Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III Гольджи с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы

Резюме

Представленный здесь протокол предназначен для демонстрации возникновения гетерологичных взаимодействий между мембранными белками гольджи-резидентного типа III с цитоплазматически экспонированными N- и/или C-терминами в живых клетках млекопитающих с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы.

Аннотация

Целью данного протокола является изучение применимости самого последнего варианта комплементации расщепленной люциферазы для демонстрации гетерологичных комплексов, образованных нуклеотидными сахарными транспортерами (НСТ). Эти ER- и гольджи-резидентные мультитрансмембранные белки переносят цитоплазматически синтезированные нуклеотидные сахара через мембраны органелл для снабжения ферментами, которые опосредуют гликозилирование с их субстратами. НСТ существуют в виде димеров и/или более высоких олигомеров. Сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ. Чтобы проверить, подходит ли метод для изучения явления гетеромеризации NST, мы протестировали его на комбинации двух НСТ Гольджи, которые, как было ранее показано, связываются несколькими другими способами. Анализ комплементации люциферазы, по-видимому, особенно подходит для изучения взаимодействий между мембранными белками-резидентами Гольджи, поскольку он не требует высоких уровней экспрессии, которые часто вызывают неправильную локализацию белка и увеличивают риск ложных срабатываний.

Введение

В этой рукописи описывается пошаговый протокол проверки наличия гетерологичных взаимодействий между мембранными белками типа III гольджи в транзиторно трансфектированных клетках человека с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы. Процедура была наиболее широко протестирована против нуклеотидных сахарных транспортеров (NST), но мы также смогли получить положительные результаты для других мембранных белков типа III, резидентные по Гольджи, чьи N- и / или C-термины обращены к цитоплазме.

Наша исследовательская группа исследует роль НСТ в гликозилировании макромолекул. NST представляют собой гольджи- и/или ER-резидентные мембранные белки типа III с N- и C-терминами, обращенными к цитоплазматической стороне органеллярной ^{мембраны1}. Считается, что NST переносят нуклеотид-активированные сахара через мембраны органелл для снабжения гликозилтрансферазами с их субстратами. НСТ образуют димеры и/или более высокие олигомеры2,3,4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными ^НСТ6,11. Также было продемонстрировано, что НСТ образуют комплексы с функционально родственными ферментами гликозилирования12,13,14. Мы искали альтернативу используемому в настоящее время методу, подходу FRET на основе флуоресцентной визуализации (FLIM) для изучения взаимодействий NST и функционально связанных белков-резидентов Гольджи, поэтому мы решили протестировать анализ комплементации расщепленной люциферазы. Это позволило нам идентифицировать новое взаимодействие между NST и функционально связанным ферментом гликозилирования9.

Самая последняя модификация анализа комплементации расщепленной люциферазы, NanoBiT, используется в протоколе, представленном ^здесь15. Он опирается на восстановление фермента люциферазы (например, NanoLuc) из двух фрагментов - большого, называемого большим BiT или LgBiT, белка 17,6 кДа, и маленького, состоящего только из 11 аминокислот, называемого малым BiT или SmBiT. Два интересующих белка сливаются с комплементарными фрагментами и временно экспрессируются в клеточной линии человека. Если два синтезированных белка взаимодействуют, люминесценция образуется in situ при добавлении клеточного проницаемого субстрата. Эти два фрагмента были оптимизированы таким образом, чтобы они ассоциировались с минимальным сродством, если они не были объединены взаимодействием между белками, представляющими интерес, с которыми они слиты.

В целом, методы, основанные на биолюминесценции, имеют некоторые преимущества перед методами, основанными на флуоресценции. Биолюминесцентные сигналы имеют более высокое отношение сигнал/шум, поскольку фоновая люминесценция незначительна по сравнению с сигналом, полученным из люциферазы16. Напротив, подходы, основанные на флуоресценции, обычно страдают от относительно высокого фона, вызванного явлением автофлуоресценции. Кроме того, биолюминесценция менее вредна для анализируемых клеток, чем флуоресценция, так как в первом случае нет необходимости возбуждать образец. По этим причинам биолюминесцентные подходы к изучению ИПП in vivo превосходят широко используемые флуоресцентные методы, такие как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) или бимолекулярное флуоресцентное комплементирование (BiFC).

Наш протокол основан на отсылке люминесценции, полученной для комбинации белков, представляющей интерес, к люминесценции, полученной для контрольной комбинации. Последний включает в себя один из испытуемых белков, который сливается с более крупным фрагментом, и контрольный белок (например, HaloTag), слитый с меньшим фрагментом. Последний представляет собой белок бактериального происхождения, который, как ожидается, не будет взаимодействовать ни с одним из белков млекопитающих. Использование этого белка в качестве контроля создает ограничения для топологии пар белков Гольджи-резидентов, подлежащих анализу. Поскольку в клетках млекопитающих этот белок синтезируется в цитоплазме, оба интересующих белка должны иметь хотя бы один цитоплазматический хвост.

Этот подход может быть особенно полезен для первоначального скрининга ИПП. Это может стать методом выбора, когда интересующие белки слияния выражены на уровнях, которые просто недостаточны для применения других подходов. Аналогичным образом, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть лучшим вариантом, если интересующие белки экспрессируются на высоких уровнях, но это отрицательно влияет на их субклеточную локализацию или, как известно, вызывает неспецифические взаимодействия. Поскольку меньший фрагмент содержит только 11 аминокислот, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть применен при использовании более крупных меток невозможно. Наконец, он может быть использован для дальнейшего подтверждения данных, полученных с использованием других методов, как в случае, представленном здесь.

протокол

1. Генерация экспрессии плазмид

1. Изучите мембранную топологию интересующих белков с помощью инструмента прогнозирования топологии.
2. Разработайте стратегию клонирования таким образом, чтобы большие и меньшие фрагменты сталкивались с цитоплазмой после того, как белки слияния были вставлены в мембраны Гольджи. Если, как в случае, представленном здесь, как N-, так и C-конечные части интересующих белков цитоплазматически ориентированы, пометьте белки восемью возможными способами (см. Рисунок 1B). Если N- или С-конец одного или обоих интересующих белков ориентирован на свет, исключите его из маркировки.
3. Субклонируйте интересующие гены в соответствующие векторы экспрессии (см. Таблицу материалов), следуя стандартным протоколам клонирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тестировать все возможные ориентации, так как некоторые параметры тегирования могут не работать из-за недостаточной близости, неоптимальной ориентации или пространственных ограничений.

2. Транзиторная трансфекция экспрессии плазмид в клетки

1. Соберите адгезивную культуру клеток HEK293T путем трипсинизации и повторно суспендируйте клетки в специальной полной питательной среде. Нанесите ячейки (2 x ¹⁰⁴/100 мкл/лунка) на чистую нижнюю, белую боковую 96-луночную пластину. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех испытанных комбинаций и элементов управления, включая реплики.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь использовать только внутренние 60 колодцев плиты, чтобы свести к минимуму тепловые сдвиги и избежать ночного испарения. Настоятельно рекомендуется использовать пластины с поли-D-лизином, такие как те, которые указаны в Таблице материалов, в противном случае ячейки могут отсоединиться во время последующих этапов промывки.
2. Культивируйте клетки на ночь в стандартных условиях (37 °C, 5% _CO2).
3. На следующий день трансфектируют клетки с желаемыми комбинациями экспрессии плазмид, полученными в точке 1.1.
   1. Разбавляют экспрессию плазмид в среде, свободной от сыворотки (см. Таблицу материалов) до 6,25 нг/мкл для каждой конструкции.
   2. Добавьте трансфекционный реагент на основе липидов с соответствующим соотношением липидов к ДНК и инкубируйте в соответствии с инструкцией производителя.
   3. Добавьте 8 мкл смеси липидов: ДНК в назначенные колодцы. Перемешайте содержимое тарелки мягким вращением. Это приводит к трансфекции обеих конструкций выражений при 50 нг/лунку.
4. Культивировать клетки в течение 20-24 ч в стандартных условиях (37 °C, 5% _CO2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеток в течение более длительного времени может привести к более высоким уровням экспрессии белка слияния, что может способствовать неспецифической ассоциации между фрагментами.

3. Средний обмен

1. На следующий день замените кондиционированную среду 100 мкл безсыворочной среды в каждой лунке. Убедитесь, что клетки не отделились при среднем обмене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует сделать за 2-3 ч до добавления рабочего раствора фуримазина. Сывороточная абстиненция минимизирует фон, вызванный автолюминесценцией фуримазина.

4. Приготовление рабочего раствора фуримазина

1. Непосредственно перед измерением смешайте 1 объем фуримазина с 19 объемами буфера разбавления (20-кратное разведение).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем готовимого рабочего раствора фуримазина зависит от количества отдельных анализируемых скважин (рабочий раствор фуримазина добавляют в среду для культивирования клеток в соотношении 1:5, поэтому к каждой скважине, предварительно заполненной 100 мкл безсыворочной среды, следует добавить 25 мкл рабочего раствора фуримазина).
2. Добавьте рабочий раствор фуримазина в назначенные скважины (25 мкл/лунку). Аккуратно перемешайте пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (например, 15 с при 300-500 об/мин).

5. Измерение люминесценции

1. Вставьте пластину в считыватель люминесцентных микропластин.
   1. Для экспериментов, которые должны проводиться при 37 °C, уравновешивайте пластину в течение 10-15 мин при указанной температуре.
2. Выберите скважины для анализа.
3. Считывание люминесценции со временем интеграции 0,3 с. Продолжайте контролировать люминесценцию в течение 2 ч, когда это необходимо.

6. Анализ данных

1. Рассчитайте средние значения и стандартные отклонения для всех протестированных и контрольных комбинаций.
2. Анализируйте данные с помощью одностороннего ANOVA с помощью нескольких сравнений.
3. Вычисление значений изменения складки путем деления средней люминесценции, полученной для интересующих комбинаций, на среднюю люминесценцию, полученную для соответствующих отрицательных элементов управления. Оцените результаты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предложенный здесь подход к анализу данных предполагает, что взаимодействие может быть заявлено, если люминесценция, полученная для испытуемой комбинации, статистически значимо выше люминесценции, полученной для соответствующей контрольной комбинации, и, в то же время, отношение этих двух значений превышает 10.

Результаты

Для получения наиболее достоверных данных при таком подходе следует протестировать все возможные комбинации (см. рисунок 1). Параллельно следует включать позитивный и отрицательный контроль. Положительный контроль должен состоять из двух белков, которые, как известно, ...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем подробный протокол, позволяющий продемонстрировать гетерологичные комплексы, образующиеся между мембранными белками типа III Гольджи, такими как NST, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. Предлагаемый подход к анализу и интерпретации ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler