Démonstration de complexes hétérologues formés par des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi à l’aide d’un test de complémentation de la luciférase fractionnée

Résumé

Le protocole présenté ici vise à démontrer l’apparition d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et les N- et/ou C-termini exposées cytoplasmiquement dans des cellules de mammifères vivants en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée.

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’explorer l’applicabilité de la variante la plus récente de la complémentation de la luciférase divisée pour démontrer les complexes hétérologues formés par les transporteurs de sucre nucléotidique (NST). Ces protéines multitransmembranaires résidentes en ER et Golgi transportent les sucres nucléotidiques synthétisés cytoplasmiquement à travers les membranes des organites pour fournir des enzymes qui médient la glycosylation avec leurs substrats. Les NST existent sous forme de dimères et/ou d’oligomères supérieurs. Des interactions hétérologues entre différents NST ont également été rapportées. Pour vérifier si la technique est adaptée à l’étude du phénomène d’hétéromérisation NST, nous l’avons testée par rapport à une combinaison des deux NST résidents de Golgi dont il a été précédemment démontré qu’ils s’associent par plusieurs autres moyens. Le test de complémentation de la luciférase semble particulièrement adapté à l’étude des interactions entre les protéines membranaires résidentes de Golgi, car il ne nécessite pas de niveaux d’expression élevés, ce qui déclenche souvent une mauvaise localisation des protéines et augmente le risque de faux positifs.

Introduction

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour vérifier la présence d’interactions hétérologues entre les protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dans des cellules humaines transfectées transitoirement en utilisant la variante la plus récente du test de complémentation de la luciférase divisée. La procédure a été le plus largement testée contre les transporteurs de sucre nucléotidique (NST), mais nous avons également pu obtenir des résultats positifs pour d’autres protéines membranaires de type III résidentes de Golgi dont les N- et / ou C-termini font face au cytoplasme.

Notre groupe de recherche explore le rôle des NST dans la glycosylation des macromolécules. Les NST sont des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi et/ou d’ER avec N- et C-termini faisant face au côté cytoplasmique de la membrane ^{organellaire1}. On pense que les NST transportent les sucres activés par les nucléotides à travers les membranes des organites pour fournir aux glycosyltransférases leurs substrats. Les NST forment des dimères et/ou des oligomères supérieurs2,3,4,5,6,7,8,9,10. De plus, des interactions hétérologues entre différents NST ont également été ^{rapportées6,11}. Il a également été démontré que les NST forment des complexes avec des enzymes de glycosylation fonctionnellement liées12,13,14. Nous avons cherché une alternative à la technique actuellement utilisée, l’approche FRET basée sur l’imagerie par fluorescence de la durée de vie (FLIM), pour étudier les interactions des NST et des protéines résidentes de Golgi fonctionnellement apparentées, nous avons donc décidé de tester le test de complémentation de la luciférase fractionnée. Il nous a permis d’identifier une nouvelle interaction entre un NST et une enzyme de glycosylation fonctionnellement ^liée9.

La modification la plus récente du test de complémentation de la luciférase fractionnée, NanoBiT, est utilisée dans le protocole présenté ^ici15. Il repose sur la reconstitution de l’enzyme luciférase (par exemple, NanoLuc) à partir des deux fragments - le grand, appelé grand BiT ou LgBiT, une protéine de 17,6 kDa, et le petit, composé de seulement 11 acides aminés, appelé petit BiT ou SmBiT. Les deux protéines d’intérêt sont fusionnées avec les fragments complémentaires et exprimées transitoirement dans une lignée cellulaire humaine. Si les deux protéines de fusion interagissent, une luminescence est produite in situ lors de l’ajout d’un substrat perméable aux cellules. Ces deux fragments ont été optimisés de manière à ce qu’ils s’associent avec une affinité minimale à moins d’être rapprochés par une interaction entre les protéines d’intérêt auxquelles ils sont fusionnés.

En général, les méthodes basées sur la bioluminescence présentent certains avantages par rapport à celles basées sur la fluorescence. Les signaux bioluminescents ont un rapport signal/bruit plus élevé car la luminescence de fond est négligeable par rapport au signal dérivé de la luciférase16. En revanche, les approches basées sur la fluorescence souffrent généralement d’un fond relativement élevé causé par le phénomène d’autofluorescence. En outre, la bioluminescence est moins préjudiciable aux cellules analysées que la fluorescence, car dans le premier cas, il n’est pas nécessaire d’exciter l’échantillon. Pour ces raisons, les approches bioluminescentes pour étudier les IPP in vivo surpassent les méthodes fluorescentes couramment utilisées comme le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) ou la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC).

Notre protocole repose sur la luminescence de référence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin. Ce dernier comprend l’une des protéines testées qui est fusionnée avec un fragment plus grand et une protéine de contrôle (par exemple, HaloTag), fusionnée avec un fragment plus petit. Cette dernière est une protéine d’origine bactérienne qui ne devrait interagir avec aucune des protéines de mammifères. L’utilisation de cette protéine comme témoin pose des limites à la topologie des paires de protéines résidentes de Golgi à analyser. Étant donné que dans les cellules de mammifères, cette protéine est synthétisée dans le cytoplasme, les deux protéines d’intérêt doivent avoir au moins une queue cytoplasmique.

Cette approche peut être particulièrement utile pour le dépistage initial des IPP. Elle peut devenir la méthode de choix lorsque les protéines de fusion d’intérêt sont exprimées à des niveaux tout simplement insuffisants pour que d’autres approches puissent être appliquées. De même, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être la meilleure option si les protéines d’intérêt sont exprimées à des niveaux élevés, mais cela affecte négativement leur localisation subcellulaire ou est connu pour forcer des interactions non spécifiques. Étant donné que le plus petit fragment ne contient que 11 acides aminés, le test de complémentation de la luciférase fractionnée peut être appliqué lorsque l’utilisation de marqueurs plus grands est impossible. Enfin, il peut être utilisé pour confirmer davantage les données obtenues à l’aide d’autres techniques, comme dans le cas présenté ici.

Protocole

1. Génération de plasmides d’expression

1. Examiner la topologie membranaire des protéines d’intérêt à l’aide d’un outil de prédiction de topologie.
2. Concevoir la stratégie de clonage de manière à ce que les fragments les plus grands et les plus petits fassent face au cytoplasme une fois que les protéines de fusion ont été insérées dans les membranes de Golgi. Si, comme dans le cas présenté ici, les N- et C-termini des protéines d’intérêt sont orientées cytoplasmiquement, marquez les protéines de huit manières possibles (voir Figure 1B). Si N- ou C-terminus d’une ou des deux protéines d’intérêt est luminally orienté, excluez-le du marquage.
3. Subcinez les gènes d’intérêt en vecteurs d’expression appropriés (voir Tableau des matériaux) en suivant des protocoles de clonage standard.
   Remarque : Il est recommandé de tester toutes les orientations possibles, car certaines options de balisage peuvent ne pas fonctionner en raison d’une proximité insuffisante, d’une orientation sous-optimale ou de contraintes spatiales.

2. Transfection transitoire des plasmides d’expression dans les cellules

1. Récoltez la culture cellulaire adhérente HEK293T par trypsinisation et ressuspendez les cellules dans un milieu de croissance complet dédié. Plaquez les cellules (2 x ¹⁰⁴/100 μL/puits) sur une plaque de 96 puits à fond clair, côté blanc. Ajuster le nombre total de puits pour tenir compte de toutes les combinaisons et de tous les contrôles testés, y compris les répétitions.
   REMARQUE: Essayez d’utiliser uniquement les 60 puits intérieurs de la plaque pour minimiser les changements thermiques et éviter l’évaporation pendant la nuit. L’utilisation de plaques revêtues de poly-D-lysine est fortement recommandée, telles que celles indiquées dans le tableau des matériaux, sinon les cellules peuvent se détacher lors des étapes de lavage suivantes.
2. Cultiver les cellules pendant la nuit dans des conditions normales (37 °C, 5 % de _CO2).
3. Le lendemain, transfecter les cellules avec les combinaisons souhaitées de plasmides d’expression obtenus au point 1.1.
   1. Diluer les plasmides d’expression dans un milieu sans sérum (voir tableau des matériaux) à 6,25 ng/μL pour chaque construction.
   2. Ajouter le réactif de transfection à base de lipides à un rapport lipide/ADN approprié et incuber selon les instructions du fabricant.
   3. Ajouter 8 μL de mélange lipide/ADN aux puits désignés. Mélanger le contenu de la plaque par rotation douce. Il en résulte une transfection des deux constructions d’expression à 50 ng/puits.
4. Cultiver les cellules pendant 20-24 h dans des conditions standard (37 °C, 5% de _CO2).
   REMARQUE: La culture des cellules pendant une période plus longue peut entraîner des niveaux plus élevés d’expression de la protéine de fusion, ce qui peut favoriser une association non spécifique entre les fragments.

3. Échange moyen

1. Le lendemain, remplacez le milieu conditionné par 100 μL d’un milieu sans sérum dans chaque puits. Assurez-vous que les cellules ne se sont pas détachées lors d’un échange moyen.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée 2-3 h avant l’ajout de la solution de travail furimazine. Le sevrage sérique minimise le fond causé par l’autoluminescence de la furimazine.

4. Préparation de la solution de travail furimazine

1. Juste avant la mesure, mélanger 1 volume de furimazine avec 19 volumes d’un tampon de dilution (une dilution de 20 fois).
   REMARQUE: Le volume total de la solution de travail de furimazine à préparer dépend du nombre de puits individuels à analyser (la solution de travail de la furimazine est ajoutée au milieu de culture cellulaire dans un rapport de 1:5, par conséquent, à chaque puits préalablement rempli de 100 μL d’un milieu sans sérum, 25 μL de la solution de travail de furimazine doivent être ajoutés).
2. Ajouter la solution de travail de furimazine aux puits désignés (25 μL/puits). Mélangez doucement la plaque à la main ou à l’aide d’un agitateur orbital (par exemple, 15 s à 300-500 tr/min).

5. Mesure de la luminescence

1. Insérez la plaque dans un lecteur de microplaques de luminescence.
   1. Pour les expériences à réaliser à 37 °C, équilibrez la plaque pendant 10 à 15 min à la température indiquée.
2. Sélectionnez les puits à analyser.
3. Luminescence de lecture avec un temps d’intégration de 0,3 s. Continuez à surveiller la luminescence jusqu’à 2 h au besoin.

6. Analyse des données

1. Calculer les valeurs moyennes et les écarts-types pour toutes les combinaisons testées et de contrôle.
2. Analysez les données à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle avec plusieurs comparaisons.
3. Calculer les valeurs de changement de pli en divisant une luminescence moyenne obtenue pour les combinaisons d’intérêts par une luminescence moyenne obtenue pour les commandes négatives correspondantes. Évaluez les résultats.
   NOTE: L’approche de l’analyse des données proposée ici suppose que l’interaction peut être revendiquée si la luminescence obtenue pour la combinaison testée est statistiquement significativement supérieure à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante et, en même temps, le rapport de ces deux valeurs dépasse 10.

Résultats

Pour obtenir les données les plus fiables dans cette approche, toutes les combinaisons possibles doivent être testées (voir figure 1). En parallèle, des contrôles positifs et négatifs devraient être inclus. Le témoin positif doit être constitué des deux protéines connues pour interagir, dont l’une est fusionnée avec le plus grand fragment et l’autre est fusionnée avec le plus petit fragment. Le témoin négatif devrait idéalement être constitué des deux protéines membran...

Discussion

Nous fournissons ici un protocole détaillé permettant la démonstration de complexes hétérologues formés entre des protéines membranaires de type III résidentes de Golgi, telles que les NST, en utilisant le test de complémentation de la luciférase divisée. L’approche proposée pour l’analyse et l’interprétation des données consiste à relier la luminescence obtenue pour la combinaison de protéines d’intérêt à la luminescence obtenue pour la combinaison témoin correspondante, qui est composée de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler