Nachweis heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, mittels Split-Luciferase-Komplementierungsassay

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll soll das Auftreten heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen mit zytoplasmatisch exponierten N- und/oder C-Termini in lebenden Säugetierzellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays demonstrieren.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Anwendbarkeit der neuesten Variante der gespaltenen Luciferase-Komplementierung für den Nachweis heterologer Komplexe, die von Nukleotid-Zuckertransportern (NSTs) gebildet werden, zu untersuchen. Diese ER- und Golgi-residenten Multitransmembranproteine transportieren die zytoplasmatisch synthetisierten Nukleotidzucker über Organellenmembranen, um Enzyme zu liefern, die die Glykosylierung mit ihren Substraten vermitteln. NSTs existieren als Dimere und/oder höhere Oligomere. Heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs wurden ebenfalls berichtet. Um zu überprüfen, ob die Technik für die Untersuchung des Phänomens der NST-Heteromerisierung geeignet ist, haben wir sie gegen eine Kombination der beiden Golgi-ansässigen NSTs getestet, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie sich auf verschiedene andere Weise assoziieren. Der Luciferase-Komplementierungsassay scheint besonders geeignet zu sein, um Wechselwirkungen zwischen Golgi-residenten Membranproteinen zu untersuchen, da er keine hohen Expressionsniveaus erfordert, die oft eine Proteinfehllokalisation auslösen und das Risiko von falsch positiven Ergebnissen erhöhen.

Einleitung

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Überprüfung auf das Vorhandensein heterologer Interaktionen zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen in transient transfizierten menschlichen Zellen unter Verwendung der neuesten Variante des Split-Lucifererase-Komplementierungsassays. Das Verfahren wurde am umfangreichsten gegen Nukleotid-Zuckertransporter (NSTs) getestet, aber wir konnten auch positive Ergebnisse für andere Golgi-residente Typ-III-Membranproteine erzielen, deren N- und/oder C-Termini dem Zytoplasma zugewandt sind.

Unsere Forschungsgruppe untersucht die Rolle von NSTs bei der Glykosylierung von Makromolekülen. NSTs sind Golgi- und/oder ER-residente Typ-III-Membranproteine mit N- und C-Termini, die der zytoplasmatischen Seite der Organellamembran zugewandt ^sind1. Es wird angenommen, dass NSTs nukleotidaktivierte Zucker über Organellenmembranen transportieren, um Glykosyltransferasen mit ihren Substraten zu versorgen. NSTs bilden Dimere und/oder höhere Oligomere2,3,4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus wurden auch heterologe Wechselwirkungen zwischen verschiedenen NSTs ^{berichtet6,11}. Es wurde auch gezeigt, dass NSTs Komplexe mit funktionell verwandten Glykosylierungsenzymen bilden12,13,14. Wir suchten nach einer Alternative zur derzeit verwendeten Technik, dem FLIM-basierten FRET-Ansatz (Fluorescence Lifetime Imaging), um die Wechselwirkungen von NSTs und funktionell verwandten Golgi-residenten Proteinen zu untersuchen, also beschlossen wir, den Split-Luciferase-Komplementierungsassay zu testen. Es ermöglichte uns, eine neuartige Wechselwirkung zwischen einem NST und einem funktionell verwandten Glykosylierungsenzym zu ^{identifizieren9}.

Die jüngste Modifikation des Split-Luciferase-Komplementierungsassays NanoBiT wird in dem hier ^{vorgestellten Protokoll verwendet15}. Es beruht auf der Rekonstitution des Luciferase-Enzyms (z. B. NanoLuc) aus den beiden Fragmenten - dem großen, das als großes BiT oder LgBiT bezeichnet wird, einem 17,6-kDa-Protein, und dem kleinen, das aus nur 11 Aminosäuren besteht, das als kleines BiT oder SmBiT bezeichnet wird. Die beiden interessierenden Proteine werden mit den komplementären Fragmenten verschmolzen und vorübergehend in einer menschlichen Zelllinie exprimiert. Wenn die beiden Fusionsproteine interagieren, entsteht in situ durch Zugabe eines zelldurchlässigen Substrats eine Lumineszenz. Diese beiden Fragmente wurden so optimiert, dass sie sich mit minimaler Affinität assoziieren, es sei denn, sie werden durch eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse, mit denen sie verschmolzen sind, zusammengebracht.

Im Allgemeinen haben biolumineszenzbasierte Methoden einige Vorteile gegenüber denen, die auf Fluoreszenz basieren. Biolumineszenzsignale haben ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, da die Hintergrundlumineszenz im Vergleich zum Luciferase-abgeleiteten ^Signal16 vernachlässigbar ist. Im Gegensatz dazu leiden fluoreszenzbasierte Ansätze in der Regel unter einem relativ hohen Hintergrund, der durch das Phänomen der Autofluoreszenz verursacht wird. Außerdem ist die Biolumineszenz für die analysierten Zellen weniger schädlich als die Fluoreszenz, da im ersten Fall keine Notwendigkeit besteht, die Probe anzuregen. Aus diesen Gründen übertreffen biolumineszierende Ansätze zur Untersuchung von PPIs in vivo die häufig verwendeten fluoreszierenden Methoden wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) oder Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Unser Protokoll beruht auf der Bezugnahme der Lumineszenz, die für die Proteinkombination von Interesse ist, auf die Lumineszenz, die für die Kontrollkombination erhalten wird. Letzteres umfasst eines der getesteten Proteine, das mit einem größeren Fragment verschmolzen ist, und ein Kontrollprotein (z. B. HaloTag), das mit einem kleineren Fragment verschmolzen ist. Letzteres ist ein Protein bakteriellen Ursprungs, von dem nicht erwartet wird, dass es mit einem der Säugetierproteine interagiert. Die Verwendung dieses Proteins als Kontrolle schränkt die Topologie der zu analysierenden Golgi-residenten Proteinpaare ein. Da dieses Protein in Säugetierzellen im Zytoplasma synthetisiert wird, sollten beide interessierenden Proteine mindestens einen zytoplasmatischen Schwanz haben.

Dieser Ansatz kann besonders nützlich für das anfängliche Screening von PPIs sein. Es kann die Methode der Wahl werden, wenn die interessierenden Fusionsproteine in Konzentrationen ausgedrückt werden, die für die Anwendung anderer Ansätze einfach nicht ausreichen. In ähnlicher Weise kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay die beste Option sein, wenn die interessierenden Proteine in hohen Konzentrationen exprimiert werden, was sich jedoch nachteilig auf ihre subzelluläre Lokalisation auswirkt oder dafür bekannt ist, unspezifische Wechselwirkungen zu erzwingen. Da das kleinere Fragment nur 11 Aminosäuren enthält, kann der Split-Luciferase-Komplementierungsassay angewendet werden, wenn die Verwendung größerer Tags unmöglich ist. Schließlich kann es verwendet werden, um Daten, die mit anderen Techniken erhalten wurden, wie in dem hier vorgestellten Fall, weiter zu bestätigen.

Protokoll

1. Erzeugung von Expressionsplasmiden

1. Untersuchen Sie die Membrantopologie der interessierenden Proteine mit einem Topologievorhersagewerkzeug.
2. Entwerfen Sie die Klonierungsstrategie so, dass die größeren und kleineren Fragmente dem Zytoplasma gegenüberstehen, sobald die Fusionsproteine in die Golgi-Membranen eingefügt wurden. Wenn, wie im hier dargestellten Fall, sowohl N- als auch C-Termini der interessierenden Proteine zytoplasmatisch orientiert sind, markieren Sie die Proteine auf acht mögliche Arten (siehe Abbildung 1B). Wenn der N- oder C-Terminus eines oder beider Proteine von Interesse luminal orientiert ist, schließen Sie ihn vom Tagging aus.
3. Subklonen Sie die interessierenden Gene in geeignete Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle), indem Sie die Standard-Klonierungsprotokolle befolgen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, alle möglichen Ausrichtungen zu testen, da einige Tagging-Optionen aufgrund unzureichender Nähe, suboptimaler Ausrichtung oder räumlicher Einschränkungen möglicherweise nicht funktionieren.

2. Transiente Transfektion der Expressionsplasmide in die Zellen

1. Ernten Sie die adhärente HEK293T-Zellkultur durch Trypsinisierung und resuspendieren Sie die Zellen in einem speziellen vollständigen Wachstumsmedium. Platten Sie die Zellen (2 x ¹⁰⁴/100 μL/Well) auf eine klare untere, weiße 96-Well-Platte. Passen Sie die Gesamtzahl der Bohrlöcher an, um alle getesteten Kombinationen und Kontrollen einschließlich Replikationen aufzunehmen.
   HINWEIS: Versuchen Sie, nur die inneren 60 Vertiefungen der Platte zu verwenden, um thermische Verschiebungen zu minimieren und eine Verdunstung über Nacht zu vermeiden. Die Verwendung von Poly-D-Lysin-beschichteten Platten, wie sie in der Materialtabelle angegeben sind, wird dringend empfohlen, da sich sonst Zellen während der nachfolgenden Waschschritte ablösen können.
2. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht unter Standardbedingungen (37 °C, 5% _CO2).
3. Am nächsten Tag werden die Zellen mit den gewünschten Kombinationen von Expressionsplasmiden transfiziert, die in Nummer 1.1 erhalten wurden.
   1. Verdünnte Expressionsplasmide in einem serumfreien Medium (siehe Materialtabelle) auf 6,25 ng/μL für jedes Konstrukt.
   2. Fügen Sie das lipidbasierte Transfektionsreagenz in einem geeigneten Lipid-zu-DNA-Verhältnis hinzu und inkubieren Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. 8 μL Lipid:DNA-Gemisch in die dafür vorgesehenen Vertiefungen geben. Mischen Sie den Inhalt der Platte durch sanfte Rotation. Dies führt zu einer Transfektion beider Ausdruckskonstrukte bei 50 ng/well.
4. Kultivieren Sie die Zellen für 20-24 h unter Standardbedingungen (37 °C, 5% _CO2).
   HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen über einen längeren Zeitraum kann zu einer höheren Expression von Fusionsproteinen führen, was eine unspezifische Assoziation zwischen den Fragmenten fördern kann.

3. Mittlerer Austausch

1. Ersetzen Sie am nächsten Tag das konditionierte Medium durch 100 μL eines serumfreien Mediums in jedem Bohrloch. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen beim Mediumsaustausch nicht gelöst haben.
   HINWEIS: Dieser Schritt sollte 2-3 Stunden vor der Zugabe der Furimazin-Arbeitslösung durchgeführt werden. Der Serumentzug minimiert den Hintergrund, der durch die Autolumineszenz von Furimazin verursacht wird.

4. Vorbereitung der Furimazin-Arbeitslösung

1. Mischen Sie kurz vor der Messung 1 Volumen Furimazin mit 19 Volumina eines Verdünnungspuffers (eine 20-fache Verdünnung).
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen der herzustellenden Furimazin-Arbeitslösung hängt von der Anzahl der einzelnen zu analysierenden Vertiefungen ab (die Furimazin-Arbeitslösung wird dem Zellkulturmedium im Verhältnis 1:5 zugesetzt, daher sollte jedem zuvor mit 100 μL gefüllten Bohrloch eines serumfreien Mediums 25 μL der Furimazin-Arbeitslösung zugegeben werden).
2. Fügen Sie die Furimazin-Arbeitslösung zu den vorgesehenen Vertiefungen hinzu (25 μL/Well). Mischen Sie die Platte vorsichtig von Hand oder mit einem Orbitalschüttler (z. B. 15 s bei 300-500 U / min).

5. Messung der Lumineszenz

1. Setzen Sie die Platte in einen Lumineszenz-Mikroplattenleser ein.
   1. Für Experimente, die bei 37 °C durchgeführt werden sollen, gleicht die Platte für 10-15 min bei der angegebenen Temperatur aus.
2. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus.
3. Leselumineszenz mit einer Integrationszeit von 0,3 s. Überwachen Sie bei Bedarf bis zu 2 Stunden lang die Lumineszenz.

6. Datenanalyse

1. Berechnen Sie Mittelwerte und Standardabweichungen für alle geprüften und Regelkombinationen.
2. Analysieren Sie Daten mit unidirektionaler ANOVA mit mehreren Vergleichen.
3. Berechnen Sie Faltungsänderungswerte, indem Sie eine mittlere Lumineszenz, die für Kombinationen von Interesse erhalten wird, durch eine mittlere Lumineszenz dividieren, die für die entsprechenden Negativkontrollen erhalten wird. Bewerten Sie die Ergebnisse.
   ANMERKUNG: Der hier vorgeschlagene Ansatz zur Datenanalyse geht davon aus, dass die Wechselwirkung beansprucht werden kann, wenn die für die getestete Kombination erhaltene Lumineszenz statistisch signifikant höher ist als die für die entsprechende Kontrollkombination erhaltene Lumineszenz und gleichzeitig das Verhältnis dieser beiden Werte 10 übersteigt.

Ergebnisse

Um die zuverlässigsten Daten in diesem Ansatz zu erhalten, sollten alle möglichen Kombinationen getestet werden (siehe Abbildung 1). Parallel dazu sollten Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden. Die Positivkontrolle sollte aus den beiden Proteinen bestehen, von denen bekannt ist, dass sie interagieren, von denen eines mit dem größeren Fragment und das andere mit dem kleineren Fragment verschmolzen ist. Die Negativkontrolle sollte idealerweise aus den beiden nicht interagierende...

Diskussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das den Nachweis heterologer Komplexe ermöglicht, die zwischen Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen wie NSTs gebildet werden, indem wir den Split-Luciferase-Komplementierungsassay verwenden. Der vorgeschlagene Ansatz zur Datenanalyse und -interpretation besteht darin, die für die interessierende Proteinkombination erhaltene Lumineszenz mit der für die entsprechende Kontrollkombination erhaltenen Lumineszenz in Beziehung zu setzen, die aus einem der inte...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler