꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

요약

여기서 우리는 두 가지 프로토콜을 설명합니다 : 먼저 꿀벌 번데기를 제거하는 방법을 포함하여 다량의 꿀벌 비 외피 바이러스 입자를 전파, 추출, 정제 및 정량화하는 것과 두 번째로 반복성이 높고 처리량이 높은 케이지 생물 검정을 사용하여 바이러스 감염의 효과를 테스트하는 것입니다.

초록

꿀벌은 전 세계적으로 생태 학적 및 농업적으로 매우 중요하지만 바이러스 성 병원균에 노출되는 것을 포함하여 꿀벌 건강에 부정적인 영향을 미치는 다양한 압력을받습니다. 이러한 바이러스는 매우 다양한 파괴적인 효과를 일으킬 수 있으며 실험 치료의 효과를 기존의 배경 감염과 분리하는 것을 어렵게 만드는 여러 요인으로 인해 연구하기가 어려울 수 있습니다. 여기서 우리는 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기 위해 높은 처리량의 생물 분석과 함께 다량의 바이러스 입자를 대량 생산하는 방법을 제시합니다. 현재 바이러스가없는 지속적인 꿀벌 세포주의 부족으로 인해 바이러스 입자는 최소한의 스트레스 방법론을 사용하여 벌집에서 대량으로 추출되는 꿀벌 번데기를 사용하여 생체 내에서 증폭됩니다. 이 바이러스 입자는 꿀벌 케이지 생물 검정에 사용되어 접종 생존력뿐만 아니라 영양, 살충제 및 기타 병원체와의 상호 작용을 포함한 다양한 다른 바이러스 감염 역학을 테스트 할 수 있습니다. 이러한 입자를 사용하는 가장 큰 장점은 감염된 꿀벌 용혈림프 또는 균질화에 의한 감염과 같은 현재의 대안과 비교할 때 후속 실험에서 알려지지 않은 변수를 도입 할 가능성을 크게 줄여 주지만 꿀벌을 소싱 할 때는주의를 기울여야하지만 배경 바이러스 오염을 최소화해야한다는 것입니다. 케이지 분석은 콜로니 수준에서 바이러스 감염 효과를 테스트하는 대규모 현장 현실적인 실험을 대체하는 것이 아니라 반순수 바이러스 입자와 결합하여 꿀벌과 바이러스 생리 적 상호 작용의 다양한 차원을 검사하는 중요한 도구 역할을 할 수있는 기준선 바이러스 반응을 확립하는 방법으로 기능합니다.

서문

꿀벌 (Apis mellifera)은 현대 세계 농업 환경에서 중요한 역할을하지만 현재 살충제 노출, 가난한 사료, 기생충 및 병원균 ^1,2를 포함한 생물 학적 스트레스 요인과 비생물 적 스트레스 요인의 조합으로 고통 받고 있습니다. 우려되는 가장 중요한 병원균 중 하나는 바이러스이며, 그 중 많은 바이러스는 또 다른 주요 꿀벌 스트레스 요인 인 기생 Varroa 진드기 (Varroa 소멸자)에 의해 벡터화됩니다. 이 바이러스는 꿀벌에 일련의 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다 감소 된 새끼 생존, 발달 결함 및 마비를 포함하여 과동기 ^3,4,5 전후에 총 벌집 붕괴로 이어질 수 있습니다. 바이러스 감염 6,7,8,9 퇴치에 사용되는 기술 개발에는 유망한 발전이 있었지만, 꿀벌이나 식민지 내에서 많은 바이러스가 전파, 확산 및 상호 작용하는 역학은 여전히 잘 이해되지 않습니다 ^5,10 . 꿀벌과 바이러스 상호 작용의 기본 생물학과 다른 환경 요인과의 관계를 이해하는 것은 효과적인 바이러스 관리 기술을 개발하는 데 중요합니다.

그러나 꿀벌 - 바이러스 상호 작용을 연구하는 것은 과정을 복잡하게 만드는 수많은 알려진 요인과 알려지지 않은 요인으로 인해 어려움을 겪습니다. 여기에는 식이요법 11,12, 살충제 노출(13), 꿀벌 유전적 배경^(14,15)과의 상호작용이 포함된다. 바이러스 감염에만 초점을 맞출 때조차도, 꿀벌 개체군은 관리되고 야생이기 때문에 합병증이 흔합니다.하지만 종종 급성 증상을 나타내지 않고 바이러스 ^16,17 및^바이러스 공동 감염의 효과는 잘 이해되지 않습니다 ¹⁸. 이로 인해 꿀벌 바이러스 효과에 대한 연구가 풀리기 어려워졌습니다.

많은 꿀벌 바이러스 연구는 상황 바이러스 감염을 사용하여 다른 스트레스 요인과의 상호 작용을 찾아 배경 감염이 다른 치료법^12,19,20,21과 어떻게 변하는지 관찰^{했습니다.} 이 접근법은 중요한 효과, 특히 살충제 또는식이 요법이 바이러스 수준과 복제에 어떻게 영향을 미치는지 발견하는 데 성공했지만 알려진 함량과 농도의 바이러스 처리 접종은 바이러스 감염 역학의 실험적 테스트에 중요합니다. 그럼에도 불구하고 실험적 치료를 배경 감염과 분리하는 것도 어려움을 초래할 수 있습니다. 현장 연구에서 연구자들은 꿀벌에서 꿀벌²²로 바이러스가 전염되는 증거를 제공하기 위해 변형 된 날개 바이러스 (DWV)의 균주를 차별화했지만이 접근법을 사용하는 것은 꿀벌만으로는 어려울 것입니다. 바이러스 감염성 클론은 감염 23,24,25을 추적하는 것뿐만 아니라 꿀벌 바이러스의 역 유전학 연구 및 바이러스 - 숙주 상호 작용 연구 ^26,27,28을위한 강력한 도구입니다. 그러나 대부분의 경우, 감염성 클론은 입자를 생산하기 위해 세포 내부의 감염주기를 충족시켜야합니다. 이러한 입자는 그들의 감염성이 네이키드 바이러스 RNA보다 높고 캡슐화된 게놈을 사용한 접종이 자연 감염을 모방하기 때문에 실험적 치료를 위한 접종물로서 바람직하다.

오염되지 않은 순수 꿀벌 바이러스 접종물 (야생형 바이러스 균주 또는 감염성 클론에서 유래 한 균주)의 생산은 또한 도전을 제기합니다. 이들은 주로 순수 균주 바이러스^29,30을 생산하기 위해 신뢰할 수 있고, 지속적으로 복제되는^, 바이러스가 없는 꿀벌 세포주를 수득하는데 어려움 때문이다. 일부 세포주가 생산되었지만, 이러한 시스템은 불완전한 상태로 남아 있습니다. 그럼에도 불구하고 생존 가능한 세포주가²⁹ 개 생산되어 바이러스 생산 및 조사를보다 세밀하게 제어 할 수 있기를 희망합니다. 이러한 라인이 널리 이용가능해질 때까지, 대부분의 바이러스 생산 프로토콜은 생체내 바이러스 생산 및 정제^{(18,31,32,33,34})의 사용에 계속 의존할 것이다. 이러한 접근법에는 관심있는 바이러스 입자를 확인하고 정화 (또는 전염성 클론을 생산)하고이를 사용하여 꿀벌, 보통 번데기와 같은 꿀벌을 감염시키는 것이 포함됩니다. 번데기는 표적 바이러스와 함께 주입 된 다음 희생되고 더 많은 입자가 추출되고 정제됩니다. 그러나 처음에는 바이러스가없는 꿀벌이 없기 때문에 그러한 농축액에서 다른 바이러스의 흔적으로 인해 어느 정도 오염이 항상 발생하므로 배경 감염 가능성이 낮은 꿀벌을 선택할 때 세심한주의를 기울여야합니다. 또한, 이들 프로토콜(³³)에 사용하기 위해 빗 세포로부터 번데기를 제거하는 방법은 매우 노동 집약적이며 꿀벌에서 스트레스를 유도할 수 있으며, 이러한 수단(^18,32)에 의해 생산을 제한한다. 여기에서, 우리는 꿀벌에 대한 노동이 거의없고 기계적 스트레스가 적고 애벌레를 대규모로 제거 할 수있는 대체 방법을보고합니다.

번데기를 얻고 시작 바이러스 접종물과 함께 주입하면 바이러스가 복제 할 시간을 제공하기 위해 배양되어야합니다. 이어서, 생산된 바이러스 입자는 실험용 꿀벌을 감염시키는 데 사용할 수 있는 형태로 가공될 수 있다. 이를 달성하기 위한 몇 가지 간단한 방법들이 있는데, 여기에는 바이러스적으로 감염된 꿀벌로부터 생성된 조질 균질액(^35,36) 또는 용혈림프⁽³⁷)를 감염원으로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 효과적이지만 배경 기질로부터 알려지지 않은 변수 (예 : 죽은 벌 균질물의 다른 요인)를 도입 할 가능성이 더 큽니다. 또한, 실험이 단기간에 바이러스의 크고 알려진 복용량을 제공해야하는 경우 입자를 집중시키는 것이 바람직합니다. 따라서, 보다 나은 제어를 위해, 바이러스 입자의 어느 정도의 정제 및 농축을 허용하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 일련의 침전 및 원심분리 단계는 거의 모든 가능한 비표적 바이러스 물질(³³)의 제거를 초래할 것이다.

이 농축 접종물을 생산 한 후, 바이러스 역가 (qPCR)를 정량화하고 생체 내 생물 분석법으로 특성화하여 생존력과 사망률을 유발하는 능력을 테스트 할뿐만 아니라 감염 후 증가 된 바이러스 역가가 얻어진다는 것을 확증하는 것이 유익합니다. 이것은 주사 실험 (번데기 또는 성인으로) 또는 먹이 실험 (애벌레 또는 성인에게)을 통해 달성 될 수 있습니다. 이러한 모든 접근법이 가능하지만 새장에있는 성인 꿀벌 그룹에 먹이를주는 것이 종종 가장 빠르고 간단합니다. 케이지 분석 방법은 또한 살충제 독성³⁸, 난소 발달³⁹ 및 행동^40,41에 대한 영양 영향을 포함하여 꿀벌에 대한 다양한 다른 치료법을 테스트하는 데 널리 사용되므로 바이러스 감염과 다른 요인⁽⁴²)을 연결하는 실험을위한 좋은 기초를 형성 할 수 있습니다.

여기서는 꿀벌에 대한 노동 및 기계적 스트레스를 줄이는 번데기를 제거하는 방법과 바이러스 감염 및 효과를 테스트하기위한 반복성이 높고 처리량이 높은 생물 분석을 포함하여 값 비싼 초원심분리기를 사용하지 않고 대량의 반 순수하고 고농축 바이러스 입자를 생산하는 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 바이러스 접종의 순도를 엄격하게 조절함으로써 조사관은 다른 바이러스 접종 방법에 비해 꿀벌 바이러스 반응의 변화를 줄일 수 있습니다. 또한, 생물 분석은 현장 현실적인 설정으로 확장하기 전에 매우 반복 가능한 실험 단위를 사용하여 소그룹 수준에서 바이러스 효과를 스크리닝 할 수 있으며, 이는 관리하기에 훨씬 더 노동 집약적입니다. 이 두 가지 방법이 결합되어 꿀벌 - 바이러스 생리 학적 상호 작용에 대한 전반적인 이해를 향상시키는 데 도움이되는 연구에 필요한 도구를 제공합니다.

프로토콜

1. 대량 꿀벌 추출 옵션 1 : 애벌레 자체 제거

1. 꿀벌 여왕을 텅 빈 랭스트로스 프레임에 감금하고 그녀를 식민지로 돌려 보내십시오. 여왕이이 프레임에 24 시간 동안 알을 낳게하십시오.
   1. 빗 세포의 대부분에 새로 낳은 알이 포함되어 있는지 확인하기 위해 24 시간 후에 프레임을 확인하십시오. 여왕과 식민지에 따라 계란은 처음 24 시간 동안 잘 낳지 않는 경우가 있습니다. 이 경우 추가 24 시간을 허용하고 필요에 따라 시간을 조정하십시오.
2. 24 시간 알을 낳는 기간이 지나면 여왕을 풀어주십시오. 프레임을 명확하게 표시하고 식민지로 되돌려 보내십시오.
3. 여왕을 케이징 한 후 정확히 192 시간 (8 일) (처음 24 시간 이내에 정상적인 알을 낳는다고 가정하고, 8 일은 번식 직전 시점을 표시한다), 식민지에서 표시된 프레임을 제거하십시오. 모든 성인 꿀벌을 털어 내고 프레임을 하이브의 내부 조건 (34 ° C 및 50 % 상대 습도 (RH))과 일치하는 인큐베이터로 옮깁니다.
   1. 프레임의 대부분이 빗 세포의 바닥 가장자리에 단단히 밀착 된 크고 흰색의 C 자형 몸체로 인식 할 수있는 5^번째 인스타 유충으로 채워져 있는지 확인하십시오. 특히 프레임의 중심 근처에 왁스 캡핑으로 이미 덮인 몇 개의 세포가있을 가능성이 큽니다.
4. 유충이 채워진 프레임의 높이와 너비에 맞는 용기를 준비하여 비누와 물로 내부 및 외부 표면을 철저히 청소하고 표백액과 마지막으로 에탄올을 사용하여 5^번째 인스타 유충을 수용하십시오. 계속하기 전에 용기를 완전히 말리십시오.
   1. 용기의 바닥을 여러 겹의 종이 타월로 정렬하십시오. 그런 다음 더 얇고 흡수성이 강한 청소 물티슈 (예 : 섬세한 작업 와이퍼) 또는 여과지의 겹치는 여러 층을 추가하십시오. 재료는 흡수성이 있어야합니다. 미래의 애벌레 이동의 용이성을 향상시키기 위해 최상층과 겹치는 것을 피하십시오.
5. 유충이 닦은 물티슈 층에 떨어질 수 있도록 용기 위에 프레임을 아래로 향하게하십시오 (초점 유충이 아래쪽을 향하게).
   1. 용기와 프레임을 알루미늄 호일 또는 기타 덮개로 텐트 조각으로 덮어 수분을 유지하고 설정을 인큐베이터로 되돌립니다. 하룻밤 사이에 설정을 종료합니다. 애벌레의 자연 식량 추구 경향은 그들이 세포에서 기어 나와 아래의 패딩 된 표면으로 떨어지게합니다.
6. 1.4에 설명된 것과 동일한 단계를 사용하여 철저하게 청소하여 별도의 이송 트레이를 준비합니다. 트레이를 말리고 청소용 물티슈로 바닥을 겹쳐 놓습니다. 트레이는 특정 치수와 일치 할 필요는 없지만 얕은 트레이는 애벌레 조작을 더 쉽게 허용합니다.
   1. 컨테이너의 최상층에서 개별 물티슈를 조심스럽게 들어 올리고 유충을 트레이에 부드럽게 부어 용기에서 쟁반으로 옮기기 시작하십시오. 유충은 하룻밤 사이에 용기에 빠져 여러 개의 끈적 끈적한 덩어리를 형성해야합니다 (그림 1A).
   2. 무딘 부드러운 포셉을 사용하여 애벌레를 분리하고 트레이 표면을 가로 질러 배치하십시오. 그들은 균등하게 간격을 둘 필요가 없으며 서로 가까이 할 수 있지만 만져서는 안됩니다. 분리 된 유충의 시각적 묘사에 대해서는 도 1B 를 참조하십시오.
   3. 이 기회를 빌어 손상된 (변색된) 또는 평균 이하의 크기의 애벌레를 제거하십시오. 이들은 성숙 과정에서 사망 할 가능성이 더 높으며 트레이 전체에 감염 / 곰팡이 성장을 가져올 수 있습니다.
7. 트레이를 텐트 알루미늄 호일로 덮어 수분을 유지하고 설정을 인큐베이터로 되돌립니다.
8. 매일 애벌레를 확인하고 변색 된 것 (짙은 갈색 또는 검은 색)을 제거하십시오.
   참고 : 애벌레 / 번데기 이전의 번데기는 작은 갈색 패치로 나타나는 청소 물티슈에 배설됩니다. 그들은 또한 캡핑 과정의 일환으로 소량의 흰색, wispy 웨빙을 생산할 수 있습니다. 이러한 발생 중 어느 것도 흡수성이있는 한 청소 물티슈를 교체 할 필요가 없습니다.
9. 애벌레가 번데기가되고 흰 눈 단계까지 성숙 할 수있게하십시오.이 단계는 성인 꿀벌의 일반적인 모양과 일치하는 일반적인 모양으로 식별 할 수 있지만 눈과 나머지 신체의 대부분에는 색소 침착이 여전히 부족합니다. 이것은 여왕 케이징 후 14 일에서 15 일 사이에 발생해야합니다. 번데기는 이제 바이러스 주사 준비가되었습니다. 도 1의C, 1D는 흰 눈 번데기의 예이다.

2. 대량 꿀벌 추출 옵션 2 : 수동 번데기 절제

참고 : 옵션 2 (번데기 절제)는 꿀벌 추출의 실행 가능한 방법이지만 옵션 1 (애벌레 자체 제거)과 비교할 때 몇 가지 단점이 있습니다. 옵션 2는 훨씬 더 노동 집약적이며, 번데기 나이를 통제하기가 더 어렵고, 일반적으로 꿀벌 자체에 더 많은 스트레스가 있습니다. 가능하면 옵션 1을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 적합한 콜로니에서 흰 눈 단계 또는 그 근처에서 번데기를 포함하는 뚜껑을 덮은 꿀벌 무리의 프레임을 선택하십시오 (설명은 1.9 참조). 프레임의 중앙과 가장자리 근처에 위치한 빗 셀에서 캡핑을 제거하여 적절한 발달 단계의 존재를 확인합니다.
2. 프레임을 34°C 및 50% 상대 습도로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다. 즉시 사용하지 않을 때는 항상 프레임을 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오.
3. 1.6에 설명 된 것과 동일한 전송 트레이를 준비하고 청소하십시오.
4. 인큐베이터에서 프레임을 제거하고 광원 아래의 각진 스탠드에 놓습니다. 작은 종이 타월 더미에 물을 적셔라.
5. 에탄올을 사용하여 무딘 하드 포셉 한 켤레를 청소하십시오. 깨끗한 포셉을 사용하여 흰 눈 번데기가 들어있는 세포에서 캡핑을 제거하고 그 과정에서 번데기를 손상시키지 않도록주의하십시오.
6. 하나씩 빗 세포에서 번데기를 부드럽게 절제하십시오. 충분한 공간이있는 경우 포셉 팁을 사용하여 흉부와 복부 주변의 번데기를 잡는 것이 가장 안전합니다. 그러나 그렇지 않은 경우 번데기는 머리를 잡고 천천히 몸을 움켜 쥐기에 충분히 멀리 흔들어서 제거 할 수 있습니다.
   1. 습기를 유지하기 위해 젖은 종이 타월로 즉시 접근하지 않는 프레임 부분을 덮으십시오. 절제 과정에서 필요에 따라 제거하고 교체하십시오.
7. 적출 된 번데기를 청소용 물티슈를 따라 이송 트레이에 공간을 두어 어느 것도 만지지 않도록하십시오. 변형되거나 변색 된 번데기는 버려야합니다. 번데기는 이제 바이러스 주사 준비가되었습니다.
   1. 물티슈와 접촉시 액체를 방출하는 번데기를 버리십시오. 그들은 아마도 구멍을 뚫었을 것입니다. 때때로, 번데기는 제거시 1 시간 이내에 포셉과의 접촉 지점 근처에서 멜라닌화의 작은 어두운 반점을 나타낼 것입니다. 이것은 생존에 영향을 미치지 않아야합니다. 멜라닌화의 큰 패치가 나타나면 영향을받는 번데기를 버려야합니다.

3. 번데기 바이러스 주사

참고: 이 프로토콜을 처음 수행하는 경우(즉, 사전 바이러스 접종 스톡이 없는 경우), 먼저 감염이 의심되는 콜로니의 성인, 번데기 또는 유충을 사용하여 입자를 추출하고 농축합니다. 단계 5에 기재된 바와 같이 결과물 접종물에서 바이러스 역가를 측정하고 어떤 입자가 추가로 전파할 것인지를 결정한다.

1. 꿀벌 바이러스 작업을 시작하기 전에 표백제와 에탄올을 사용하여 모든 작업 표면을 살균하십시오. 니트릴 장갑은 전체 과정에서 착용해야합니다.
2. ~1 μL 양으로 유체를 주입할 수 있는 인젝터 장치를 준비한다.
   참고 : 저렴하면서도 효과적인 접근법 중 하나는 유연한 에폭시 또는 다른 액체 접착제를 사용하여 100 μL 멀티 디스펜서 팁 ( 재료 표 참조)의 팁에 30G 피하 주사 바늘을 부착하여 수제 장치를 만드는 것입니다. 바늘 뚜껑의 가장자리가 멀티 디스펜서 팁에 단단히 밀봉되어 있는지 확인하고 장치가 건조되도록 하십시오. 예시적인 인젝터 장치의 시각적 묘사는 도 2 를 참조한다.
3. 15 mL 원뿔형 원심분리 튜브에서 원하는 유형의 바이러스 입자와 멸균된 1x PBS(인산염 완충 식염수)를 혼합하여 바이러스 주입 희석액을 제조하였다. 필요한 총 양은 주사될 필요가 있는 번데기의 수에 의존할 것이며, 각각의 번데기는 1 μL 주사를 필요로 한다(예를 들어, 500 번데기 = 5 μL 바이러스 입자 + 495 μL PBS).
4. 인젝터 장치를 수동 다중 피펫에 부착하고 별도의 비이커로부터 100μL의 물을 채취하여 1 μL 용량으로 분주하여 효능을 시험한다. 분배 된 모든 양이 동일한지 확인하고 필요에 따라 인젝터 장치를 교체하십시오. 인젝터에서 남은 물을 모두 맑게 합니다.
5. 인큐베이터에서 단계 1 또는 단계 2에서 생성 된 번데기의 쟁반을 회수하고 알루미늄 호일 덮개를 제거하십시오.
6. 에탄올을 사용하여 무딘 하드 포셉 한 켤레를 청소하십시오. 흉부를 따라 개별 번데기를 부드럽게 잡고 복부에 내부 유체를 강요하기에 충분한 압력을 가하십시오. 이것은 tergite 분열을 더 분명하게 만들어야합니다.
7. 다중 피펫을 사용하여 바이러스 입자 용액 100 μL를 그려 세 번째와 네 번째 복부 테르기 사이에 바늘을 넣고 바이러스 용액 1 μL를 주입하십시오. 트레이에 배치 된 모든 번데기에 대해 반복하고, 반복적 인 주사를 피하도록주의하십시오. 이 과정에서 손상된 번데기는 버려야합니다.
   주의: 모든 바이러스 준비 관련 물질은 생물학적 위험으로 지정되어 있으며 제도적 지침에 따라 오토클레이브 및 폐기해야 합니다. 바늘은 또한 제도적 지침에 따라 폐기해야합니다.
8. 주입 된 번데기의 쟁반을 알루미늄 호일로 덮고 인큐베이터로 돌아갑니다. 바이러스 입자가 번데기 내에서 3-5 일 동안 번식하도록하십시오.
   1. 번데기에 대한 일일 검사를 수행하고 박테리아 또는 곰팡이 축적을 방지하기 위해 죽거나 썩은 표본을 제거하십시오. melanization의 작은 지점은 복부의 주사 부위에 나타날 수 있지만 생존에 영향을 미치지 않아야합니다.
9. 번데기를 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브 및 와류로 샘플링하여 내용물을 균질화하고, 번데기를 콜로니 소스에 의해 튜브로 샘플링하여 비표적 바이러스의 오염을 줄입니다. 번데기 전체가 남아 있지 않은지 확인하고 바이러스 입자 침전 및 농축이 준비될 때까지 튜브를 -80°C 냉동고로 옮깁니다.

4. 바이러스 입자 농도

참고: 이 프로토콜은 봉투 바이러스의 복구에 대해 테스트되지 않았습니다.

1. 사용하기 전에 모든 재료와 용기를 오토클레이브하십시오. 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 눈 보호는이 전체 과정에서 착용해야합니다. 시작하기 전에 표백제, 에탄올 및 RNase 불활성화 용액을 사용하여 모든 작업 표면을 멸균하십시오.
   1. 1x TES (Tris-EDTA-salt) 완충액을 준비하십시오: 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA 및 150 mM NaCl을 혼합한다. 오토클레이빙으로 살균하십시오.
2. 균질화 된 번데기를 해동하고 원심 분리기 병으로 옮깁니다. 약 3 부피의 1x PBS를 첨가하고 (예를 들어, 1x PBS의 150 mL에 번데기의 전체 50 mL 튜브를 추가) 부피를 가장 완전한 병의 부피와 균등하게하십시오.
3. 먼저 손으로 섞은 다음 실온에서 10 분 동안 궤도 쉐이커에 올려 놓습니다.
4. 4°C에서 5분 동안 15,000 x g 의 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 세포 파편이 남아있는 경우 필요에 따라이 단계를 반복하십시오.
   1. 상청액이 표면에 떠있는 큰 지방 소구가있는 경우 진행하기 전에 치즈 천을 통해 별도의 멸균 원심 분리기 병으로 여과하십시오.
5. 상청액을 0.3 부피의 24:1 클로로포름:이소아밀 알코올 용액(예를 들어, 상등액 190 mL + 클로로포름:이소아밀 알코올 57 mL)으로 추출하고 역전시켜 혼합한다. 4°C에서 21,000 x g 에서 20분 동안 원심분리한다.
   주의: 피부나 눈의 클로로포름과 직접 접촉하지 마십시오. 항상 적절한 PPE를 착용하십시오. 모든 클로로포름 폐기물은 제도적 지침에 따라 폐기해야 합니다.
6. 상청액을 얼음 욕조 또는 4°C 냉장실에서 별도의 멸균 500 mL 비커로 디캔팅하여 각 병으로부터 수성상을 회수한다. 상층액을 클로로포름으로 오염시키지 않도록주의하십시오.이 침전은 정화 과정을 더욱 어렵게 만듭니다. 약간의 수성상을 잃는 것이 좋습니다.
7. RNase 무함유 물을 첨가하여 각 비이커를 최대 200mL의 부피로 가져옵니다. 비커를 자석 교반 플레이트 위에 놓고 중간 크기의 교반 막대에 떨어 뜨립니다. 플레이트를 중간 낮은 설정에서 저어주도록 설정하십시오.
8. 일정한 온화한 교반 하에 각 비이커에 NaCl을 천천히 첨가하여, 각각을 2.3%의 최종 농도(예를 들어, 상청액 200 mL 당 4.6 g NaCl)까지 끌어올린다. 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG)을 최대 7%의 최종 농도까지 각각의 비이커에 첨가한다 (예를 들어, 상청액의 200 mL 당 14 g PEG).
9. 비커를 알루미늄 호일로 덮고 얼음 위에서 중간 저속으로 계속 저어 주거나 차가운 방에서 1-5 시간 동안 계속 저어 PEG를 용해시킵니다. 교반하는 데 더 많은 시간이 소요될수록, PEG는 더 철저하게 용해될 것이다.
10. 교반 플레이트를 끕니다. 덮인 비커를 얼음이나 차가운 방에서 1-3 일 동안 배양하여 바이러스 입자와 단백질이 침전 될 수 있도록하십시오. 배양하는 데 더 많은 시간이 소요될수록 더 많은 입자가 침전됩니다.
11. 각 비이커의 내용물을 별도의 깨끗한 원심분리 병에 옮기고 4°C에서 15,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 PEG 입자 펠렛을 회수하였다. 상층액을 버리십시오.
12. 병의 측면에서 PEG 입자 펠렛을 조심스럽게 긁어 내고 펠렛에 소량의 TES를 천천히 첨가하여 깨끗한 비커 내부의 최소 부피의 1x TES 버퍼에 재현탁하십시오 (원래 꿀벌 100 마리 당 약 10 mL).
13. 현탁된 펠렛을 2 mL 원심분리 튜브로 분취하기 전에 적어도 10회 이상 18 G 바늘을 통해 통과시킨다. 4.14가 될 때까지 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
14. 2 mL 튜브를 4°C에서 13,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 추가의 PEG를 제거하였다. 상층액을 1,000 μL 피펫을 사용하여 다른 2 mL 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리 단계를 반복하여 모든 PEG의 완전한 제거를 보장한다.
15. 상청액 내의 나머지 입자를 원심분리 필터 유닛(100 kDa 컷오프)을 사용하여 새로운 원심분리 튜브 내로 농축시키고, 14,000 x g 에서 10분 동안 실온에서 여러 라운드의 원심분리를 통해 각각 대략 1분의 1에 도달할 때까지 원래의 농도(약 2 mL의 농축된 입자에 대한 입자-TES 용액 10 mL)에 도달한다. 필터 장치는 크기가 다릅니다. 처리 중인 샘플 수에 가장 적합한 것을 선택합니다. 일반적으로 15mL 크기의 코니컬 튜브에 맞는 장치가 가장 적합합니다.
16. 농축된 입자를 26 G 피하 주사 바늘을 통과시켜 재현탁시키고, PEG 제거의 최종 라운드를 위해 5분 동안 RT에서 14,000 x g 에서 원심분리한다. 유체가 여전히 흐리면 모든 PEG 침전물이 제거 될 때까지 반복하십시오.
17. 점성 상청액을 원하는 양으로 분취하고, 사용 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관한다.

5. 바이러스 RNA 추출 및 정량화

1. 임의의 적절한 RNA 추출 방법(예를 들어, DNase 처리에 이어 TRIzol RNA 추출 시약)을 사용하여 전체 벌 또는 농축된 바이러스 입자로부터 RNA를 추출한다.
2. RT-qPCR을 통해 단계 5.1에서 생성된 접종물에서 바이러스 역가를 정량화하고, 바람직하게는 숙주 유전자 발현¹⁸에 의존하지 않는 표준 곡선 기반 방법을 사용하지만, 다른 방법도 추정을 허용할 수 있다.

6. 바이러스 먹이 생물 분석

1. 프레임 수집 단계 (6.2) 전 또는 24-hr 벌 출현 기간 (6.3) 동안 생물 검정에 필요한 모든 물질을 준비하십시오.
   1. 모든 피더 구멍을 적절한 크기의 원심분리 튜브에 꽂아 생물 분석에 필요한 꿀벌 수(예를 들어, 10.16cm x 10.16cm x 7.62cm를 측정하는 아크릴 박스 케이지)를 수용할 수 있는 깨끗한 케이지 또는 기타 인클로저를 준비합니다(그림 3). 케이지 사이에서 치료법을 결정하고 무작위 배정하고 나중에 쉽게 참조 할 수 있도록 지정된 치료법으로 각 치료법에 라벨을 붙입니다.
   2. 개별 중간 크기의 계량 보트에 해당 케이지 및 치료법을 표시하여 접종 트레이를 준비하십시오.
   3. 적절한 양의 수크로스를 탈이온수 (예를 들어, 30% 수크로오스 용액의 경우 물 1 L 당 수크로오스 300g)와 혼합하여 공급 용액을 준비하고, 수크로스를 첨가하기 전후에 물을 멸균한다. 멸균 수크로오스 용액은 4 °C 냉장고에 몇 주 동안 보관할 수 있지만 흐림이 나타나면 폐기해야합니다.
   4. 15mL 원심분리 튜브에 6.1.3에서 생산된 공급 용액을 부분적으로 채우고 뒤집은 다음 엄지 손가락으로 튜브 끝 주위에 1-2개의 구멍을 뚫어 피더 튜브를 준비합니다. 구멍은 또한 화염 위로 가열된 18G 피하 주사 바늘을 사용하여 녹일 수 있다. 느슨한 피팅 캡이 케이지 주민들을 하룻밤 사이에 익사시키는 느린 누출을 일으킬 수 있으므로 피더 튜브 캡이 매우 단단히 조여져 있는지 확인하십시오.
      참고: 급지 용액과 피더 튜브 부피는 실험적 요구에 맞게 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   5. 큰 욕조의 가장자리를 식물성 기름 또는 유사한 기름기 많은 물질로 가볍게 코팅하여 새로 출현 한 꿀벌을위한 수용가능한 컬렉션을 준비하십시오. 별도로 동일한 코팅 방법을 사용하여 여러 개의 작은 컵을 준비하십시오.
2. 적어도 세 개의 개별 두드러기에서 공급되는 eclosion의 직전에 꿀벌 새끼의 프레임을 선택하고 제거하십시오. 적절하게 숙성 된 꿀벌은 빗 세포 캡핑 아래에서 완전히 착색 된 성인과 유사합니다. 진행중인 출현의 확실한 징후는 세포 주민들이 천천히 씹어 내거나 왁스 캡핑을 따라 특징적인 들쭉날쭉한 씹는 자국이있는 세포를 최근에 비우는 것을 관찰하는 것입니다.
   참고 : 필요한 프레임의 정확한 양은 실험의 크기, 프레임 당 떠오르는 무리의 양 및 일년 중 시간에 따라 다릅니다. 표준 Langstroth 깊은 프레임에는 측면 당 ~ 3,000 개의 빗 셀이 포함되어 있습니다. 대부분 뚜껑을 덮은 번데기가 들어있는 프레임은 일부 관찰 된 출현으로 24 시간 안에 400 + 꿀벌을 쉽게 생산할 수 있습니다. 필요에 따라 시즌 내내 조정하십시오.
3. 프레임을 출현 상자에 넣고 하이브의 내부 조건 (34 ° C 및 50 % RH)과 일치하는 인큐베이터로 옮기기 전에 모든 성인 꿀벌을 털어 내십시오. 꿀벌이 24 시간 동안 나타나도록하십시오.
4. 인큐베이터에서 출현 상자를 제거하고 새로 출현 한 모든 꿀벌을 수집 욕조에 붓습니다. 출현 상자에서 모든 꿀벌을 제거하고 후속 칫솔질에 잘못 숙성 된 꿀벌이 포함되지 않도록하십시오. 날 수있는 모든 꿀벌은 24 시간 전> 나타 났으며 생물 분석에서 제외되어야합니다.
5. 개별 식민지의 벌집 유전 적 영향을 최소화하기 위해 수집 욕조에서 꿀벌을 손으로 부드럽게 혼합하여 새로 출현 한 꿀벌의 균질화 된 혼합물을 생산하십시오 (이 나이에 찌를 수 없음). 특정 적용의 경우, 콜로니 공급원에 대한 다른 배치가 바람직할 수 있다.
6. 35 마리의 꿀벌을 세어 내고 내용물을 아크릴 케이지로 옮기기 전에 각각을 동일한 기름칠한 컵에 넣으십시오. 대안으로, 오카운트 오류를 피하기 위해 더 작은 배수의 꿀벌을 여러 개의 기름칠한 컵(예를 들어, 각각 7마리의 꿀벌 5컵)으로 분리하는 것이 더 쉬울 수 있다. 사용 된 꿀벌의 수는 필요와 용도에 따라 달라질 수 있습니다.
7. 꿀벌의 새장을 인큐베이터 (34 ° C 및 50 % RH)로 옮기고 잠재적 인 미기후 영향을 최소화하기 위해 6.1.1에서 생성 된 무작위 배치 순서를 따르십시오.
8. 시작하기 전에 표백제, 에탄올 및 RNase 불활성화 용액으로 모든 표면과 피펫을 청소하여 바이러스 작업을위한 작업 공간을 준비하십시오. 바이러스 입자를 다룰 때마다 니트릴 장갑을 착용하십시오.
9. 적절한 양의 농축된 바이러스 입자를 해동시키고(단계 4.17) 멸균 용기 내에서 충분한 수크로오스 용액과 완전히 혼합하여(단계 6.1.3) 원하는 농도의 바이러스 접종물을 준비한다. 35 마리의 꿀벌 새장의 경우, 각각 600 μL의 접종이 필요합니다. 원하는 바이러스 농도가 0.1% 이하인 경우 연속 희석이 권장됩니다.
   1. 예를 들어, 1% 바이러스 접종이 필요한 40개의 케이지를 포함하는 실험에는 24mL의 바이러스 용액이 필요하며, 이는 240μL의 농축된 바이러스 입자와 23.76mL의 수크로오스 용액을 결합하여 만들 수 있습니다. 점성 액체로 인해 약간의 손실이 예상되므로 초기 볼륨에 약 15 % 초과분을 포함하는 것이 좋습니다.
10. 6.1.2에서 제조된 접종 트레이를 처리 유형별로 분류하고 적절한 접종물 600 μL를 피펫으로 각 트레이 상에 배치한다.
    1. 조심스럽게 접종 트레이를 해당 케이지에 삽입하여 실수로 꿀벌을 방출하지 않도록주의하십시오. 이 기회를 빌어 꿀벌을 스캔하고 이송 과정에서 사망 한 것을 교체하십시오.
11. 6.1.4에서 준비된 적절한 피더 튜브를 삽입하는 상부 피더 구멍을 막는 원심분리 튜브를 제거하기 전에 접종물의 완전한 소비 (약 12-14 시간)를 허용하십시오. 이것은 새장에있는 꿀벌이 인구 전체에 걸쳐 균등하게 접종물을 공유하도록하는 데 도움이됩니다. 수크로오스 용액은 Ad libitum 을 제공하며 튜브는 실험 과정 전반에 걸쳐 필요에 따라 다시 채워야합니다.
12. 각 실험의 처음 72 시간 동안 12 시간 간격으로 각 케이지 내의 사망률을 기록한 다음 기록을 24 h 간격으로 이동합니다. 새장에서 죽은 꿀벌을 제거하여 한 쌍의 포셉이 들어가서 죽은 꿀벌을 훔칠 수있을만큼 케이지 문을 밀어 넣어 미래의 카운트의 용이성을 높입니다. 바이러스 교차 오염을 방지하기 위해 케이지 사이의 알코올 램프를 통해 포셉을 살균하십시오.
13. 바이러스 역가 측정을위한 샘플 꿀벌 (5.1-5.2)은 각 케이지 내에서 살아있는 표본을 우연히 선택하고 드라이 아이스의 원심 분리 튜브에 배치합니다. 전형적으로, 세 마리의 꿀벌은 케이지를 채우지 않고 주어진 시점에서 바이러스 역가 측정을 생성하기에 충분합니다.
14. 필요한 기간 동안 정기적 인 사망률 측정을 계속하십시오.

결과

번데기 주사 및 바이러스 추출을위한 프로토콜 (그림 1)을 성공적으로 따르면 다량의 바이러스 입자가 생성되어야합니다. 그러나 여러 시점에서 다양한 콜로니에서 공급되는 번데기를 샘플링하고 주입하면 오염이 적은 표적 바이러스를 획득 할 가능성이 극대화됩니다. 꿀벌 내에서 바이러스가 복제되고 서로 상호 작용하는 역학은 잘 이해되지 않았습니다. 기존 감염의 가능성과 함?...

토론

여기에서는 유충 수집 및 바이러스 전파, 추출 및 농축뿐만 아니라 케이지 먹이 실험의 형태로 바이러스 처리를 포함하여 바이러스 증폭 및 접종 재고 준비 과정의 모든 단계를 자세히 설명하는 방법을 설명했습니다. 이러한 방법은 반순수 바이러스 입자의 생산을 허용하며(그림 4), 그 효과는 성인에게 치명적인 바이러스에 대한 용량-반응 사망률 테스트에 의해 일관되게 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375