הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Summary

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

Abstract

לדבורי הדבש יש חשיבות אקולוגית וחקלאית רבה ברחבי העולם, אך הן גם נתונות למגוון לחצים המשפיעים לרעה על בריאות הדבורים, כולל חשיפה לפתוגנים נגיפיים. וירוסים כאלה יכולים לגרום למגוון רחב של השפעות הרסניות ולעתים קרובות יכולים להיות מאתגרים למחקר בשל גורמים רבים המקשים על הפרדת ההשפעות של טיפולים ניסיוניים מזיהום רקע קיים מראש. כאן אנו מציגים שיטה לייצור המוני של כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים יחד עם בדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. כתוצאה מהיעדר הנוכחי של קו תאי דבורת דבש רציפים ונטולי וירוסים, חלקיקים נגיפיים מוגברים in vivo באמצעות גולמי דבורת דבש, המופקים מהכוורת בכמויות גדולות באמצעות מתודולוגיה מלחיצה מינימלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלקיקי הנגיף האלה בבדיקות ביולוגיות של כלובי דבורי דבש כדי לבחון את כדאיות האינוקולה, כמו גם בדינמיקות שונות אחרות של זיהום בנגיף, כולל אינטראקציות עם תזונה, חומרי הדברה ופתוגנים אחרים. יתרון מרכזי של שימוש בחלקיקים כאלה הוא שהוא מקטין מאוד את הסיכויים להחדרת משתנים לא ידועים בניסויים הבאים בהשוואה לחלופות הנוכחיות, כגון זיהום באמצעות המולימפה של דבורים נגועות או הומוגנט, אם כי עדיין יש לנקוט משנה זהירות בעת מיקור הדבורים, כדי למזער את זיהום נגיף הרקע. מבחני הכלובים אינם תחליף לניסויים רחבי היקף ומציאותיים בשטח הבודקים את השפעות ההדבקה בנגיף ברמת המושבה, אלא מתפקדים כשיטה ליצירת תגובות נגיפיות בסיסיות, שבשילוב עם חלקיקי הנגיף הטהורים למחצה, יכולות לשמש ככלים חשובים לבחינת ממדים שונים של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

Introduction

דבורי הדבש (Apis mellifera) ממלאות תפקיד קריטי בנוף החקלאי העולמי המודרני, אך כיום הן סובלות משילוב של גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים, כולל חשיפה לחומרי הדברה, מספוא לקוי, טפילים ופתוגנים ^1,2. אחד הפתוגנים החשובים ביותר לדאגה הם וירוסים, שרבים מהם מווסתים על ידי עוד אחד מגורמי העקה העיקריים של דבורת הדבש, קרדית Varroa הטפילית (Varroa destructor). נגיפים אלה יכולים לגרום למגוון של השפעות שליליות בדבורי הדבש, כולל ירידה בהישרדות גזעית, פגמים התפתחותיים ושיתוק שיכולים להוביל לקריסת כוורת מוחלטת הן לפני תקופות החורף והן לאחריהן ^3,4,5. למרות שחלה התקדמות מבטיחה בפיתוח טכנולוגיות המשמשות למאבק בהדבקה בנגיף ^6,7,8,9, הדינמיקה שבה וירוסים רבים מתפשטים, מתפשטים ומתקשרים בתוך דבורת דבש או מושבה עדיין לא מובנת היטב ^5,10 . הבנת הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין דבורי דבש ונגיפים והקשרים שלהן עם גורמים סביבתיים אחרים היא קריטית לפיתוח טכניקות יעילות לניהול וירוסים.

עם זאת, חקר האינטראקציות בין דבורי הדבש לנגיף מציב אתגרים עם גורמים ידועים ובלתי ידועים רבים המסבכים את התהליך. אלה כוללים אינטראקציות עם תזונה^11,12, חשיפה לחומרי הדברה¹³ ורקע גנטי לדבורים^14,15. גם כאשר מתמקדים בהדבקה בנגיף בלבד, סיבוכים נפוצים משום שלאוכלוסיות דבורי הדבש, המנוהלות והפראיות כאחד, יש תמיד מידה מסוימת של זיהום בנגיף הרקע, אם כי לעתים קרובות מבלי לבטא תסמינים חריפים ^16,17, וההשפעות של הדבקה בנגיף אינן מובנות היטב¹⁸. זה הפך את המחקר של השפעות וירוס דבורת הדבש קשה להתנתק.

מחקרים רבים על נגיף דבורי הדבש השתמשו בזיהומים נסיבתיים של הנגיף כדי לחפש אינטראקציות עם גורמי עקה אחרים, וראו כיצד זיהומי הרקע משתנים עם טיפולים אחרים 12,19,20,21. בעוד שגישה זו הצליחה לזהות השפעות חשובות, במיוחד לגלות כיצד חומרי הדברה או טיפולים תזונתיים משפיעים על רמות הנגיף ועל שכפולם, חיסון באמצעות טיפול בנגיף של תוכן וריכוז ידועים הוא קריטי לבדיקה ניסיונית של דינמיקת זיהום בנגיף. עם זאת, הפרדת הטיפול הניסיוני מזיהום הרקע עלולה גם היא להציב אתגרים. במחקרי שדה, חוקרים הבחינו בין זנים של נגיף כנף מעוות (DWV) כדי לספק ראיות להעברת הנגיף מדבורי דבש לדבורי בומבוס²², אך שימוש בגישה זו יהיה קשה בקרב דבורי הדבש בלבד. שיבוטים זיהומיים של וירוסים הם כלי רב עוצמה, לא רק למעקב אחר זיהום 23,24,25 אלא למחקרי גנטיקה הפוכה של נגיפי דבורי דבש ולמחקר אינטראקציה בין וירוסים למארח 26,27,28. עם זאת, ברוב המקרים, שיבוטים זיהומיים עדיין נדרשים כדי למלא את מחזור ההדבקה בתוך התאים כדי לייצר חלקיקים. חלקיקים כאלה מועדפים כאנוקולה לטיפולים ניסיוניים מכיוון שהזיהום שלהם גבוה יותר מהרנ"א הנגיפי העירום והחיסון בגנומים עטוף מחקה זיהום טבעי.

גם הייצור של אינוקולה של נגיף דבורת הדבש הטהור והלא מזוהם (זני וירוסים מסוג בר או כאלה שמקורם בשיבוטים זיהומיים) מציב אתגרים. אלה נובעים בעיקר מהקשיים בהשגת קו אמין, המשכפל ברציפות, של תאי דבורת דבש נטולי וירוסים, כדי לייצר נגיפים בעלי זן טהור^29,30. בעוד שכמה קווי תאים יוצרו, מערכות אלה נותרו לא מושלמות; ובכל זאת, יש תקווה שניתן יהיה לייצר קו תאים בר קיימא²⁹, שיאפשר שליטה עדינה יותר על ייצור וירוסים וחקירה. עד שקו כזה יהיה זמין באופן נרחב, רוב פרוטוקולי ייצור הנגיף ימשיכו להסתמך על שימוש בייצור וטיהור של וירוסים in vivo 18,31,32,33,34. גישות אלה כוללות זיהוי וטיהור של חלקיקי נגיף בעלי עניין (או ייצור שיבוט מדבק) ושימוש בהם כדי להדביק דבורי דבש, בדרך כלל כגלמים. הגלמים מוזרקים עם נגיף המטרה ולאחר מכן מוקרבים, וחלקיקים נוספים מופקים ומטוהרים. עם זאת, מכיוון שדבורים אינן נקיות מווירוסים מלכתחילה, תמיד יש מידה מסוימת של זיהום מעקבות של וירוסים אחרים בכל תרכיז כזה, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בבחירת דבורים עם סבירות נמוכה לזיהומי רקע. יתר על כן, שיטות להסרת הגלמים מתאי המסרק לשימוש בפרוטוקולים אלה³³ הן עתירות עבודה מאוד ויכולות לגרום ללחץ אצל הדבורים, ולהגביל את הייצור באמצעים אלה^18,32. כאן אנו מדווחים על שיטה חלופית המאפשרת הסרה בקנה מידה גדול של זחלים עם מעט עבודה ופחות לחץ מכני על הדבורים.

לאחר שהגלמים מתקבלים ומוזרקים להם אינוקולום הנגיף ההתחלתי, יש לדוגר אותם כדי לספק לנגיף זמן להשתכפל. לאחר מכן, ניתן לעבד חלקיקי נגיף המיוצרים לצורה שמישה כדי להדביק דבורים ניסיוניות. ישנן מספר שיטות פשוטות להשיג זאת, כולל שימוש בהומוגנט גולמי^35,36 או המולימפה שנוצר מדבורים נגועות בנגיף כמקור לזיהום³⁷. שיטות אלה יעילות, אך יש להן סיכוי גדול יותר להכניס משתנים לא ידועים ממצע הרקע (למשל, גורמים אחרים בהומוגנטים של הדבורים המתות). בנוסף, רצוי לרכז את החלקיקים אם ניסוי דורש מתן מינון גדול וידוע של וירוס בפרק זמן קצר. לכן, לשליטה טובה יותר, עדיף להשתמש בשיטות המאפשרות רמה מסוימת של טיהור וריכוז של חלקיקי הנגיף. באופן כללי, סדרה של צעדי משקעים וצנטריפוגה תביא להסרת כמעט כל החומר האפשרי שאינו קשור לנגיף³³.

לאחר הפקת אינוקולום מרוכז זה, כדאי לכמת את הטיטרים הנגיפיים (qPCR) ולאפיין אותו עם bioassays in vivo כדי לבחון את הכדאיות שלו ואת יכולתו לגרום לתמותה, כמו גם כדי לאשש כי titers וירוס מוגבר מתקבלים לאחר ההדבקה. ניתן להשיג זאת באמצעות ניסויי הזרקה (לתוך גלמים או מבוגרים) או ניסויי האכלה (לזחלים או למבוגרים). בעוד שכל הגישות הללו אפשריות, האכלה לקבוצות של דבורים בוגרות בכלוב היא לעתים קרובות המהירה והפשוטה ביותר. שיטת בדיקת הכלובים נמצאת בשימוש נרחב גם לבדיקת טיפולים שונים אחרים בדבורים, כולל רעילות חומרי הדברה³⁸, התפתחות שחלה³⁹ והשפעה תזונתית על התנהגות^40,41, ולכן יכולה להוות בסיס טוב לניסויים הקושרים בין זיהום בנגיף לגורמים אחרים⁴².

כאן אנו מתארים שיטה אמינה לייצור כמויות גדולות של חלקיקי נגיף טהורים למחצה, מועשרים מאוד, ללא שימוש ב-ultracentrifuge יקר, כולל שיטה להסרת גלמים המפחיתה את הלחץ הנגרם והלחץ המכני על הדבורים ובדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. על ידי שליטה הדוקה בטוהר האינוקולה הנגיפית, החוקרים מסוגלים להפחית את השונות בתגובה הנגיפית של דבורת הדבש ביחס לשיטות חיסון ויראליות אחרות. יתר על כן, הבדיקה הביולוגית יכולה לסנן השפעות ויראליות ברמת קבוצות קטנות באמצעות יחידות ניסיוניות הניתנות לחזרה רבה לפני שינוי קנה המידה להגדרות מציאותיות בשטח, וזה הרבה יותר עבודה אינטנסיבית לניהול. בשילוב, שתי השיטות הללו מספקות את הכלים הדרושים למחקרים שיכולים לעזור לשפר את ההבנה הכוללת שלנו של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

Protocol

1. אפשרות מיצוי דבורים המונית 1: הסרה עצמית של הזחל

1. כלבו מלכת דבורי דבש על מסגרת לנגסטרות' ריקה ומצוירת והחזירו אותה למושבה שלה. אפשרו למלכה להטיל ביצים על מסגרת זו במשך 24 שעות.
   1. בדקו את המסגרת לאחר 24 שעות כדי לוודא שרוב תאי המסרק מכילים ביצים שהוטלו לאחרונה. בהתאם למלכה ולמושבה, ביצים לפעמים אינן מוטלות היטב ב -24 השעות הראשונות. אם זה קורה, לאפשר 24 שעות נוספות ולהתאים את הזמן לפי הצורך.
2. לאחר תקופת הטלת הביצים בת 24 השעות, שחררו את המלכה. סמן את המסגרת בבירור והחזיר אותה למושבה.
3. בדיוק 192 שעות (8 ימים) לאחר כליאה של המלכה (בהנחה של הטלת ביצים רגילה בתוך 24 השעות הראשונות; 8 ימים מסמנים את הנקודה ממש לפני הגור), הסירו את המסגרת המסומנת מהמושבה. הברישו את כל הדבורים הבוגרות והעבירו את המסגרת לחממה התואמת את התנאים הפנימיים של כוורת (34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות יחסית (RH)).
   1. בדקו כדי לוודא שרוב המסגרת^{מלאה בזחלי} אינסטאר 5, אותם ניתן לזהות על ידי גופם הגדול, הלבן, בצורת c, שנלחץ בחוזקה על הקצוות התחתונים של תאי המסרק. סביר להניח שיהיו גם כמה תאים שכבר מכוסים על ידי מכסה שעווה, במיוחד ליד מרכז המסגרת.
4. הכינו מיכלים התואמים את הגובה והרוחב של המסגרת^{המלאה בזחלים} כדי לקלוט את הזחלים ה-5 על ידי ניקוי יסודי של המשטחים הפנימיים והחיצוניים במים וסבון, ולאחר מכן בתמיסת אקונומיקה, ולבסוף אתנול. ייבשו היטב את המיכל לפני שתמשיכו.
   1. מרפדים את תחתית המיכלים במספר שכבות של מגבות נייר. לאחר מכן הוסיפו מספר שכבות חופפות של מגבוני ניקוי דקים וסופגים יותר (למשל, מגבי משימה עדינים) או נייר סינון. החומר חייב להיות סופג. הימנעו מחפיפה בשכבה העליונה כדי לשפר את הקלות של העברת זחלים עתידית.
5. הניחו את המסגרות עם הפנים כלפי מטה (כאשר זחלי המוקד פונים כלפי מטה) על גבי המיכלים, כך שהזחלים יוכלו ליפול על שכבת מגבוני הניקוי.
   1. מכסים את המיכל ומסגרים בפיסת נייר אלומיניום או בכיסוי אחר כדי לשמור על הלחות ולהחזיר את ההתקנה לחממה. השאירו את ההתקנה למשך הלילה. הנטיות הטבעיות לחיפוש מזון של הזחלים יגרמו להם לזחול החוצה מהתאים שלהם וליפול על המשטח המרופד שמתחת.
6. הכינו מגשי העברה נפרדים על ידי ניקוי יסודי שלהם באמצעות אותם שלבים המפורטים ב-1.4. אפשרו למגשים להתייבש ולשכב את התחתונים עם מגבוני ניקוי. המגשים אינם צריכים להתאים למידות ספציפיות, אך מגשים רדודים יותר יאפשרו מניפולציות זחל קלות יותר.
   1. התחילו להעביר את הזחלים מהמכלים למגשים על ידי הרמה קפדנית של מגבונים בודדים מהשכבה העליונה במיכלים ושפיכה עדינה של הזחלים על המגשים. הזחלים היו אמורים ליפול לתוך המכלים בן לילה, וליצור כמה מסות דביקות (איור 1A).
   2. השתמשו במלקחיים רכים קהים כדי להפריד את הזחלים ולהניח אותם על פני המגשים. הם לא צריכים להיות מרווחים באופן שווה ויכולים להיות קרובים זה לזה אבל לא צריכים להיות נוגעים. ראו איור 1B לתיאור חזותי של זחלים מופרדים.
   3. נצלו את ההזדמנות הזו כדי להסיר זחלים פגומים (דהויים) או בגודל נמוך מהממוצע. אלה נוטים יותר למות במהלך תהליך ההבשלה ויכולים להביא לזיהומים / צמיחה פטרייתית לאורך המגש.
7. מכסים את המגש בנייר אלומיניום עם אוהלים כדי לשמור על הלחות ולהחזיר את ההתקנה לחממה.
8. בדקו את הזחלים מדי יום והסירו את כל הזחלים דהויים (חום כהה או שחור).
   הערה: הזחלים/טרום הגלמים יעשו את צרכיהם על מגבוני הניקוי, ויתבטאו ככתמים חומים קטנים. הם עשויים גם לייצר כמויות קטנות של וובים לבנים וחכמים כחלק מתהליך ההדבקה שלהם. אף אחד מהאירועים הללו אינו מחייב החלפת מגבוני הניקוי, כל עוד הם סופגים.
9. אפשרו לזחלים לגדל ולהבשיל לשלב העין הלבנה, שניתן לזהות על ידי צורתם הכללית התואמת את זו של הדבורה הבוגרת ועדיין חסרה פיגמנטציה בעיניהם וברוב שאר גופם. זה אמור להתרחש בין 14 ל -15 יום לאחר כלוב המלכה. הגלמים מוכנים כעת להזרקת וירוסים. איור 1C, 1D לדוגמאות של גלמים בעלי עיניים לבנות.

2. אפשרות מיצוי דבורים המונית 2: כריתה ידנית של פופאל

הערה: למרות שאופציה 2 (כריתת פופאל) היא שיטה בת קיימא של מיצוי דבורים, היא כוללת גם מספר חסרונות בהשוואה לאפשרות 1 (הסרה עצמית של הזחל). אפשרות 2 היא הרבה יותר אינטנסיבית בעבודה, קשה יותר לשליטה לגיל הפוריות, ובאופן כללי מלחיצה יותר על הדבורים עצמן. אפשרות 1 מומלצת במידת האפשר.

1. בחרו מסגרת של גוש דבורי דבש מכוסה המכיל גלמים בשלב העין הלבנה או בסמוך לו (ראו 1.9 לתיאור) ממושבה מתאימה. הסר את המכסה מתאי המסרק הממוקמים בסמוך למרכז ולקצוות של המסגרת כדי לאשר את נוכחותו של השלב ההתפתחותי המתאים.
2. מעבירים את המסגרת לחממה שנקבעה על 34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות יחסית. תמיד להחזיר את המסגרת לחממה כאשר לא בשימוש מיידי.
3. הכינו ונקו מגשי העברה זהים לאלה המתוארים ב-1.6.
4. הסר את המסגרת מהאינקובטור והצב על מעמד זוויתי מתחת למקור אור. להרטיב ערימה קטנה של מגבות נייר עם מים.
5. נקו זוג מלקחיים קשיחים קהים באמצעות אתנול. באמצעות המלקחיים הנקיים, יש להסיר את המכסה מהתאים המכילים גלמים בעלי עיניים לבנות, תוך הקפדה שלא לפגוע בגולם בתהליך.
6. בזה אחר זה, מוציאים בעדינות את הגלמים מתאי המסרק. הכי בטוח לתפוס את הגלמים סביב בית החזה והבטן באמצעות קצות המלקחיים, אם יש מספיק מקום. אם לא, עם זאת, ניתן גם להסיר את הגלמים על ידי אחיזת הראש וניעור איטי שלו מספיק רחוק כדי להיאחז סביב הגוף.
   1. מכסים את חלקי המסגרת שלא ניגשים אליהם באופן מיידי במגבות נייר רטובות כדי לשמור על הלחות. הסר והחלף לפי הצורך במהלך תהליך הכריתה.
7. פרשו את הגלמים שנכרתו לאורך מגבוני הניקוי במגשי ההעברה, וודאו שאף אחד מהם לא נוגע. יש להשליך כל גלמים מעוותים או דהויים. גלמים מוכנים כעת להזרקת וירוסים.
   1. השליכו גלמים המשחררים נוזל במגע עם המגבונים; סביר להניח שהם נוקבו. לפעמים, הגלמים יפגינו כתמים כהים קטנים של מלניזציה ליד נקודות המגע עם המלקחיים תוך שעה אחת עם ההסרה. זה לא אמור להשפיע על ההישרדות. אם מופיעים כתמים גדולים של מלניזציה, יש להשליך את הגלמים המושפעים.

3. הזרקת וירוס פופאל

הערה: אם מבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה (כלומר, ללא מלאי אינוקולה נגיפי קודם), תחילה לחלץ ולרכז חלקיקים באמצעות מבוגרים, גלמים או זחלים ממושבה עם חשד לזיהום. מדוד את הטיטרים הנגיפיים באינוקולה המתקבלת כמתואר בשלב 5 וקבע אילו חלקיקים להתפשט הלאה.

1. לעקר את כל משטחי העבודה באמצעות מי אקונומיקה ואתנול לפני שתתחיל לעבוד עם נגיפי דבורי הדבש. יש ללבוש כפפות ניטריל במהלך כל התהליך.
2. הכינו מנגנון מזרק המסוגל להזריק נוזל בכמויות של כ-1 μL.
   הערה: גישה זולה אך יעילה אחת תהיה ליצור מכשיר בעבודת יד על ידי הצמדת מחט היפודרמית של 30 גרם לקצה של קצה רב-מתקן של 100 μL (ראה טבלת חומרים) באמצעות אפוקסי גמיש או דבק נוזלי אחר. יש לוודא כי קצוות מכסה המחט אטומים בחוזקה כנגד קצה המתקן הרב-תכליתי ותנו למנגנון להתייבש. ראו איור 2 לתיאור חזותי של מנגנון מזרק לדוגמה.
3. הכן תמיסת דילול הזרקת וירוסים על ידי ערבוב הסוג הרצוי של חלקיקי הנגיף עם PBS מעוקר 1x (מלוחים עם חיץ פוספט) בצינור צנטריפוגה חרוטית של 15 מ"ל. הכמות הכוללת הדרושה תהיה תלויה במספר הגלמים שיש להזריק, כאשר כל גולם ידרוש הזרקה של 1 μL (למשל, 500 גלמים = 5 חלקיקי נגיף μL + 495 μL PBS).
4. חברו את מנגנון המזרק למולטי-פיפטה ידנית ובדקו את היעילות על ידי ציור של 100 מיקרול' מים מכוס נפרדת וחלוקתו במינונים של 1 μL. יש לוודא שכל כמות שמחלקים שווה, והחליפו את מנגנון המזרקים לפי הצורך. נקו את כל המים שנותרו מהמזרק.
5. אחזור מגשי הגלמים שנוצרו בשלב 1 או שלב 2 מהאינקובטור והסירו את כיסוי רדיד האלומיניום.
6. נקו זוג מלקחיים קשיחים קהים באמצעות אתנול. תפסו בעדינות את הגלמים הבודדים לאורך בית החזה, והפעילו מספיק לחץ כדי לכפות נוזלים פנימיים על הבטן. זה אמור להפוך את החלוקה הטרגית לבולטת יותר.
7. ציירו 100 μL של תמיסת חלקיקי הנגיף באמצעות המולטי פיפטה, החדירו את המחט בין תמיסת הבטן השלישית והרביעית, והזיקו 1 μL של תמיסת הנגיף. חזרו על הפעולה עבור כל גלם המונח על המגשים, תוך הקפדה על הימנעות מזריקות חוזרות. יש להשליך כל גלמים שניזוקו במהלך התהליך.
   אזהרה: כל החומרים הקשורים להכנת וירוסים מוגדרים כביו-האזרדים ויש להיפטר מהם באופן אוטומטי ולהיפטר מהם בהתאם להנחיות המוסדיות. כמו כן, יש להיפטר מהמחטים בהתאם להנחיות המוסדיות.
8. מכסים את מגשי הגלמים המוזרקים בנייר אלומיניום וחוזרים לחממה. אפשרו לחלקיקי הנגיף להתפשט בתוך הגלמים במשך 3-5 ימים.
   1. בצע בדיקות יומיות על הגלמים והסר את כל הדגימות המתות או הנרקבות כדי למנוע הצטברות חיידקים או פטריות. נקודות קטנות של מלניזציה עשויות להופיע באתר ההזרקה על הבטן אך אינן אמורות להשפיע על ההישרדות.
9. דגימת הגלמים לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 50 מ"ל ומערבולת כדי להפוך את התוכן להומוגניזציה של התכולה, תוך הקפדה על דגימת גלמים לצינורות לפי מקור מושבה כדי להפחית את הזיהום מווירוסים שאינם מטרה. ודא שלא נשארו גלמים שלמים והעביר את הצינורות למקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים למשקעים וריכוז חלקיקי הנגיף.

4. ריכוז חלקיקי הנגיף

הערה: פרוטוקול זה לא נבדק לשחזור וירוסים עטופים.

1. יש לאחסן באופן אוטומטי את כל החומרים והמיכלים לפני השימוש. יש ללבוש כפפות ניטריל, מעילי מעבדה והגנה על העיניים במהלך כל התהליך הזה. עיקרו את כל משטחי העבודה באמצעות מי אקונומיקה, אתנול ותמיסת ההשבתה RNase לפני שתתחילם.
   1. הכן 1x TES (Tris-EDTA-מלח) חיץ: יש לערבב 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA ו- 150 mM NaCl. לעקר על ידי אוטוקלאב.
2. להפשיר גלמים הומוגניים ולהעביר לבקבוקי צנטריפוגה. הוסיפו כשלושה כרכים של 1x PBS (למשל, הוסיפו צינור מלא של 50 מ"ל של גלמים ל-150 מ"ל של 1x PBS) והשוו את הנפחים לזה של הבקבוק המלא ביותר.
3. יש לערבב תחילה ביד ולאחר מכן על ידי הנחתו על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
4. צנטריפוגה ב 15,000 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת סלולרית. חזור על שלב זה לפי הצורך אם נותרה פסולת תאית.
   1. אם לסופרנאטנט יש כדוריות גדולות של שומן שצפות על פני השטח, יש לסנן מבעד לבגדי גבינה לתוך בקבוקי צנטריפוגה סטריליים נפרדים לפני שתמשיכו.
5. הוציאו את הסופרנאטל עם 0.3 כרכים של 24:1 כלורופורם:איזואמיל אלכוהול (למשל, 190 מ"ל של סופרנאטנט + 57 מ"ל של כלורופורם:איזואמיל אלכוהול) וערבבו על ידי היפוך. צנטריפוגה ב 21,000 x g ב 4 ° C במשך 20 דקות.
   אזהרה: הימנע ממגע ישיר עם כלורופורם על העור או העיניים. ללבוש תמיד PPE מתאים. יש להיפטר מכל פסולת הכלורופורם בהתאם להנחיות המוסדיות.
6. שחזרו את השלב המיימי מכל בקבוק על ידי פירוק הסופרנאטנט לכוסות סטריליות נפרדות של 500 מ"ל באמבטיית קרח או בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס. הקפידו להימנע מזיהום ה-supernatant עם כלורופורם מכיוון שהוא יקשה על תהליך הטיהור; עדיף לאבד קצת שלב מימי.
7. הוסיפו מים ללא RNase כדי להביא כל לנפח של 200 מ"ל. מניחים את הכוסות על לוחות ערבוב מגנטיים ומשחררים פנימה מוט ערבוב בגודל בינוני. הגדר את הצלחות לבחוש במיקום בינוני-נמוך.
8. הוסיפו באיטיות את NaCl לכל תחת ערבוב עדין מתמיד, מה שמעלה כל אחת מהן לריכוז סופי של 2.3% (למשל, 4.6 גרם NaCl לכל 200 מ"ל של סופרנטנט). הוסיפו פוליאתילן גליקול 8000 (PEG) לכל עד לריכוז סופי של 7% (לדוגמה, 14 גרם PEG לכל 200 מ"ל של הסופרנטנט).
9. כסו את הכוסות בנייר אלומיניום והמשיכו לבחוש במהירות בינונית-נמוכה על קרח או בחדר קר במשך 1-5 שעות כדי להמיס את ה-PEG. ככל שיוקדש יותר זמן לביטוש, כך ה-PEG יתמוסס בצורה יסודית יותר.
10. כבו את צלחות הערבוב. דגירו את הכוסות המכוסות במשך 1-3 ימים על קרח או בחדר קר כדי לאפשר לחלקיקי הנגיף והחלבונים לזרז. ככל שמבלים יותר זמן בדגירה, כך יש יותר חלקיקים שיזרזו.
11. העבר את התכולה של כל לבקבוקי צנטריפוגה נקיים נפרדים וצנטריפוגה ב- 15,000 x g ב- 4 ° C למשך 30 דקות כדי לשחזר גלולת חלקיק PEG. השליכו את הסופרנאטנט.
12. שפשפו בזהירות את כדור ה-PEG-חלקיקים מצידי הבקבוק והחזירו אותם לנפחים מינימליים של חיץ TES 1x בתוך כוסות נקיות על ידי הוספה איטית של כמויות קטנות של TES לכדורים (כ-10 מ"ל לכל 100 דבורים מקוריות).
13. מעבירים את הכדור התלוי דרך מחט של 18 גרם לפחות עשר פעמים לפני שהם עוברים לצינורות צנטריפוגה של 2 מ"ל. שמור את כל הצינורות על קרח עד שהם מוכנים ל-4.14.
14. צנטריפוגה 2 מ"ל צינורות ב 13,000 x g ב 4 °C במשך 15 דקות כדי להסיר PEG נוסף. העבר את הסופרנטנט לתוך צינור צנטריפוגה אחר של 2 מ"ל באמצעות פיפטה של 1,000 μL וחזור על שלב הצנטריפוגה כדי להבטיח הסרה מלאה של כל PEG.
15. רכזו את החלקיקים הנותרים בתוך הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה חדשים באמצעות יחידות סינון צנטריפוגליות (ניתוק של 100 kDa) באמצעות מספר סבבים של צנטריפוגה בטמפרטורה של 14,000 x g בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 דקות כל אחת עד שתגיעו לכ-10 חמישית מהריכוז המקורי (10 מ"ל של תמיסת חלקיקים-TES לכ-2 מ"ל של חלקיקים מרוכזים). יחידות הסינון מגיעות בגדלים שונים; בחר את המתאים ביותר למספר הדגימות המעובדות. היחידות שמתאימות לצינורות חרוטיים בגודל 15 מ"ל הן בדרך כלל המתאימות ביותר.
16. בצעו החייאה של החלקיקים המרוכזים על ידי מעבר דרך מחט היפודרמית של 26 גרם וצנטריפוגה ב-14,000 x גרם ב-RT למשך 5 דקות לסיבוב אחרון אחד של הסרת PEG. אם הנוזל עדיין מעונן, יש לחזור על הפעולה עד להסרת כל משקעי PEG.
17. Aliquot את supernatant צמיג לתוך כמויות הרצויות ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.

5. מיצוי וכימות RNA של הנגיף

1. חילוץ RNA מדבורים שלמות או מחלקיקי נגיף מרוכזים בכל שיטת מיצוי RNA מתאימה (לדוגמה, מגיב מיצוי RNA TRIzol ולאחר מכן טיפול ב-DNase).
2. כימות טיטרים של וירוסים באינוקולום שנוצר בשלב 5.1 באמצעות RT-qPCR, רצוי באמצעות שיטה מבוססת עקומה סטנדרטית שאינה מסתמכת על ביטוי גנים^{מארחים 18}, אם כי שיטות אחרות עשויות גם לאפשר הערכות.

6. בדיקה ביולוגית של האכלה ויראלית

1. הכן את כל החומרים הדרושים לבדיקה הביולוגית לפני שלב איסוף המסגרות (6.2) או במהלך תקופת הופעת הדבורים של 24 שעות (6.3).
   1. הכינו כלובים נקיים או מארזים אחרים המסוגלים להכיל את מספר הדבורים הדרושות לבדיקה הביולוגית (לדוגמה, כלובי קופסאות אקריליים בגודל 10.16 ס"מ x 10.16 ס"מ x 7.62 ס"מ) על ידי חיבור כל חורי ההזנה עם צינור צנטריפוגה בגודל מתאים (איור 3). קבעו וקבעו באופן אקראי את הטיפולים בין הכלובים ותייגו כל אחד מהם בטיפול הייעודי שלהם לעיון קל בעתיד.
   2. הכינו מגשי אינוקולום על ידי תיוג סירות משקל בודדות בגודל בינוני עם הכלוב והטיפול המתאימים להן.
   3. הכינו תמיסת האכלה על ידי ערבוב הכמות המתאימה של סוכרוז עם מים שעברו דה-יוניזציה (למשל, 300 גרם סוכרוז לכל 1 ליטר מים עבור תמיסת סוכרוז של 30%), והקפידו לעקר את המים לפני ואחרי הוספת סוכרוז. תמיסת סוכרוז סטרילית יכולה להיות מאוחסנת במקרר של 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות, אך יש להשליך אותה אם מופיעה עננות כלשהי.
   4. מכינים צינורות הזנה על ידי מילוי חלקי של צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל בתמיסות הזנה המיוצרות ב-6.1.3, הופכים אותם, ומנקבים 1-2 חורים סביב קצה הצינור עם אגודל. חורים יכולים גם להיות מומסים באמצעות מחט היפודרמית 18G המחוממת מעל להבה. וודאו שמכסי צינורות ההזנה מוברגים בחוזקה רבה, שכן כובעים רופפים עלולים לגרום לדליפות איטיות שיטביעו את יושבי הכלובים בן לילה.
      הערה: ניתן להתאים את תמיסות ההזנה ואת נפח צינורות ההזנה לפי הצורך כך שיתאימו לצרכים ניסיוניים.
   5. הכינו קולקציה פתוחה לדבורים שזה עתה הופיעו על ידי ציפוי קל של קצוות של גיגית גדולה בשמן צמחי או בחומר שמנוני דומה. בנפרד, להכין כמה כוסות קטנות באותה שיטת ציפוי.
2. בחר והסר מסגרות של דבורת דבש על סף ההסתרה שמקורן בלפחות שלוש כוורות נפרדות. דבורים מזדקנות כראוי דומות למבוגרים בעלי פיגמנט מלא מתחת לכיסוי תאי המסרק. סימן בטוח להופעתו המתמשכת הוא התבוננות בתושבי התאים הלועסים באיטיות את דרכם החוצה ו/או תאים שהתרוקנו לאחרונה עם סימני לעיסה משוננים אופייניים לאורך מכסה השעווה.
   הערה: הכמות המדויקת של המסגרות הנדרשות תהיה תלויה בגודל הניסוי, בכמות ה-brood המתהווה לכל פריים ובזמן השנה. מסגרת עמוקה סטנדרטית של Langstroth מכילה כ-3,000 תאי מסרק לכל צד; מסגרת המכילה בעיקר גלמים מכוסים, עם כמה נצפים מתעוררים יכול בקלות לייצר 400+ דבורים ב 24 שעות. התאימו את עצמכם לאורך כל העונה, לפי הצורך.
3. יש להבריש את כל הדבורים הבוגרות לפני הכנסת המסגרות לקופסאות הופעה והעברתן לחממה התואמת את התנאים הפנימיים של כוורת (34 מעלות צלזיוס ו-50% לחות לחות חיים). אפשרו לדבורים להגיח במשך 24 שעות.
4. הסירו את קופסאות ההופעה מהאינקובטור והברישו את כל הדבורים החדשות שיצאו לתוך אמבט האיסוף. הקפידו להסיר את כל הדבורים גם מתיבות ההופעה כדי למנוע הכללה של דבורים מיושנות בצורה לא נכונה בכל הצחצוחים הבאים. כל דבורה שיכולה לעוף הופיעה לפני > 24 שעות ויש להוציא אותה מהבדיקה הביולוגית.
5. לייצר תערובת הומוגנית של דבורים שזה עתה הופיעו על ידי ערבוב עדין של הדבורים באמבט האיסוף ביד (הן אינן יכולות לעקוץ בגיל זה) כדי למזער את ההשפעות הגנטיות של הכוורת מכל מושבה בודדת. עבור יישומים ספציפיים, הסדרים אחרים עבור מקור המושבה עשויים להיות רצויים.
6. ספרו 35 דבורים בודדות, והכניסו כל אחת מהן לאותה משומנת לפני העברת התכולה לכלוב אקרילי. לחלופין, ייתכן שיהיה קל יותר להפריד בין כפולות קטנות יותר של דבורים למספר כוסות משומנות (למשל, 5 כוסות של 7 דבורים כל אחת) כדי למנוע שגיאות של ספירה שגויה. מספר הדבורים המשמשות יכול להיות מגוון בהתאם לצרכים וליישומים.
7. העבירו את כלובי הדבורים לחממה (34 מעלות צלזיוס ו-50% RH), והקפידו לעקוב אחר סדר ההשמה האקראי שנוצר ב-6.1.1 כדי למזער את ההשפעות הפוטנציאליות של מיקרו אקלים.
8. הכן סביבת עבודה לעבודת וירוסים על ידי ניקוי כל המשטחים והפיפטות עם מי אקונומיקה, אתנול ותמיסת ההשבתה RNase לפני שתתחיל. הקפידו ללבוש כפפות ניטריל בכל פעם שאתם מטפלים בחלקיקי הנגיף.
9. הכינו את האינוקולום של הנגיף לריכוז הרצוי על ידי הפשרת כמות מתאימה של חלקיקי נגיף מרוכזים (שלב 4.17) וערבוב יסודי עם תמיסת סוכרוז מספקת (שלב 6.1.3) במיכל סטרילי. עבור כלובים של 35 דבורים, כל אחד מהם דורש 600 μL של אינוקולום. דילולים סדרתיים מומלצים אם ריכוז הנגיף הרצוי הוא 0.1% או פחות.
   1. לדוגמה, ניסוי שיכלול 40 כלובים שכולם זקוקים לאינוקום של 1% בנגיף ידרוש 24 מ"ל של תמיסת וירוס, שניתן ליצור על ידי שילוב של 240 μL של חלקיקי וירוס מרוכזים עם 23.76 מ"ל של תמיסת סוכרוז. מומלץ לכלול כ-15% יתר על המידה בנפח ההתחלתי, שכן צפויים הפסדים מסוימים עם נוזלים צמיגים.
10. פרשו את מגשי האינוקולום שהוכנו ב-6.1.2 ממוינים לפי סוג הטיפול ופיפטה 600 μL של האינוקולום המתאים על כל מגש.
    1. הכניסו בזהירות את מגשי האינוקולום לכלובים המתאימים להם, תוך הקפדה שלא לשחרר בטעות דבורים. נצלו את ההזדמנות הזו כדי לסרוק את הדבורים ולהחליף את כל מה שאולי מת בתהליך ההעברה.
11. אפשר צריכה מלאה של האינוקולה (כ-12-14 שעות) לפני הסרת צינורות הצנטריפוגה החוסמים את חור המזין העליון ומכניסים את צינורות ההזנה המתאימים שהוכנו ב-6.1.4. זה עוזר להבטיח שהדבורים בכלוב יחלקו את האינוקולום באופן שווה על פני האוכלוסייה. תמיסת סוכרוז מסופקת עד ליבטום ויש למלא מחדש את הצינורות לפי הצורך במהלך הניסוי.
12. רשמו את התמותה בכל כלוב במרווחים של 12 שעות במשך 72 השעות הראשונות של כל ניסוי, ולאחר מכן הזיזו את ההקלטה למרווחים של 24 שעות. הסר דבורים מתות מכלובים כדי להגביר את קלות הספירה העתידית על ידי החלקת דלת הכלוב למעלה מספיק רחוק כדי שזוג מלקחיים יוכלו להגיע פנימה ולהוציא דבורים מתות. הקפידו לעקר את המלקחיים מעל מנורת אלכוהול בין כלובים כדי למנוע זיהום צולב נגיפי.
13. דגימת דבורים למדידות טיטר נגיפיות (5.1-5.2) על ידי בחירה אקראית של דגימות חיות בתוך כלוב והנחתם בצינורות צנטריפוגה על קרח יבש. בדרך כלל, שלוש דבורים מספיקות כדי לייצר מדידות טיטר נגיפיות בכל נקודת זמן נתונה מבלי לנטרל גם את הכלוב.
14. המשך מדידות תמותה קבועות כל עוד יש צורך בכך.

תוצאות

מעקב מוצלח אחר הפרוטוקולים (איורים 1) להזרקת pupal ומיצוי נגיפי אמור לייצר כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים. עם זאת, דגימה והזרקה של גלמים שמקורם ממגוון מושבות בנקודות זמן מרובות ממקסמת את הסיכויים לרכוש וירוס מטרה עם זיהום נמוך. הדינמיקה שבאמצעותה וירוסים משכפלים ומתקשרים זה עם זה ב...

Discussion

כאן תיארנו שיטות המפרטות כל שלב בתהליך ההגברה והכנת מלאי האינוקולום של הנגיף, כולל איסוף זחלים והתפשטות הנגיף, מיצוי וריכוז הנגיף, כמו גם טיפול נגיפי בצורה של ניסויי האכלה בכלובים. שיטות אלה מאפשרות ייצור של חלקיקי נגיף טהורים למחצה (איור 4), שיעילותם ניתנת לכימות באופן עקב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375