スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

要約

ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。

要約

このプロトコルの目的は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)によって形成される異種複合体を実証するためのスプリットルシフェラーゼ相補の最新の変異体の適用可能性を探索することである。これらのERおよびゴルジ常駐多膜貫通タンパク質は、細胞質的に合成されたヌクレオチド糖を細胞小器官膜全体に運び、グリコシル化を媒介する酵素を基質とともに供給する。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴマーとして存在する。異なるNST間の異種相互作用も報告されている。この技術がNSTヘテロマー化の現象の研究に適しているかどうかを検証するために、我々は以前にいくつかの他の手段によって会合することが示された2つのゴルジに常駐するNSTの組み合わせに対してそれを試験した。ルシフェラーゼ相補アッセイは、高い発現レベルを必要とせず、しばしばタンパク質の誤局在化を引き起こし、偽陽性のリスクを高めるため、ゴルジ体常在性膜タンパク質間の相互作用の研究に特に適しているようである。

概要

この原稿では、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新のバリアントを使用して、一過性にトランスフェクトされたヒト細胞におけるゴルジ体常駐III型膜タンパク質間の異種相互作用の存在をチェックするための段階的なプロトコルについて説明しています。この手順は、ヌクレオチド糖トランスポーター(NST)に対して最も広範囲に試験されていますが、N末端および/またはC末端が細胞質に面している他のゴルジ常駐III型膜タンパク質についても肯定的な結果を得ることができました。

我々の研究グループは、巨大分子のグリコシル化におけるNSTの役割を探究している。NSTはゴルジ体および/またはER常駐III型膜タンパク質であり、N末端およびC末端はオルガネラー膜の細胞質側を向いています¹。NSTは、糖転移酵素に基質を供給するために、オルガネラ膜を横切ってヌクレオチド活性化糖を運ぶと考えられている。NSTは二量体および/またはそれ以上のオリゴ^マー2、³、⁴、⁵、⁶、⁷、^8、9、10を形成する。さらに、異なるNST間の異種相互作用も報告されている^6,11。NSTはまた、機能的に関連するグリコシル化酵素との複合体を形成することが実証された¹²、^13、14。私たちは、NSTと機能的に関連するゴルジ体常駐タンパク質の相互作用を研究するために、現在使用されている蛍光寿命イメージング(FLIM)ベースのFRETアプローチに代わるものを探し、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイをテストすることに決めました。これにより、NSTと機能的に関連するグリコシル化酵素との間の新しい相互作用を同定することができました⁹。

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の改変であるNanoBiTは、ここで提示されたプロトコルで使用されています¹⁵。これは、2つの断片からのルシフェラーゼ酵素(例えば、NanoLuc)の再構成に依存している - 大きなBiTまたはLgBiTと呼ばれる大きなもの、17.6kDaのタンパク質、および小さなBiTまたはSmBiTと呼ばれる11個のアミノ酸のみで構成される小さなもの。目的の2つのタンパク質を相補的断片と融合させ、ヒト細胞株中で一過性に発現させる。2つの融合タンパク質が相互作用する場合、細胞透過性基質の添加時にその場で発光が生成される。これら2つの断片は、それらが融合している目的のタンパク質間の相互作用によって一緒にされない限り、それらが最小の親和性で会合するように最適化されている。

一般に、生物発光ベースの方法は、蛍光に基づく方法よりもいくつかの利点を有する。生物発光シグナルは、バックグラウンド発光がルシフェラーゼ由来のシグナルと比較して無視できる程度であるため、より高いシグナル対ノイズ比を有する¹⁶。対照的に、蛍光ベースのアプローチは、通常、自己蛍光の現象によって引き起こされる比較的高いバックグラウンドに苦しむ。その上、生物発光は蛍光よりも分析された細胞にとって有害性が低く、前者の場合のように試料を励起する必要はない。これらの理由から、インビボでPPIを研究するための生物発光アプローチは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)や二分子蛍光相補(BiFC)などの一般的に使用される蛍光法よりも競合します。

我々のプロトコールは、目的のタンパク質組み合わせについて得られた発光を、対照の組み合わせについて得られた発光に参照することに依存している。後者は、より大きな断片と融合された試験されたタンパク質の1つと、より小さな断片と融合された対照タンパク質(例えば、HaloTag)とを含む。後者は、哺乳類のタンパク質のいずれとも相互作用するとは予想されない細菌起源のタンパク質である。このタンパク質を対照として使用すると、分析されるゴルジ常駐タンパク質の対のトポロジーに制限が生じる。哺乳動物細胞ではこのタンパク質は細胞質内で合成されるので、目的の両方のタンパク質は少なくとも1つの細胞質尾部を有するべきである。

このアプローチは、PPIの初期スクリーニングに特に有用であり得る。これは、目的の融合タンパク質が、他のアプローチを適用するには単に不十分なレベルで発現される場合に、選択の方法となり得る。同様に、分割ルシフェラーゼ相補アッセイは、目的のタンパク質が高レベルで発現している場合に最良の選択肢となり得るが、これはそれらの細胞内局在化に悪影響を及ぼすか、または非特異的相互作用を強制することが知られている。より小さい断片は11個のアミノ酸しか有さないので、より大きなタグを使用するのが不可能である場合に分割ルシフェラーゼ相補アッセイを適用することができる。最後に、ここで提示する場合のように、他の技術を用いて得られたデータをさらに確認するために採用することができる。

プロトコル

発現プラスミドの作製

1. トポロジー予測ツールを使用して、目的のタンパク質の膜トポロジーを調べます。
2. 融合タンパク質がゴルジ膜に挿入されると、大きい断片と小さい断片が細胞質に面するようにクローニング戦略を設計します。ここで提示する場合のように、目的のタンパク質のN末端とC末端の両方が細胞質的に配向している場合は、8つの可能な方法でタンパク質にタグを付けます( 図1Bを参照)。目的のタンパク質の一方または両方のN末端またはC末端が光度配向している場合は、タグ付けから除外します。
3. 標準的なクローニングプロトコールに従って、目的の遺伝子を適切な発現ベクター( 材料表を参照)にサブクローニングします。
   メモ: 近接性の欠如、最適でない方向、または空間的制約のために、一部のタグ付けオプションが機能しない可能性があるため、考えられるすべての向きをテストすることをお勧めします。

2. 発現プラスミドの細胞への一過性トランスフェクション

1. トリプシン処理によって付着したHEK293T細胞培養物を回収し、専用の完全増殖培地に細胞を再懸濁する。細胞(2 x ¹⁰⁴/100 μL/ウェル)を透明な底の白い側面96ウェルプレートにプレートします。ウェルの総数を調整して、反復を含むすべての試験済みの組み合わせと対照に対応します。
   メモ: プレートの内側の 60 ウェルのみを使用して、熱シフトを最小限に抑え、一晩の蒸発を回避してください。 材料表に示されているようなポリD-リジンコーティングプレートを使用することを強く推奨し、そうしないとその後の洗浄ステップ中に細胞が剥離する可能性がある。
2. 細胞を標準条件(37°C、5%_CO2)で一晩培養する。
3. 翌日、ポイント1.1で得られた発現プラスミドの所望の組み合わせで細胞をトランスフェクトする。
   1. 発現プラスミドを無血清培地( 材料表を参照)で希釈し、各構築物について6.25 ng/μLに希釈する。
   2. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を適切な脂質対DNA比で添加し、メーカーの指示に従ってインキュベートします。
   3. 8 μL の脂質:DNA混合物を指定されたウェルに加える。プレートの内容物を緩やかな回転で混ぜる。これにより、両方の発現構築物を50ng/ウェルでトランスフェクションする。
4. 細胞を標準条件(37°C、5%CO2)で20〜₂₄時間培養する。
   注:細胞をより長い時間培養すると、融合タンパク質発現のレベルが高くなり、断片間の非特異的な会合が促進される可能性があります。

3. 媒体交換

1. 翌日、馴化培地を各ウェル内の無血清培地100 μLと交換する。培地交換時に細胞が剥離していないことを確認してください。
   注:このステップは、フリマジン作動溶液を添加する2〜3時間前に行う必要があります。血清離脱は、フリマジンの自律発光によって引き起こされるバックグラウンドを最小限に抑える。

4.フリマジン作業溶液の調製

1. 測定の直前に、1容量のフリマジンを19容量の希釈バッファー(20倍希釈)と混合する。
   注:調製されるフリマジン作動溶液の総量は、分析される個々のウェルの数に依存する(フリマジン作動溶液は1:5の比率で細胞培養培地に添加されるので、100μLの無血清培地で以前に充填された各ウェルに25μLのフリマジン作動溶液を添加するべきである)。
2. フリマジン作業溶液を指定されたウェル(25 μL/ウェル)に加えます。プレートを手で、またはオービタルシェーカー(例えば、300〜500rpmで15秒)を使用して静かに混合する。

5. 発光の測定

1. プレートをルミネッセンスマイクロプレートリーダーに挿入します。
   1. 37°Cで行われる実験については、示された温度でプレートを10〜15分間平衡化する。
2. 分析する井戸を選択します。
3. 積分時間0.3秒で発光を読み取る。必要に応じて、発光を最大2時間監視し続けます。

6. データ解析

1. 試験済みと対照のすべての組み合わせの平均値と標準偏差を計算します。
2. 多重比較を伴う一元配置分散分析を使用してデータを分析します。
3. 目的の組合せについて得られた平均発光を、対応する陰性対照について得られた平均発光で割ることによって、フォールド変化値を計算する。結果を評価します。
   注:ここで提案するデータ分析へのアプローチは、試験された組み合わせについて得られた発光が、対応する対照の組み合わせについて得られた発光よりも統計的に有意に高く、同時に、これら2つの値の比が10を超える場合に、相互作用を主張できると仮定する。

結果

このアプローチで最も信頼性の高いデータを取得するには、考えられるすべての組み合わせをテストする必要があります ( 図 1 参照)。並行して、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを含める必要があります。ポジティブコントロールは、相互作用することが知られている2つのタンパク質からなるべきであり、そのうちの1つは大きなフラグメントと融合?...

ディスカッション

ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイを使用して、NSTなどのゴルジ常駐III型膜タンパク質間に形成される異種複合体の実証を可能にする詳細なプロトコルを提供します。データ解析および解釈への提案されたアプローチは、目的のタンパク質の組み合わせについて得られた発光を、より大きな断片と融合した目的のタンパク質の1つおよびより小さい断片と融合した細菌起源の制御タン...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler