Dimostrazione di complessi eterologhi formati da proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa

Riepilogo

Il protocollo qui presentato ha lo scopo di dimostrare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi con N- e/o C-termini esposti citoplasmaticamente in cellule di mammifero vive utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di esplorare l'applicabilità della variante più recente della complementazione della luciferasi divisa per dimostrare complessi eterologhi formati da trasportatori di zucchero nucleotidici (NST). Queste proteine multitransmembrana residenti in ER e Golgi trasportano gli zuccheri nucleotidici sintetizzati citoplasmaticamente attraverso le membrane degli organelli per fornire enzimi che mediano la glicosilazione con i loro substrati. Gli NST esistono come dimeri e/o oligomeri superiori. Sono state riportate anche interazioni eterologhe tra diversi NST. Per verificare se la tecnica è adatta per studiare il fenomeno dell'eteromerizzazione NST, l'abbiamo testata contro una combinazione dei due NST residenti a Golgi che hanno precedentemente dimostrato di associarsi con diversi altri mezzi. Il test di complementazione della luciferasi sembra essere particolarmente adatto per studiare le interazioni tra proteine di membrana residenti nel Golgi, in quanto non richiede alti livelli di espressione, che spesso innescano l'errata localizzazione delle proteine e aumentano il rischio di falsi positivi.

Introduzione

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per verificare la presenza di interazioni eterologhe tra proteine di membrana di tipo III residenti nel Golgi in cellule umane trasfettate transitoriamente utilizzando la variante più recente del test di complementazione della luciferasi divisa. La procedura è stata ampiamente testata contro i trasportatori di zucchero nucleotidici (NST), ma siamo stati anche in grado di ottenere risultati positivi per altre proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi i cui N- e / o C-termini sono rivolti verso il citoplasma.

Il nostro gruppo di ricerca esplora il ruolo degli NST nella glicosilazione delle macromolecole. Le NST sono proteine di membrana di tipo III residenti in Golgi e/o ER con N- e C-termini rivolti verso il lato citoplasmatico della membrana ^organellare1. Si pensa che gli NST trasportino zuccheri attivati da nucleotidi attraverso le membrane degli organelli per fornire glicosiltransferasi con i loro substrati. Gli NST formano dimeri e/o oligomeri superiori2,3,4,5,6,7,8,9,10. Inoltre, sono state riportate anche interazioni eterologhe tra diversi ^NST6,11. È stato anche dimostrato che gli NST formano complessi con enzimi di glicosilazione funzionalmente correlati12,13,14. Abbiamo cercato un'alternativa alla tecnica attualmente utilizzata, l'approccio FRET basato sull'imaging a fluorescenza (FLIM), per studiare le interazioni di NST e proteine residenti in Golgi funzionalmente correlate, quindi abbiamo deciso di testare il test di complementazione della luciferasi divisa. Ci ha permesso di identificare una nuova interazione tra un NST e un enzima glicosilazione funzionalmente ^correlato9.

La modifica più recente del test di complementazione della luciferasi divisa, NanoBiT, è utilizzata nel protocollo qui ^presentato15. Si basa sulla ricostituzione dell'enzima luciferasi (ad esempio, NanoLuc) dai due frammenti - quello grande, definito come grande BiT o LgBiT, una proteina 17,6 kDa, e quello piccolo, composto da soli 11 amminoacidi, definito come piccolo BiT o SmBiT. Le due proteine di interesse sono fuse con i frammenti complementari ed espresse transitoriamente in una linea cellulare umana. Se le due proteine di fusione interagiscono, una luminescenza viene prodotta in situ con l'aggiunta di un substrato permeabile alle cellule. Questi due frammenti sono stati ottimizzati in modo da associarsi a un'affinità minima a meno che non siano riuniti da un'interazione tra le proteine di interesse a cui sono fusi.

In generale, i metodi basati sulla bioluminescenza hanno alcuni vantaggi rispetto a quelli basati sulla fluorescenza. I segnali bioluminescenti hanno un rapporto segnale-rumore più elevato perché la luminescenza di fondo è trascurabile rispetto al segnale derivato dalla ^luciferasi16. Al contrario, gli approcci basati sulla fluorescenza di solito soffrono di uno sfondo relativamente alto causato dal fenomeno dell'autofluorescenza. Inoltre, la bioluminescenza è meno dannosa per le cellule analizzate rispetto alla fluorescenza, poiché nel primo caso non è necessario eccitare il campione. Per questi motivi gli approcci bioluminescenti allo studio degli IPP in vivo superano i metodi fluorescenti comunemente usati come Förster Resonance Energy Transfer (FRET) o Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Il nostro protocollo si basa sul riferimento della luminescenza ottenuta per la combinazione proteica di interesse alla luminescenza ottenuta per la combinazione di controllo. Quest'ultimo include una delle proteine testate che viene fusa con un frammento più grande e una proteina di controllo (ad esempio, HaloTag), fusa con un frammento più piccolo. Quest'ultima è una proteina di origine batterica che non dovrebbe interagire con nessuna delle proteine dei mammiferi. L'uso di questa proteina come controllo pone limitazioni alla topologia delle coppie di proteine residenti a Golgi da analizzare. Poiché nelle cellule di mammifero questa proteina è sintetizzata nel citoplasma, entrambe le proteine di interesse dovrebbero avere almeno una coda citoplasmatica.

Questo approccio può essere particolarmente utile per lo screening iniziale degli IPP. Può diventare il metodo di scelta quando le proteine di fusione di interesse sono espresse a livelli che sono semplicemente insufficienti per l'applicazione di altri approcci. Allo stesso modo, il test di complementazione della luciferasi divisa può essere l'opzione migliore se le proteine di interesse sono espresse ad alti livelli, ma ciò influisce negativamente sulla loro localizzazione subcellulare o è noto per forzare interazioni non specifiche. Poiché il frammento più piccolo ha solo 11 amminoacidi, il test di complementazione della luciferasi divisa può essere applicato quando l'uso di tag più grandi è impossibile. Infine, può essere utilizzato per confermare ulteriormente i dati ottenuti utilizzando altre tecniche, come nel caso qui presentato.

Protocollo

1. Generazione di plasmidi di espressione

1. Esaminare la topologia di membrana delle proteine di interesse utilizzando uno strumento di previsione della topologia.
2. Progettare la strategia di clonazione in modo che i frammenti più grandi e più piccoli affrontino il citoplasma una volta che le proteine di fusione sono state inserite nelle membrane di Golgi. Se, come nel caso qui presentato, sia N- che C-termini delle proteine di interesse sono orientati citoplasmaticamente, etichettare le proteine in otto modi possibili (vedi Figura 1B). Se N- o C-terminus di una o entrambe le proteine di interesse è orientato luminalmente, escluderlo dal tagging.
3. Subclonere i geni di interesse in vettori di espressione appropriati (vedi Tabella dei materiali) seguendo protocolli di clonazione standard.
   NOTA: si consiglia di testare tutti i possibili orientamenti, poiché alcune opzioni di tagging potrebbero non funzionare a causa di una vicinanza insufficiente, di un orientamento non ottimale o di vincoli spaziali.

2. Trasfezione transitoria dei plasmidi di espressione nelle cellule

1. Raccogliere la coltura cellulare HEK293T aderente mediante tripsinizzazione e risospese le cellule in un mezzo di crescita completo dedicato. Placcare le celle (2 x ¹⁰⁴/100 μL/pozzetto) su un fondo trasparente, piastra bianca laterale a 96 pozzetti. Regolare il numero totale di pozzetti per adattarsi a tutte le combinazioni e i controlli testati, comprese le repliche.
   NOTA: Tentare di utilizzare solo i 60 pozzetti interni della piastra per ridurre al minimo gli spostamenti termici ed evitare l'evaporazione notturna. L'utilizzo di piastre rivestite di poli-D-lisina è altamente raccomandato come quelle indicate nella Tabella dei Materiali, altrimenti le cellule potrebbero staccarsi durante le successive fasi di lavaggio.
2. Coltivare le cellule durante la notte in condizioni standard (37 °C, 5% _CO2).
3. Il giorno successivo trasfettate le cellule con le combinazioni desiderate di plasmidi di espressione ottenute al punto 1.1.
   1. Diluire i plasmidi di espressione in un mezzo privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a 6,25 ng/μL per ogni costrutto.
   2. Aggiungere il reagente di trasfezione a base lipidica con un rapporto lipidico-DNA appropriato e incubare secondo le istruzioni del produttore.
   3. Aggiungere 8 μL di miscela lipidico:DNA ai pozzetti designati. Mescolare il contenuto della piastra mediante rotazione delicata. Ciò si traduce nella trasfezione di entrambi i costrutti di espressione a 50 ng/pozzetto.
4. Coltivare le cellule per 20-24 ore in condizioni standard (37 °C, 5% _CO2).
   NOTA: La coltura delle cellule per un tempo più lungo può comportare livelli più elevati di espressione proteica di fusione, che può promuovere un'associazione non specifica tra i frammenti.

3. Scambio medio

1. Il giorno successivo sostituire il mezzo condizionato con 100 μL di un mezzo privo di siero in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le cellule non si siano staccate al momento dello scambio del mezzo.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito 2-3 ore prima dell'aggiunta della soluzione di lavoro furimazina. Il ritiro del siero riduce al minimo lo sfondo causato dall'autoluminescenza della furimazina.

4. Preparazione della soluzione di lavoro furimazina

1. Poco prima della misurazione, mescolare 1 volume di furimazina con 19 volumi di un tampone di diluizione (una diluizione di 20 volte).
   NOTA: Il volume totale della soluzione di lavoro furimazina da preparare dipende dal numero di singoli pozzetti da analizzare (la soluzione di lavoro furimazina viene aggiunta al terreno di coltura cellulare in un rapporto 1:5, quindi, a ciascun pozzetto precedentemente riempito con 100 μL di un mezzo privo di siero devono essere aggiunti 25 μL della soluzione di lavoro furimazina).
2. Aggiungere la soluzione di lavoro furimazina ai pozzetti designati (25 μL/pozzetto). Mescolare delicatamente la piastra a mano o utilizzando uno shaker orbitale (ad esempio, 15 s a 300-500 giri / min).

5. Misurazione della luminescenza

1. Inserire la piastra in un lettore di micropiastre a luminescenza.
   1. Per gli esperimenti che devono essere eseguiti a 37 °C, equilibrare la piastra per 10-15 minuti alla temperatura indicata.
2. Selezionare i pozzetti da analizzare.
3. Lettura luminescenza con tempo di integrazione di 0,3 s. Continuare a monitorare la luminescenza per un massimo di 2 ore quando necessario.

6. Analisi dei dati

1. Calcola i valori medi e le deviazioni standard per tutte le combinazioni testate e di controllo.
2. Analizza i dati utilizzando ANOVA unidirezionale con più confronti.
3. Calcola i valori di variazione di piega dividendo una luminescenza media ottenuta per le combinazioni di interesse per una luminescenza media ottenuta per i corrispondenti controlli negativi. Valutare i risultati.
   NOTA: L'approccio all'analisi dei dati qui proposto presuppone che l'interazione possa essere rivendicata se la luminescenza ottenuta per la combinazione testata è statisticamente significativamente superiore alla luminescenza ottenuta per la combinazione di controllo corrispondente e, allo stesso tempo, il rapporto di questi due valori supera 10.

Risultati

Per ottenere i dati più affidabili in questo approccio è necessario testare tutte le possibili combinazioni (vedere la Figura 1). Parallelamente, dovrebbero essere inclusi controlli positivi e negativi. Il controllo positivo dovrebbe consistere nelle due proteine che sono note per interagire, di cui una è fusa con il frammento più grande e l'altra è fusa con il frammento più piccolo. Il controllo negativo idealmente dovrebbe consistere nelle due proteine di membrana di tipo III non int...

Discussione

Qui forniamo un protocollo dettagliato che consente la dimostrazione di complessi eterologhi formati tra proteine di membrana di tipo III residenti a Golgi, come le NST, utilizzando il test di complementazione della luciferasi divisa. L'approccio proposto all'analisi e all'interpretazione dei dati prevede di mettere in relazione la luminescenza ottenuta per la combinazione proteica di interesse con la luminescenza ottenuta per la corrispondente combinazione di controllo, che è composta da una delle proteine di interesse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler