но меньше секций также может быть установлено на слайд в зависимости от предпочтений исследователя.

7. Обшивка

  1. После того, как секции высушены на слайде (слайдах), примерно через 10-15 минут на RT или до тех пор, пока секции не станут непрозрачными (не забудьте защитить слайды от света), нанесите соответствующую водную монтажную среду (затвердевающую или нетвердеющую). Антифейдинг является предпочтительным при использовании флуоресцентного конъюгированного вторичного антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество флуоресценции может быть ниже при использовании упрочняющего монтажного носителя, но слайды должны служить дольше.
  2. Используя пинцет, поместите крышку поверх среды. Накройте крышкой фильтровальной бумагой и плотно прижмите, чтобы удалить лишнюю монтажную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании незатвердевающего крепления покрасьте края обшивки прозрачным лаком для ногтей.
  3. Изображение участков с помощью соответствующего микроскопа. Хранить в темной коробке при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Участки могут быть визуализированы с помощью различных микроскопов, таких как лазерное сканирование конфокальной и инвертированной или вертикальной широкоугольной флуоресценции, при увеличении (например, 10x, 20x, 40x) на основе потребностей исследователя.

Результаты

Общая схема использования свободно плавающего метода для выполнения флуоресцентного иммуногистохимического анализа проиллюстрирована на фиг.1. Репрезентативный пример флуоресцентного IHC с использованием свободно плавающего метода в мозге мыши, исследующего экспрес...

Обсуждение

Иммуногистохимия (IHC) является универсальным методом, который стал решающим в выявлении экспрессии и локализации белка в срезах тканей. Этот анализ используется во всем научном сообществе для дальнейшего понимания характеристик тканей на разных стадиях нормальной функции до болезнен...

Раскрытие информации

Нечего раскрывать

Благодарности

Мы хотели бы отметить Национальный институт по проблемам старения (K99/R00 AG055683 для JMR), Институт неврологии Джорджа и Энн Райан (EP, GC, JMR), Фармацевтический колледж при Университете Род-Айленда (EP, GC, JMR) и Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Мы благодарим докторанта Ребекку Сенфт, обучающуюся у профессора Сьюзан Дымецки, кафедра генетики Гарвардской медицинской школы, за то, что она познакомила нас со свободно плавающим методом. Некоторые изображения, используемые на рисунке 1, были получены из «свободных для использования, совместного использования или изменения, даже коммерческих» источников: мыши и микроцентрифужная трубка (Pixabay), мозг мыши (Jonas Töle, Wikimedia Commons), секция криостата и мозга мыши (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), стеклянный контейнер (OpenClipart, FreeSvg.org) и микроскоп (Тереза Нотт, Open Clip Art Library).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12-well platesCorning3513
6-well platesCorning3516
Clear nail polishUser preferenceN/A
DAPISigma-AldrichD9542
Embedding moldsThermo Scientific1841
Ethylene glycolUser preferenceN/A
Formalin solutionFisher ScientificSF98-4
Horse serum, heat inactivatedGibco26050088
Microscope slide boxesElectron Microscopy Services71370
PBSUser preferenceN/A
Primary antibodyUser preferenceN/A
Rectangular CoverslipsVWR48393-08124 x 50 mm
Rectangular staining dishElectron Microscopy Services70312
Round artist paintbrush #2Princeton Select Series3750RBrand not important
Secondary antibodyUser preferenceN/A
Specimen matrix for embeddingOCT Tissue-Tek, Sakura4583
Stain tray – slide staining systemElectron Microscopy Services71396-BUse dark lid
SucroseUser preferenceN/A
Superfrost Plus Micro SlidesVWR48311-703
TBSUser preferenceN/A
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Vectashield antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000Non-hardening
Well inserts for 12-well platesCorning Netwells3477
Well inserts for 6-well platesCorning Netwells3479
Whatman filter paperMillapore-SigmaWHA1440042

Ссылки

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H., Beesley, J. E. . Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. . Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены