Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Zusammenfassung

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Zusammenfassung

Die Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung spezifischer Gewebestrukturen sowie der Proteinexpression und -lokalisation. Zwei alternative Ansätze werden häufig verwendet, um die Gewebeschnitte während des Färbeverfahrens zu handhaben, ein Ansatz besteht darin, die Abschnitte direkt auf Glasobjektträgern zu montieren, während ein zweiter Ansatz, der freischwebende Ansatz, es ermöglicht, feste Abschnitte zu erhalten und zu färben, während sie in Lösung suspendiert sind. Obwohl Slide-Mounted- und Free-Floating-Ansätze zu ähnlichen Ergebnissen führen können, ermöglicht die Free-Floating-Technik eine bessere Penetration von Antikörpern und sollte daher die Methode der Wahl sein, wenn dickere Schnitte für die 3D-Rekonstruktion des Gewebes verwendet werden sollen, zum Beispiel wenn der Fokus des Experiments darauf liegt, Informationen über dendritische und axonale Projektionen in Hirnregionen zu gewinnen. Da die Schnitte in Lösung gehalten werden, können in einem einzigen Aliquot problemlos 30 bis 40 Schnitte aufgenommen werden, deren Handhabung insbesondere bei groß angelegten biomedizinischen Studien weniger aufwendig ist. Hier zeigen wir, wie die Free-Floating-Methode auf die fluoreszierende immunhistochemische Färbung angewendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Hirnschnitten liegt. Wir werden auch diskutieren, wie die Free-Floating-Technik leicht modifiziert werden kann, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden und an andere Gewebe sowie andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin, Eosin und Kresylviolett anzupassen, solange die Gewebeproben richtig fixiert werden, typischerweise mit Paraformaldehyd oder Formalin.

Einleitung

Die Immunfärbung ist eine populäre Forschungspraxis, die vor 130 Jahren mit der Entdeckung von Serumantikörpern im Jahr 1890 durch von Behring¹ begann. Während des frühen 20. Jahrhunderts wurden Farbstoffe an Antigene und später an Antikörper gebunden, um Reaktionen zu quantifizieren und zu visualisieren¹, und 1941 entwickelte Albert Coons die ersten fluoreszierenden Antikörpermarkierungen, eine Entdeckung, die die Lichtmikroskopie revolutionierte ^2,3. Der Begriff "Immunfärbung" umfasst viele Techniken, die nach diesem Prinzip entwickelt wurden, einschließlich Western Blot, Durchflusszytometrie, ELISA, Immunzytochemie und Immunhistochemie ^3,4. Western Blot weist das Vorhandensein bestimmter Proteine aus Gewebe- oder Zellextrakten^{nach 5}. Proteine werden mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt, auf eine Membran übertragen und mit Antikörpern untersucht. Diese Technik zeigt das Vorhandensein von Protein an und wie viel Protein vorhanden ist. Es gibt jedoch keine Informationen über die Lokalisation des Proteins in Zellen oder Geweben. Eine andere Methode, die Immunzytochemie (ICC), markiert Proteine in Zellen, typischerweise Zellen, die in vitro kultiviert werden. ICC zeigt sowohl die Proteinexpression als auch die Lokalisation innerhalb zellulärer Kompartimente⁶. Um ein spezifisches Protein auf Gewebeebene zu erkennen und sichtbar zu machen, wird die Immunhistochemie (IHC) eingesetzt.

IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um spezifische Antigene im Gewebe zu bekämpfen und dabei die chemischen Eigenschaften des Immunsystems zu nutzen ^7,8. Durch die Erzeugung spezifischer primärer und sekundärer Antikörper, die entweder an ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind, können interessante Antigene in den meisten Geweben markiert und nachgewiesen werden (wie in Mepham und Britten beschrieben)⁹. Der Begriff "Immunhistochemie" an sich spezifiziert nicht die Markierungsmethode, die verwendet wird, um das interessierende Antigen zu enthüllen; Daher wird diese Terminologie oft mit der Detektionstechnik kombiniert, um die Markierungsmethode klar abzugrenzen: chromogene Immunhistochemie (CIH), um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Enzym wie Peroxidase konjugiert ist; oder fluoreszierende IHC, um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Fluorophor wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodamin (TRITC) konjugiert ist. Die Selektivität der IHC ermöglicht es Klinikern und Forschern, die Proteinexpression und -verteilung in verschiedenen Geweben über verschiedene Gesundheits- und Krankheitszustände hinweg zu visualisieren¹⁰. Im klinischen Bereich wird IHC häufig zur Diagnose von Krebs sowie zur Bestimmung von Unterschieden bei verschiedenen Krebsarten eingesetzt. IHC wurde auch verwendet, um verschiedene Arten von mikrobiellen Infektionen im Körper zu bestätigen, wie Hepatitis B oder C¹¹. In der biomedizinischen Forschung wird IHC häufig verwendet, um die Proteinexpression in Geweben abzubilden und ist wichtig für die Identifizierung abnormaler Proteine, die in Krankheitszuständen beobachtet werden. Zum Beispiel geht die Neurodegeneration oft mit einer Anhäufung abnormaler Proteine im Gehirn einher, wie z. B. Αβ-Plaques und neurofibrilläre Verwicklungen bei der Alzheimer-Krankheit. Tiermodelle werden dann oft entwickelt, um diese pathologischen Zustände nachzuahmen, und IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um die interessierenden Proteine zu lokalisieren und zu quantifizieren^10,12,13. Im Gegenzug können wir mehr über die Ursachen dieser Krankheiten und die Komplikationen, die mit ihnen auftreten, erfahren.

Es gibt viele Schritte, die bei der Durchführung von IHC erforderlich sind. Zuerst wird das interessierende Gewebe gesammelt und für die Färbung vorbereitet. Die meisten Forscher präparieren wohl fixierte Gewebeproben, wobei die Perfusion des Fixiermittels über das Kreislaufsystem optimal ist, da es die Morphologie bewahrt^14,15. Eine nachträgliche Fixierung von Gewebeproben kann ebenfalls verwendet werden, kann jedoch zu weniger als idealen Ergebnissen führen¹⁶. Vernetzende Fixiermittel wie Formaldehyd wirken, indem sie chemische Bindungen zwischen Proteinen im Gewebe^{herstellen 17}. Fixiertes Gewebe wird dann mit einem Mikrotom in sehr dünne Schichten oder Abschnitte geschnitten, wobei viele Forscher es vorziehen, gefrorene Abschnitte mit einem Kryostaten zu sammeln. Von dort wird das Gewebe gesammelt und entweder direkt auf einen Objektträger montiert (Slide-Mounted-Methode) oder in einer Lösung suspendiert (Free-Floating-Methode), wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)¹⁸. Die verwendete Erfassungsmethode wird auf der Grundlage der Bedürfnisse des Forschers festgelegt, wobei jede dieser beiden Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile aufweist.

Die Slide-Mounted-Methode ist mit Abstand die am weitesten verbreitete, mit einem wichtigen Vorteil, dass sehr dünne Schnitte (10-14 μm) hergestellt werden können, was z.B. wichtig ist, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es gibt auch eine minimale Handhabung der Probe, was eine mögliche Schädigung der strukturellen Integrität des Gewebes^{verringert 19}. Forscher verwenden diese Technik häufig mit frischem gefrorenem Gewebe (Gewebe, das sofort mit Trockeneis, Isopentan usw. eingefroren wird), das im Vergleich zu festem Gewebe sehr empfindlich ist und viel Sorgfalt walten lässt, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von auf Objektträgern montierten Abschnitten besteht darin, dass in der Regel keine großen Mengen an Lösungen für die Färbung benötigt werden⁴. So können Forscher eine kleinere Menge teurer Antikörper oder anderer Chemikalien verwenden, um die Färbung zu vervollständigen. Darüber hinaus ist es möglich, Schnitte aus mehreren verschiedenen Versuchsgruppen auf demselben Dia zu montieren, was insbesondere bei der Bildaufnahme von Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile bei der Verwendung von Objektträgerschnitten, vor allem, dass der Gewebeschnitt auf dem Objektträger haftet, wodurch das Eindringen von Antikörpern auf eine Seite des Abschnitts beschränkt wird, was die Schnittdicke und die 3D-Darstellung des Gewebes begrenzt. Es kann auch vorkommen, dass sich beim Waschen die Ränder des Gewebes und ganze Abschnitte vom Objektträger lösen und das gesamte Experiment unbrauchbar machen. Darüber hinaus muss die IHC in der Regel relativ schnell durchgeführt werden, wenn der Objektträgeransatz verwendet wird, um einen Abbau des Antigenepitops 20,21 zu vermeiden, wobei unverarbeitete Objektträger typischerweise bei -²⁰ oder -⁸⁰ °C gelagert werden, oft abgedeckt und horizontal oder in Objektträgerkästen gelagert werden^, was zu einem relativ großen Speicherbedarf führt. Schließlich kann die Slide-Mounted-Technik auch zeitaufwendig sein, wenn Forscher eine große Anzahl von Objektträgern handhaben müssen, um eine große Anzahl von Gewebeschnitten zu verarbeiten.

Aufgrund einiger dieser Herausforderungen bei der Verwendung der Slide-Mounted-Methode ist eine Modifikation, die als Free-Floating-Methode bezeichnet wird, zu einer beliebten Alternative geworden. Diese Technik kam in den 1960-70er Jahren in die Literatur 22,23,24 und gewann in den 1980er Jahren an Popularität 25,26,27,28,29 und ist heute eine etablierte Methode, bei der die Färbung auf den gesammelten Abschnitten in Suspension durchgeführt wird, anstatt ^an einem Objektträger zu haften ^12,30,31 . Die Free-Floating-Methode wird nicht empfohlen, wenn die Gewebeschnitte kleiner als 20 μm sind. Unserer Erfahrung nach ist es jedoch der Ansatz der Wahl, wenn dickere (40-50 μm) Abschnitte gefärbt werden sollen. Ein deutlicher Vorteil besteht darin, dass Antikörper frei schwebende Abschnitte aus allen Winkeln durchdringen können und aufgrund eines effektiveren Waschens weniger Hintergrundfärbung erzeugen, was zu einer besseren Signalübertragung bei der Bildgebung führt. Darüber hinaus werden die Schnitte nach der Verarbeitung auf die Objektträger montiert, wodurch die Möglichkeit einer Gewebeablösung ausgeschlossen wird und die Verweildauer des Kryostaten verringert wird. Die Free-Floating-Methode kann auch viel weniger arbeitsintensiv sein, insbesondere für groß angelegte biomedizinische Studien. Zum Beispiel ist es möglich, viele (18-40) Schnitte aus derselben Probe zusammen in derselben Vertiefung zu färben, was Zeit bei der Durchführung der Wasch- und Antikörperinkubationsschritte spart. Da mit diesem Ansatz eine größere Anzahl (12-16) von Schnitten pro Folie montiert werden kann, ist es für den Forscher oft bequemer und schneller, Schnitte anzuzeigen und abzubilden. Insbesondere bei der Montage von Gewebeschnitten auf den Objektträgern können Abschnitte befestigt und abgenommen werden, bis die gewünschte Orientierung erreicht ist. Die Forscher verwenden auch oft etwas niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit der Free-Floating-Methode, und da die Inkubationen in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden, können die Antikörper leicht gesammelt und mit Natriumazid für die Wiederverwendung konserviert werden (siehe Schritt 5.1). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Schnitte direkt bei -80 °C in kleinen Mikrozentrifugenröhrchen mit kryoprotektiver Lösung³² gelagert werden können, wodurch der Lagerraum minimiert und die Langlebigkeit der Proben³³ maximiert wird. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Abschnitte viel gehandhabt werden und daher anfällig für Beschädigungen sind. Dies kann jedoch durch niedrige Schüttel- und Drehgeschwindigkeiten sowie durch eine angemessene Schulung der Forscher für den Transfer der Proben und die Montage der Abschnitte auf den Objektträgern gemildert werden.

Zusammengenommen ist IHC ein etabliertes, essentielles Werkzeug für die Visualisierung und Lokalisierung der Proteinexpression sowohl in der klinischen als auch in der biomedizinischen Forschung. Free-floating-IHC ist eine effiziente, flexible und wirtschaftliche Methode, insbesondere bei der Durchführung umfangreicher histologischer Studien. Hier stellen wir ein zuverlässiges, frei schwebendes fluoreszierendes IHC-Protokoll für die wissenschaftliche Gemeinschaft vor, das entsprechend für chromogene IHC- und andere Färbungen wie Hämatoxylin- und Eosin- oder Kresylviolettfärbung angepasst werden kann.

Protokoll

1. Gewebevorbereitung für die Kryosektion

1. Fixiertes Gewebe in eine geeignete Einbettform einbetten (siehe Materialtabelle), um einen Probenblock mit einer geeigneten Probenmatrix zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und auf Trockeneis einfrieren. Lagern Sie Probenblöcke bei -80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind.
   ANMERKUNG: Festsitzende Gewebe werden in der Regel durch Perfusionierung von erwachsenen (ca. 2,5 – 30 Monate alten) männlichen oder weiblichen Nagetieren (Maus oder Ratte)³⁴ in Übereinstimmung mit der verfügbaren ethischen Erlaubnis mit einem geeigneten Fixiermittel (z. B. 10 % Formalin) hergestellt, gefolgt von nachfixierenden Geweben in demselben Fixiermittel für 12 h bei 4 °C, wobei das Gewebe dreimal mit 1x PBS gewaschen wird. und Gewebe in 15% und dann 30% Saccharose in 1x PBS über Nacht oder bis das Gewebe³⁵ sinkt. Forscher können versuchen, dieses allgemeine Protokoll an verschiedene Entwicklungsstadien anzupassen.

2. Kryosektion

1. Wenn Sie zum Schnitt bereit sind, akklimatisieren Sie die Proben vor dem Schneiden mindestens 1-2 h im Kryostaten, um ein Zerbrechen des Gewebes zu verhindern.
2. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten in Abschnitte (20-50 μm) und sammeln Sie es in 6- oder 12-Well-Einsätzen (siehe Materialtabelle), die mit 1x PBS-Lösung gefüllt sind.
   HINWEIS: Abhängig von der Dicke des Abschnitts, der Menge des zu sammelnden Gewebes und der Anzahl der verwendeten Vertiefungseinsätze enthält jede Vertiefung eine variable Anzahl von Abschnitten, die sich über etwa 10 bis 40 Schichten erstreckt. Wenn zum Beispiel ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, werden in jeder Vertiefung etwa 18-24 Abschnitte mit 12-Well-Einsätzen gesammelt. Außerdem können 20-μm-Abschnitte etwas schwierig zu handhaben sein, daher werden 40 μm für die Bulk-Färbung empfohlen (siehe Diskussion).

3. Speichern von Abschnitten

1. Nach dem Sammeln die Abschnitte mit frisch zubereitetem 1x PBS für 5 min waschen. Wiederholen Sie 3 mal.
2. Die Schnitte werden in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die mit 1-1,5 mL Aufbewahrungslösung gefüllt sind (für 250 ml 70 g Saccharose, 75 ml Ethylenglykol mischen und mit 0,1 M Phosphatpuffer zum Volumen bringen).
3. Bei -80 °C bis zur Färbung lagern.

4. Färbung Tag I

1. Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min äquilibrieren.
2. Gießen Sie Abschnitte in einen Brunneneinsatz in einer 6-Well-Platte, um die Speicherlösung von den Abschnitten zu trennen.
3. Schieben Sie den Well-Einsatz in eine andere Vertiefung, die ca. 6 ml 1x TBS enthält. Waschen Sie 3 mal mit 1x TBS für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit bei RT.
4. Während der Schnitte gewaschen werden, bereiten Sie 7 ml (pro Probe) einer blockierenden permeabilisierenden Lösung vor, die aus 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% normalem Serum (z. B. normalem Pferdeserum) besteht. Blockieren Sie Abschnitte für 30 Minuten bei RT auf Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit.
   HINWEIS: Die Blockierung mit Seren verhindert die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebe oder unspezifische Fc-Rezeptoren – ein Serum, das der Spezies des sekundären Antikörpers entspricht, wird empfohlen, aber wenn nicht verfügbar, kann ein normales Serum von einer anderen Spezies als dem primären Antikörper-Wirtstier verwendet werden. Das Reinigungsmittel Triton X-100 ermöglicht eine bessere Penetration der Antikörper durch Permeabilisierung des Gewebes.
5. Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer primären Antikörperlösung, bestehend aus ausgewählten Primärantikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 1 % normalem Serum vor (siehe Hinweis zu Schritt 4.4). Transferschnitte aus dem Bohrloch in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das die primäre Antikörperlösung enthält, um an die interessierenden Antigene zu binden.
   HINWEIS: Es können mehrere primäre Antikörper verwendet werden (die in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden).
6. Das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnitten wird mit niedriger Drehzahl (z. B. Drehzahl 7 U/min) auf einen rotierenden Mischer gestellt und über Nacht für 12-16 h bei 4 °C inkubiert.

5. Färbetag II

1. Gießen Sie am nächsten Tag Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um die Abschnitte von der primären Antikörperlösung zu trennen.
   HINWEIS: Antikörperlösung kann gesammelt und wiederverwendet werden; Fügen Sie 0,02% (w/v) Natriumazid hinzu, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen.
2. Sektionen 3 mal mit 1x TBS bei RT waschen (30 s für die ersten 2 Wäschen und 10 min für die Endwäsche).
3. Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer sekundären Antikörperlösung, bestehend aus geeigneten sekundären Antikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 1% normalem Serum (Lichtschutzlösung) vor.
   HINWEIS: Die indirekte Markierung mit einem konjugierten sekundären Antikörper verstärkt das Signal und ermöglicht eine kolorimetrische oder fluoreszierende Visualisierung des Proteinziels.
4. Überführen Sie die Schnitte in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit sekundärer Antikörperlösung. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit (Abschirmlösung vor Licht).
5. Gießen Sie Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um Abschnitte von der sekundären Antikörperlösung zu trennen.
6. Um die Proben weiterhin vor Licht zu schützen, waschen Sie 2 mal mit 1x TBS für 30 s bei RT. Anschließend 15 min in 1x TB waschen, nach Belieben DAPI (1-0,1 μg/ml) hinzufügen.

6. Montage

1. Gießen Sie Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit 1x TBS gefüllt ist.
2. Tauchen Sie einen Glasträger in den 1x TBS und verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Abschnitte in Richtung der Folie zu locken.
3. Klopfen Sie die Abschnitte vorsichtig auf die Schiene und achten Sie darauf, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Abschnitte auf den Schienen montiert sind.
   ANMERKUNG: Wenn z.B. ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, gesammelt in 12-Well-Inserts, wobei ein Aliquot 18-24 Abschnitte enthält; Slices werden in der Regel auf 1-2 Folien montiert, aber je nach Präferenz des Forschers können auch weniger Abschnitte pro Folie montiert werden.

7. Coverslipping

1. Nachdem die Abschnitte auf den Objektträgern getrocknet sind, etwa 10-15 Minuten bei RT oder bis die Abschnitte undurchsichtig aussehen (denken Sie daran, die Objektträger vor Licht zu schützen), tragen Sie ein geeignetes wässriges Einbettmedium auf (aushärtend oder nicht aushärtend). Antifading wird bevorzugt, wenn ein fluoreszierender konjugierter sekundärer Antikörper verwendet wird.
   HINWEIS: Die Fluoreszenzqualität kann bei Verwendung eines aushärtenden Einbettmediums geringer sein, aber die Objektträger sollten länger halten.
2. Legen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas auf das Medium. Decken Sie das Gerät mit Filterpapier ab und drücken Sie es fest an, um überschüssiges Befestigungsmedium zu entfernen.
   HINWEIS: Wenn Sie eine nicht aushärtende Halterung verwenden, streichen Sie die Kanten des Deckglas-Objektträgers mit klarem Nagellack zum Versiegeln.
3. Bildausschnitte mit einem geeigneten Mikroskop. In einem dunklen Schieberkasten bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Schnitte können mit einer Vielzahl von Mikroskopen abgebildet werden, z. B. mit konfokaler und inverser Laserscanning- oder aufrechter Weitfeldfluoreszenz, bei Vergrößerungen (z. B. 10x, 20x, 40x), je nach den Bedürfnissen des Forschers.

Ergebnisse

Das Gesamtschema der Verwendung der Free-Floating-Methode zur Durchführung eines fluoreszierenden immunhistochemischen Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für eine fluoreszierende IHC unter Verwendung der Free-Floating-Methode im Gehirn von Mäusen, bei der die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) untersucht wird, ist in Abbildung 2 sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Vergrößerung dargestellt, um die Ge...

Diskussion

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine vielseitige Technik, die für die Identifizierung der Proteinexpression und -lokalisation in Gewebeschnitten von entscheidender Bedeutung ist. Dieser Assay wird in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um die Eigenschaften von Gewebe über Stadien der normalen Funktion bis hin zu Krankheitszuständen besser zu verstehen. IHC wird in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, von der klinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs bis hin zu ersten Entdeckungen in der prä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042