הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את הישימות של הגרסה האחרונה של השלמת לוציפראז מפוצל להדגמת מתחמים הטרולוגיים שנוצרו על ידי מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs). חלבונים רב-תכליתיים אלה, התושבים בחדר המיון ובגולגי, נושאים את הסוכרים הנוקלאוטידים המסונתזים מבחינה ציטופלסמית על פני ממברנות האברונים כדי לספק אנזימים המתווכים גליקוזילציה עם המצעים שלהם. NSTs קיימים כמו דימרים ו / או אוליגומרים גבוהים יותר. כמו כן דווח על אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים. כדי לוודא אם הטכניקה מתאימה לחקר התופעה של הטרומריזציה של NST, בדקנו אותה מול שילוב של שני NSTs תושב גולגי שהוכחו בעבר כמקשרים במספר אמצעים אחרים. בדיקת ההשלמה של לוציפראז נראית מתאימה במיוחד לחקר אינטראקציות בין חלבוני ממברנה תושבי גולגי, שכן היא אינה דורשת רמות הבעה גבוהות, אשר לעתים קרובות לעורר מיקום שגוי של חלבון ולהגדיל את הסיכון של חיובי שווא.

Introduction

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבדוק את נוכחותם של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי בתאים אנושיים שהודבקו באופן חולף באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. ההליך נבדק בהרחבה ביותר נגד מובילי סוכר נוקלאוטידים (NSTs) אבל הצלחנו גם להשיג תוצאות חיוביות עבור חלבונים אחרים מסוג גולגי סוג III ממברנה אשר N- ו / או C-termini עומדים בפני הציטופלסמה.

קבוצת המחקר שלנו בוחנת את תפקידם של NSTs בגליקוזילציה של מקרומולקולות. NSTs הם חלבוני ממברנה מסוג III מסוג Golgi ו/או ER עם N- ו- C-termini הפונים לצד הציטופלסמי של הממברנה ^{האורגנית1}. NSTs נחשבים לשאת סוכרים המופעלים נוקלאוטידים על פני ממברנות אברונים כדי לספק גליקוסילטרפרנספראזס עם המצעים שלהם. NSTs יוצרים דימרים ו/או אוליגומרים גבוהים יותר2,3,4,5,6,7,8,9,10. יתר על כן, אינטראקציות הטרולוגיות בין NSTs שונים דווחו גם ^6,11. NSTs הוכחו גם כדי ליצור קומפלקסים עם אנזימי גליקוסילציה הקשורים פונקציונלית12,13,14. חיפשנו אלטרנטיבה לטכניקה הנמצאת בשימוש כיום, הדמיה לכל החיים פלואורסצנטית (FLIM) מבוססת גישת FRET, לחקר אינטראקציות של NSTs וחלבונים הקשורים לגולגי הקשורים לתפקוד, ולכן החלטנו לבדוק את בדיקת ההשלמה של לוציפראז הפיצול. זה איפשר לנו לזהות אינטראקציה חדשנית בין NST ואנזים גליקוזילציה הקשורים ^{לתפקודית9}.

השינוי האחרון של בדיקת ההשלמה פיצול לוציפראז, NanoBiT, משמש בפרוטוקול המוצג ^כאן15. הוא מסתמך על שחזור של האנזים לוציפראז (למשל, NanoLuc) משני השברים - הגדול, המכונה BiT גדול או LgBiT, חלבון 17.6 kDa, ואת הקטן, המורכב רק 11 חומצות אמינו, המכונה BiT קטן או SmBiT. שני החלבונים המעניינים מותכים עם השברים המשלימים ומתבטאים באופן חולף בקו תאים אנושי. אם שני חלבוני ההיתוך מתקשרים, אור נוצר במקום עם תוספת של מצע חדיר לתא. שני שברים אלה עברו אופטימיזציה כך שהם מתרועעים עם זיקה מינימלית אלא אם כן הם מובאים יחד על ידי אינטראקציה בין חלבוני העניין שהם מותכים.

באופן כללי, לשיטות מבוססות ביולומינציה יש כמה יתרונות על פני אלה המבוססים על פלואורסצנטיות. לאותות ביו-זוהרים יש יחס אות-לרעש גבוה יותר מכיוון שהאור ברקע זניח בהשוואה לאות שמקורו ^{בלוציפראז16}. לעומת זאת, גישות מבוססות פלואורסצנטיות סובלות בדרך כלל מרקע גבוה יחסית הנגרם על ידי תופעת ההפלורציה האוטומטית. חוץ מזה, ביולומינציה פחות מזיקה לתאים המנותחים מאשר פלואורסצנטיות, כמו במקרה הקודם אין צורך לרגש את המדגם. מסיבות אלה גישות ביו-זוהרות לחקר PPIs ב- vivo עולות על השיטות הפלואורסצנטיות הנפוצות כמו העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) או השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC).

הפרוטוקול שלנו מסתמך על הפניית אור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב הבקרה. האחרון כולל את אחד החלבונים שנבדקו אשר מותך עם שבר גדול יותר חלבון בקרה (למשל, HaloTag), התמזג עם שבר קטן יותר. האחרון הוא חלבון ממוצא חיידקי שאינו צפוי לקיים אינטראקציה עם אף אחד מחלבוני היונקים. שימוש בחלבון זה כבקרה מציב מגבלות לטופולוגיה של זוגות החלבונים של תושבי גולגי שיש לנתח. מאז בתאי יונקים חלבון זה מסונתז בציטופלסמה, שני החלבונים של עניין צריך להיות לפחות זנב ציטופלסמי אחד.

גישה זו יכולה להיות שימושית במיוחד להקרנה ראשונית של ממשקי PPIs. זה עשוי להיות שיטת הבחירה כאשר חלבוני ההיתוך של עניין באים לידי ביטוי ברמות כי הם פשוט לא מספיק עבור גישות אחרות להיות מיושם. באופן דומה, הבדיקה המשלימה לוציפראז פיצול יכול להיות האפשרות הטובה ביותר אם החלבונים של עניין באים לידי ביטוי ברמות גבוהות, אבל זה משפיע לרעה על לוקליזציה תת תאית שלהם או ידוע לכפות אינטראקציות לא ספציפיות. מאז שבר קטן יותר יש רק 11 חומצות אמינו, בדיקת ההשלמה לוציפראז לפצל ניתן ליישם בעת שימוש בתגים גדולים יותר הוא בלתי אפשרי. לבסוף, ניתן להשתמש בו כדי לאשר עוד יותר נתונים שהושגו באמצעות טכניקות אחרות, כמו במקרה המוצג כאן.

Protocol

1. דור הפלסמידים של הביטוי

1. בחן את טופולוגיית הממברנה של החלבונים המעניינים באמצעות כלי חיזוי טופולוגיה.
2. תכנן את אסטרטגיית השיבוט כך שהשברים הגדולים והקטנים יותר יעמדו בפני הציטופלסמה ברגע שחלבוני ההיתוך הוכנסו לקרומי גולגי. אם, כמו במקרה המוצג כאן, הן N והן C-termini של חלבונים מעניינים מכוונים ציטופלסמית, תייג את החלבונים בשמונה דרכים אפשריות (ראה איור 1B). אם N- או C-terminus של אחד או שניהם חלבונים של עניין הוא מכוון זוהר, אל תכלול אותו תיוג.
3. Subclone את הגנים של עניין לתוך וקטורים ביטוי מתאים (ראה רשימת חומרים) על ידי ביצוע פרוטוקולי שיבוט סטנדרטיים.
   הערה: מומלץ לבדוק את כל הכיוונים האפשריים, מכיוון שאפשרויות תיוג מסוימות עשויות שלא לפעול עקב קרבה לא מספקת, כיוון תת-אופטימלי או אילוצים מרחביים.

2. טרנספקטיבה חולפת של הביטוי פלסמידים לתאים

1. לקצור את תרבית התא HEK293T דבק על ידי טריפסיניזציה ו resuspend התאים במדיום צמיחה מלא ייעודי. צלחת התאים (2 x ¹⁰⁴/100 μL / טוב) על צלחת תחתית ברורה, צד לבן 96-well. התאם את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והפקדים שנבדקו, כולל עותקים משוכפלים.
   הערה: נסו להשתמש רק ב-60 הבארות הפנימיות של הצלחת כדי למזער את השינויים התרמיים ולהימנע מאידוי בן לילה. שימוש בלוחות מצופים פולי-D-ליזין מומלץ מאוד כגון אלה המצוינים בטבלת החומרים, אחרת תאים עשויים להתנתק במהלך שלבי הכביסה הבאים.
2. תרבית את התאים לילה בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5° C (5% _CO2).
3. למחרת להעביר את התאים עם השילובים הרצויים של plasmids ביטוי המתקבל בנקודה 1.1.
   1. מדלל פלסמידים ביטוי במדיום ללא סרום (ראה טבלת חומרים) ל 6.25 ng/μL עבור כל מבנה.
   2. הוסף את ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם ביחס מתאים שומנים ל- DNA ודגור על פי הוראת היצרן.
   3. הוסף 8 μL של שומנים בדם: תערובת DNA לבארות ייעודיות. מערבבים את תכולת הצלחת על ידי סיבוב עדין. התוצאה היא טרנספקטציה של שני מבני הביטוי ב 50 ng / טוב.
4. תרבית את התאים עבור 20-24 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 °C (37 °C (5% _CO2).
   הערה: Culturing התאים במשך זמן רב יותר עלול לגרום לרמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון היתוך, אשר עשוי לקדם קשר לא ספציפי בין השברים.

3. החלפה בינונית

1. למחרת להחליף את המדיום המותנה עם 100 μL של מדיום ללא סרום בכל באר. ודא שהתאים לא התנתקו בעת חילופים בינוניים.
   הערה: שלב זה צריך להיעשות 2-3 שעות לפני הוספת פתרון העבודה furimazine. נסיגת סרום ממזערת את הרקע הנגרם על ידי autoluminescence של furimazine.

4. הכנת פתרון עבודה פורימזין

1. רגע לפני המדידה, יש לערבב נפח אחד של furimazine עם 19 כרכים של מאגר דילול (דילול של פי 20).
   הערה: הנפח הכולל של פתרון העבודה furimazine להיות מוכן תלוי במספר בארות בודדות שיש לנתח (פתרון העבודה furimazine מתווסף למדיום תרבית התא ביחס 1:5, ולכן, לכל היטב בעבר מלא עם 100 μL של מדיום ללא סרום 25 μL של פתרון העבודה furimazine יש להוסיף).
2. מוסיפים את פתרון העבודה furimazine לבארות ייעודיות (25 μL / טוב). מערבבים בעדינות את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (למשל, 15 שניות ב-300-500 סל"ד).

5. מדידת זוהר

1. הכנס את הצלחת לקורא מיקרו-לוחית זוהר.
   1. עבור ניסויים כי הם להתבצע ב 37 °C (50 °F) שיווי משקל הצלחת במשך 10-15 דקות בטמפרטורה שצוינה.
2. בחר את הבארות שיש לנתח.
3. קרא את הזוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר זוהר עד 2 שעות בעת הצורך.

6. ניתוח נתונים

1. חשב ערכים ממוצעים וחריגות תקן עבור כל השילובים שנבדקו ושלטו.
2. נתח נתונים באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות.
3. חשב ערכי שינוי קיפול על-ידי חלוקת אור ממוצע המתקבל עבור שילובים של עניין על-ידי אור ממוצע המתקבל עבור הפקדים השליליים המתאימים. הערך את התוצאות.
   הערה: הגישה לניתוח נתונים המוצעת כאן מניחה כי ניתן לתבוע את האינטראקציה אם האור המתקבל עבור השילוב שנבדק גבוה סטטיסטית באופן סטטיסטית מהאור המתקבל עבור שילוב הבקרה המתאים, ובמקביל, היחס בין שני ערכים אלה עולה על 10.

תוצאות

כדי להשיג את הנתונים האמינים ביותר בגישה זו יש לבדוק את כל השילובים האפשריים (ראו איור 1). במקביל, יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים. השליטה החיובית צריכה להיות מורכבת משני החלבונים הידועים כאינטראקציה, מתוכם אחד מותך עם השבר הגדול יותר והשני מותך עם השבר הקטן יותר. השליטה השל...

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המאפשר הדגמה של מתחמים הטרולוגיים שנוצרו בין חלבוני קרום מסוג III תושב גולגי, כגון NSTs, באמצעות בדיקת השלמת לוציפראז פיצול. הגישה המוצעת לניתוח נתונים ופרשנות כרוכה בהתייחסות לאור המתקבל עבור שילוב החלבון של עניין לאור המתקבל עבור שילוב השליטה המתאים, המורכב מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler