Herstellung von virusangereichertem Inokulum zur oralen Infektion von Honigbienen (Apis mellifera)

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir zwei Protokolle: Erstens, um große Mengen von nicht umhüllten Viruspartikeln der Honigbiene zu vermehren, zu extrahieren, zu reinigen und zu quantifizieren, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Honigbienenpuppen, und zweitens, um die Auswirkungen einer Virusinfektion mit einem hochgradig wiederholbaren Käfigbioassay mit hohem Durchsatz zu testen.

Zusammenfassung

Honigbienen sind weltweit von großer ökologischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, unterliegen aber auch einer Vielzahl von Belastungen, die sich negativ auf die Bienengesundheit auswirken, einschließlich der Exposition gegenüber viralen Krankheitserregern. Solche Viren können eine Vielzahl von verheerenden Auswirkungen verursachen und können aufgrund mehrerer Faktoren, die es schwierig machen, die Auswirkungen experimenteller Behandlungen von einer bereits bestehenden Hintergrundinfektion zu trennen, oft schwierig zu untersuchen sein. Hier stellen wir eine Methode zur Massenproduktion großer Mengen von Viruspartikeln zusammen mit einem Hochdurchsatz-Bioassay vor, um Virusinfektionen und -effekte zu testen. Aufgrund des derzeitigen Fehlens einer kontinuierlichen, virusfreien Honigbienenzelllinie werden die Viruspartikel in vivo mit Honigbienenpuppen verstärkt, die mit einer minimal-stressigen Methodik in großen Mengen aus dem Bienenstock extrahiert werden. Diese Viruspartikel können dann in Bioassays für Honigbienenkäfige verwendet werden, um die Inokula-Lebensfähigkeit sowie verschiedene andere Virusinfektionsdynamiken zu testen, einschließlich Wechselwirkungen mit Ernährung, Pestiziden und anderen Krankheitserregern. Ein großer Vorteil der Verwendung solcher Partikel besteht darin, dass die Wahrscheinlichkeit, unbekannte Variablen in nachfolgende Experimente einzuführen, im Vergleich zu aktuellen Alternativen, wie z. B. einer Infektion über infizierte Bienenhämolymphe oder Homogenat, erheblich verringert wird, obwohl bei der Beschaffung der Bienen immer noch darauf geachtet werden sollte, die Kontamination mit Hintergrundviren zu minimieren. Die Käfigassays sind kein Ersatz für groß angelegte, feldrealistische Experimente, die die Auswirkungen von Virusinfektionen auf Kolonieebene testen, sondern dienen stattdessen als Methode zur Etablierung grundlegender viraler Reaktionen, die in Kombination mit den halbreinen Viruspartikeln als wichtige Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Dimensionen der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus dienen können.

Einleitung

Honigbienen (Apis mellifera) spielen eine entscheidende Rolle in der modernen globalen Agrarlandschaft, leiden aber derzeit unter einer Kombination aus biotischen und abiotischen Stressfaktoren, einschließlich Pestizidbelastung, schlechtem Futter, Parasiten und Krankheitserregern ^1,2. Einer der wichtigsten Krankheitserreger sind Viren, von denen viele von einem anderen der wichtigsten Honigbienenstressoren, der parasitären Varroa-Milbe (Varroa destructor), übertragen werden. Diese Viren können eine Reihe von negativen Auswirkungen bei Honigbienen verursachen, darunter ein vermindertes Brutüberleben, Entwicklungsdefekte und Lähmungen, die sowohl vor als auch nach Überwinterungsperioden zu einem totalen Bienenstockkollaps führen^können 3,4,5. Obwohl es vielversprechende Fortschritte bei der Entwicklung von Technologien zur Bekämpfung von Virusinfektionen gegeben hat 6,7,8,9, ist die Dynamik, durch die sich viele Viren innerhalb einer Honigbiene oder eines Honigvolkes ausbreiten, verbreiten und interagieren, immer noch wenig verstanden ^5,10 . Das Verständnis der grundlegenden Biologie von Honigbienen- und Virusinteraktionen und ihrer Beziehungen zu anderen Umweltfaktoren ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Virusmanagementtechniken.

Die Untersuchung von Honigbienen-Virus-Interaktionen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da zahlreiche bekannte und unbekannte Faktoren den Prozess erschweren. Dazu gehören Wechselwirkungen mit der Ernährung 11,12, die Pestizidbelastung 13 und der genetische Hintergrund^{der Bienen 14,15}. Selbst wenn man sich nur auf die Virusinfektion konzentriert, sind Komplikationen häufig, da Honigbienenpopulationen, sowohl verwaltete als auch wilde, immer ein gewisses Maß an Hintergrundvirusinfektion aufweisen, wenn auch oft ohne akute Symptome zu manifestieren^16,17, und die Auswirkungen der Viruskoinfektion sind nicht gut verstanden ¹⁸. Dies hat es schwierig gemacht, die Auswirkungen des Honigbienenvirus zu entwirren.

Viele Honigbienenvirusstudien haben Indizienvirusinfektionen verwendet, um nach Wechselwirkungen mit anderen Stressfaktoren zu suchen und zu beobachten, wie sich Hintergrundinfektionen mit anderen Behandlungen^{ändern 12,19,20,21}. Während dieser Ansatz erfolgreich bei der Identifizierung wichtiger Effekte war, insbesondere bei der Entdeckung, wie sich Pestizide oder diätetische Behandlungen auf das Virusniveau und die Replikation auswirken, ist die Inokulation mit einer Virusbehandlung mit bekanntem Inhalt und bekannter Konzentration entscheidend für experimentelle Tests der Virusinfektionsdynamik. Dennoch kann die Trennung der experimentellen Behandlung von der Hintergrundinfektion auch Herausforderungen mit sich bringen. In Feldstudien haben Forscher Stämme des deformierten Flügelvirus (DWV) differenziert, um Beweise für die Virusübertragung von Honigbienen auf Hummeln²² zu liefern, aber die Verwendung dieses Ansatzes wäre bei Honigbienen allein schwierig. Virusinfektiöse Klone sind ein leistungsfähiges Werkzeug, nicht nur für die Verfolgung von Infektionen 23,24,25, sondern auch für umgekehrte genetische Studien von Honigbienenviren und für die Virus-Wirt-Interaktionsforschung^26,27,28. In den meisten Fällen sind jedoch immer noch infektiöse Klone erforderlich, um den Infektionszyklus in Zellen zu erfüllen, um Partikel zu produzieren. Solche Partikel werden als Impfmittel für experimentelle Behandlungen bevorzugt, da ihre Infektiosität höher ist als die nackte virale RNA und die Impfung mit verkapselten Genomen eine natürliche Infektion nachahmt.

Die Produktion von reinen, nicht kontaminierten Honigbienenvirus-Inokula (Wildtyp-Virusstämme oder solche, die von infektiösen Klonen stammen) stellt ebenfalls eine Herausforderung dar. Diese sind in erster Linie auf die Schwierigkeiten zurückzuführen, eine zuverlässige, kontinuierlich replizierende, virusfreie Honigbienenzelllinie zur Herstellung von Reinstammviren zu erhalten^29,30. Während einige Zelllinien produziert wurden, bleiben diese Systeme unvollkommen; Dennoch besteht die Hoffnung, dass eine lebensfähige Zelllinie produziert werden^{kann 29}, die eine feinere Kontrolle der Virusproduktion und -untersuchung ermöglichen würde. Bis eine solche Linie allgemein verfügbar ist, werden die meisten Virenproduktionsprotokolle weiterhin auf die Verwendung von In-vivo-Virusproduktion und -reinigung angewiesen sein 18,31,32,33,34. Diese Ansätze beinhalten die Identifizierung und Reinigung von Viruspartikeln von Interesse (oder die Herstellung eines infektiösen Klons) und deren Verwendung zur Infektion von Honigbienen, normalerweise als Puppen. Die Puppen werden mit dem Zielvirus injiziert und dann geopfert, und weitere Partikel werden extrahiert und gereinigt. Da jedoch keine Bienen von vornherein virenfrei sind, gibt es immer ein gewisses Maß an Kontamination durch Spuren anderer Viren in einem solchen Konzentrat, und daher muss bei der Auswahl von Bienen mit einer geringen Wahrscheinlichkeit von Hintergrundinfektionen große Sorgfalt angewendet werden. Darüber hinaus sind Methoden zur Entfernung der Puppen aus den Kammzellen zur Verwendung in diesen Protokollen 33 sehr arbeitsintensiv und können Stress bei den Bienen auslösen, wodurch die Produktion auf diese Weise begrenzt^{wird 18,32}. Hier berichten wir über eine alternative Methode, die eine großflächige Entfernung von Larven mit wenig Arbeit und weniger mechanischer Belastung der Bienen ermöglicht.

Sobald Puppen erhalten und mit dem Startvirus-Inokulum injiziert wurden, müssen sie inkubiert werden, um dem Virus Zeit zu geben, sich zu replizieren. Anschließend können produzierte Viruspartikel zu einer Form verarbeitet werden, die zur Infektion experimenteller Bienen verwendet werden kann. Es gibt mehrere einfache Methoden, um dies zu erreichen, einschließlich der Verwendung eines rohen Homogenats 35,36 oder Hämolymph^, das von viral infizierten Bienen als Infektionsquelle erzeugt^{wird 37}. Diese Methoden sind effektiv, haben aber eine größere Chance, unbekannte Variablen aus dem Hintergrundsubstrat einzuführen (z. B. andere Faktoren in den toten Bienenhomogenaten). Darüber hinaus ist es wünschenswert, die Partikel zu konzentrieren, wenn ein Experiment eine große, bekannte Dosis eines Virus in kurzer Zeit erfordert. Daher ist es für eine bessere Kontrolle vorzuziehen, Methoden zu verwenden, die ein gewisses Maß an Reinigung und Konzentration der Viruspartikel ermöglichen. Im Allgemeinen führt eine Reihe von Fällungs- und Zentrifugationsschritten zur Entfernung fast aller möglichen Nichtzielvirenmaterialien³³.

Nach der Herstellung dieses konzentrierten Inokulums ist es vorteilhaft, die viralen Titer (qPCR) zu quantifizieren und mit In-vivo-Bioassays zu charakterisieren, um ihre Lebensfähigkeit und Fähigkeit, Mortalität zu verursachen, zu testen und zu bestätigen, dass nach der Infektion erhöhte Virustiter erhalten werden. Dies kann durch Injektionsexperimente (entweder in Puppen oder Erwachsene) oder Fütterungsexperimente (in Larven oder Erwachsene) erreicht werden. Während all diese Ansätze möglich sind, ist die Fütterung von Gruppen erwachsener Bienen in einem Käfig oft die schnellste und einfachste. Die Käfiguntersuchungsmethode wird auch häufig zum Testen verschiedener anderer Behandlungen an Bienen verwendet, einschließlich Pestizidtoxizität³⁸, Eierstockentwicklung³⁹ und Ernährungseinfluss auf das Verhalten 40,41 und kann daher eine gute Grundlage für Experimente bilden^, die eine Virusinfektion mit anderen Faktoren^{verbinden 42.}

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Herstellung großer Mengen halbreiner, hochangereicherter Viruspartikel ohne Verwendung einer teuren Ultrazentrifuge, einschließlich einer Methode zur Entfernung von Puppen, die den Arbeitsaufwand und die mechanische Belastung der Bienen reduziert, und eines hochgradig wiederholbaren Hochdurchsatz-Bioassays zum Testen von Virusinfektionen und -wirkungen. Durch die strenge Kontrolle der Reinheit der viralen Impfung sind die Forscher in der Lage, die Variation der Virusreaktion von Honigbienen im Vergleich zu anderen viralen Impfmethoden zu reduzieren. Darüber hinaus kann der Bioassay auf der Ebene kleiner Gruppen mit hochgradig wiederholbaren experimentellen Einheiten nach viralen Effekten suchen, bevor er auf feldrealistische Einstellungen skaliert wird, was weitaus arbeitsintensiver zu handhaben ist. In Kombination bieten diese beiden Methoden die notwendigen Werkzeuge für Studien, die dazu beitragen können, unser allgemeines Verständnis der physiologischen Wechselwirkungen zwischen Honigbiene und -Virus zu verbessern.

Protokoll

1. Massenbienenextraktionsoption 1: Selbstentfernung der Larven

1. Käfig einer Honigbienenkönigin auf einem leeren, langgezogenen Langstroth-Rahmen und bringen Sie sie in ihre Kolonie zurück. Lassen Sie die Königin 24 Stunden lang Eier auf diesen Rahmen legen.
   1. Überprüfen Sie den Rahmen nach 24 Stunden, um sicherzustellen, dass die meisten Kammzellen neu gelegte Eier enthalten. Je nach Königin und Kolonie werden Eier in den ersten 24 h manchmal nicht sehr gut gelegt. In diesem Fall sollten Sie zusätzliche 24 Stunden einplanen und die Zeit nach Bedarf anpassen.
2. Nach der 24-stündigen Eiablage die Königin freilassen. Markieren Sie den Rahmen deutlich und geben Sie ihn an die Kolonie zurück.
3. Genau 192 h (8 Tage) nach dem Einsperren der Königin (unter der Annahme einer normalen Eiablage innerhalb der ersten 24 h; 8 Tage markieren den Punkt direkt vor der Verpuppung), entfernen Sie den markierten Rahmen aus der Kolonie. Bürsten Sie alle erwachsenen Bienen ab und übertragen Sie den Rahmen in einen Inkubator, der den inneren Bedingungen eines Bienenstocks entspricht (34 °C und 50% relative Luftfeuchtigkeit (RH)).
   1. Stellen Sie sicher, dass der größte Teil des Rahmens mit Larven des 5. Stadiums gefüllt ist, die an ihren großen, weißen, C-förmigen Körpern zu erkennen sind, die fest gegen die unteren Kanten der Kammzellen gedrückt^werden. Es wird wahrscheinlich auch ein paar Zellen geben, die bereits von einer Wachskappe bedeckt sind, insbesondere in der Nähe der Mitte des Rahmens.
4. Bereiten Sie Behälter vor, die der Höhe und Breite des mit Larven gefüllten Rahmens entsprechen, um die Larven des 5. Stadiums aufzunehmen, indem Sie die inneren und äußeren Oberflächen gründlich mit Wasser und Seife^{reinigen, gefolgt} von einer Bleichlösung und schließlich Ethanol. Trocknen Sie den Behälter gründlich, bevor Sie fortfahren.
   1. Legen Sie den Boden der Behälter mit mehreren Schichten Papiertüchern aus. Fügen Sie dann mehrere überlappende Schichten dünnerer, saugfähiger Reinigungstücher (z. B. empfindliche Aufgabenwischer) oder Filterpapier hinzu. Das Material muss saugfähig sein. Vermeiden Sie es, die oberste Schicht zu überlappen, um den zukünftigen Larventransfer zu erleichtern.
5. Legen Sie die Rahmen mit der Vorderseite nach unten (mit fokalen Larven nach unten) auf die Behälter, damit die Larven auf die Schicht der Reinigungstücher fallen können.
   1. Decken Sie den Behälter und den Rahmen mit einem Zeltstück Aluminiumfolie oder einer anderen Abdeckung ab, um Feuchtigkeit zu speichern und das Setup in den Inkubator zurückzubringen. Verlassen Sie das Setup über Nacht. Die natürlichen Nahrungssuchtendenzen der Larven führen dazu, dass sie aus ihren Zellen kriechen und auf die gepolsterte Oberfläche darunter fallen.
6. Bereiten Sie separate Transferschalen vor, indem Sie sie gründlich mit den gleichen Schritten reinigen, die in 1.4 beschrieben sind. Lassen Sie die Tabletts trocknen und beschichten Sie den Boden mit Reinigungstüchern. Die Trays müssen keine spezifischen Abmessungen haben, aber flachere Trays ermöglichen einfachere Larvenmanipulationen.
   1. Beginnen Sie mit dem Transfer der Larven von den Behältern in die Schalen, indem Sie einzelne Tücher vorsichtig von der obersten Schicht in den Behältern abheben und die Larven vorsichtig auf die Tabletts gießen. Die Larven sollten über Nacht in die Behälter gefallen sein und mehrere klebrige Massen gebildet haben (Abbildung 1A).
   2. Verwenden Sie stumpfe weiche Pinzetten, um die Larven zu trennen und sie über die Oberfläche der Tabletts auszulegen. Sie müssen nicht gleichmäßig verteilt sein und können nahe beieinander liegen, sollten sich aber nicht berühren. Siehe Abbildung 1B für eine visuelle Darstellung von getrennten Larven.
   3. Nutzen Sie diese Gelegenheit, um beschädigte (verfärbte) oder unterdurchschnittlich große Larven zu entfernen. Diese sterben eher während des Reifungsprozesses ab und können Infektionen / Pilzwachstum in der gesamten Schale mit sich bringen.
7. Decken Sie das Tablett mit Zeltaluminiumfolie ab, um Feuchtigkeit zu speichern und das Setup in den Inkubator zurückzubringen.
8. Überprüfen Sie die Larven täglich und entfernen Sie alle, die verfärbt sind (dunkelbraun oder schwarz).
   HINWEIS: Die Larven / Vorpuppen defäkieren auf den Reinigungstüchern und manifestieren sich als kleine braune Flecken. Sie können auch kleine Mengen von weißem, dünnem Gurtband als Teil ihres Verschließprozesses produzieren. Keines dieser Ereignisse erfordert den Austausch der Reinigungstücher, solange sie saugfähig sind.
9. Erlauben Sie Larven, sich zu verpuppen und zum Brillenaugenstadium zu reifen, das durch ihre allgemeine Form identifiziert werden kann, die der einer erwachsenen Biene entspricht, während ihnen immer noch die Pigmentierung in ihren Augen und dem größten Teil des restlichen Körpers fehlt. Dies sollte zwischen 14 und 15 Tagen nach dem Königskäfig geschehen. Die Puppen sind jetzt bereit für die Virusinjektion. Abbildung 1 C, 1D für Beispiele von Brillenaugenpuppen.

2. Massenbienenextraktion Option 2: manuelle Puppenexzision

HINWEIS: Obwohl Option 2 (Puppenexzision) eine praktikable Methode der Bienenextraktion ist, weist sie im Vergleich zu Option 1 (Larvenselbstentfernung) auch mehrere Nachteile auf. Option 2 ist weitaus arbeitsintensiver, schwerer zu kontrollieren für das Puppenalter und im Allgemeinen stressiger für die Bienen selbst. Option 1 wird nach Möglichkeit empfohlen.

1. Wählen Sie aus einer geeigneten Kolonie einen Rahmen aus Honigbienenbrut mit Kappe, der Puppen im oder in der Nähe des Brillenaugenstadiums enthält (Beschreibung siehe 1.9). Entfernen Sie die Verschließung von Kammzellen, die sich in der Nähe der Mitte und der Kanten des Rahmens befinden, um das Vorhandensein des entsprechenden Entwicklungsstadiums zu bestätigen.
2. Überführen Sie den Rahmen in einen Inkubator, der auf 34 °C und 50 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Geben Sie den Rahmen immer wieder in den Inkubator zurück, wenn er nicht sofort verwendet wird.
3. Transferschalen, die mit den in 1.6 beschriebenen identisch sind, vorbereiten und reinigen.
4. Entfernen Sie den Rahmen aus dem Inkubator und setzen Sie ihn auf einen abgewinkelten Ständer unter einer Lichtquelle. Befeuchten Sie einen kleinen Stapel Papierhandtücher mit Wasser.
5. Reinigen Sie ein Paar stumpfe harte Pinzetten mit Ethanol. Entfernen Sie mit der sauberen Pinzette die Kappe von den Zellen, die Brillenpuppen enthalten, und achten Sie darauf, die Puppen dabei nicht zu beschädigen.
6. Einer nach dem anderen entfernen Sie die Puppen vorsichtig aus den Kammzellen. Am sichersten ist es, die Puppen um Thorax und Bauch mit den Zangenspitzen zu greifen, wenn genügend Platz vorhanden ist. Wenn nicht, können Puppen jedoch auch entfernt werden, indem man den Kopf ergreift und langsam weit genug herauswackelt, um dann um den Körper gegriffen zu werden.
   1. Decken Sie die Teile des Rahmens, auf die nicht sofort zugegriffen werden kann, mit nassen Papiertüchern ab, um Feuchtigkeit zu speichern. Entfernen und ersetzen Sie es bei Bedarf während des Exzisionsprozesses.
7. Platzieren Sie die ausgeschnittenen Puppen entlang der Reinigungstücher in den Transferschalen und stellen Sie sicher, dass sich keine von ihnen berührt. Alle entstellten oder verfärbten Puppen sollten verworfen werden. Puppen sind jetzt bereit für die Virusinjektion.
   1. Entsorgen Sie Puppen, die bei Kontakt mit den Tüchern Flüssigkeit freisetzen; sie wurden wahrscheinlich durchstochen. Manchmal zeigen Puppen kleine dunkle Melanisierungsflecken in der Nähe der Kontaktpunkte mit der Pinzette innerhalb von 1 Stunde nach dem Entfernen. Dies sollte das Überleben nicht beeinträchtigen. Wenn große Melanisierungsflecken auftreten, sollten die betroffenen Puppen verworfen werden.

3. Injektion des Pupalvirus

HINWEIS: Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal durchführen (d. H. Ohne vorherige virale Inokula-Bestände), extrahieren und konzentrieren Sie zuerst Partikel mit Erwachsenen, Puppen oder Larven aus einer Kolonie mit Verdacht auf eine Infektion. Messen Sie die viralen Titer in der resultierenden Impfung, wie in Schritt 5 beschrieben, und bestimmen Sie, welche Partikel sich weiter ausbreiten sollen.

1. Sterilisieren Sie alle Arbeitsflächen mit Bleichwasser und Ethanol, bevor Sie mit der Arbeit mit Honigbienenviren beginnen. Nitrilhandschuhe sollten während des gesamten Prozesses getragen werden.
2. Bereiten Sie eine Injektorvorrichtung vor, die in der Lage ist, Flüssigkeit in ~ 1 μL-Mengen zu injizieren.
   HINWEIS: Ein kostengünstiger, aber effektiver Ansatz wäre die Herstellung eines handgefertigten Geräts, indem eine 30-G-Injektionsnadel mit flexiblem Epoxidharz oder einem anderen flüssigen Klebstoff an der Spitze einer 100-μL-Multi-Dispenser-Spitze (siehe Materialtabelle) befestigt wird. Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Nadelkappe fest gegen die Multi-Dispenser-Spitze abgedichtet sind und lassen Sie das Gerät trocknen. Siehe Abbildung 2 für eine visuelle Darstellung einer Beispiel-Injektorvorrichtung.
3. Bereiten Sie eine Virusinjektionsverdünnungslösung vor, indem Sie die gewünschte Art von Viruspartikeln mit sterilisiertem 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen mischen. Die benötigte Gesamtmenge hängt von der Anzahl der Puppen ab, die injiziert werden müssen, wobei jede Puppe eine Injektion von 1 μL erfordert (z. B. 500 Puppen = 5 μL Viruspartikel + 495 μL PBS).
4. Befestigen Sie die Injektorvorrichtung an einer manuellen Multipipette und testen Sie die Wirksamkeit, indem Sie 100 μL Wasser aus einem separaten Becherglas entnehmen und in 1 μL-Dosen dosieren. Stellen Sie sicher, dass jede abgegebene Menge gleich ist, und tauschen Sie die Injektorvorrichtung bei Bedarf aus. Entfernen Sie das restliche Wasser aus dem Injektor.
5. Holen Sie sich die Schalen mit Puppen, die in Schritt 1 oder Schritt 2 erzeugt wurden, aus dem Inkubator und entfernen Sie die Aluminiumfolienabdeckung.
6. Reinigen Sie ein Paar stumpfe harte Pinzetten mit Ethanol. Greifen Sie die einzelne Puppe sanft entlang des Thorax und üben Sie gerade genug Druck aus, um innere Flüssigkeiten in den Bauch zu zwingen. Dies sollte die tergitischen Spaltungen deutlicher machen.
7. Ziehen Sie 100 μL der Viruspartikellösung mit der Multipipette auf, führen Sie die Nadel zwischen dem dritten und vierten Bauchtergiten ein und injizieren Sie 1 μL der Viruslösung. Wiederholen Sie dies für jede Puppe, die auf den Tabletts ausgelegt ist, und achten Sie darauf, wiederholte Injektionen zu vermeiden. Alle Puppen, die während des Prozesses beschädigt wurden, sollten verworfen werden.
   ACHTUNG: Alle Materialien im Zusammenhang mit der Viruszubereitung werden als Biogefahren eingestuft und sollten gemäß den institutionellen Richtlinien autoklaviert und entsorgt werden. Nadeln sollten auch nach institutionellen Richtlinien entsorgt werden.
8. Bedecken Sie die Tabletts mit injizierten Puppen mit Aluminiumfolie und kehren Sie zum Inkubator zurück. Lassen Sie die Viruspartikel 3-5 Tage lang in den Puppen vermehren.
   1. Führen Sie tägliche Inspektionen an den Puppen durch und entfernen Sie alle toten oder verrottenden Proben, um Bakterien oder Pilzansammlungen zu verhindern. Kleine Melanisierungspunkte können an der Injektionsstelle am Bauch auftreten, sollten aber das Überleben nicht beeinträchtigen.
9. Probieren Sie die Puppen in 50 ml konische Zentrifugenröhrchen und Wirbel, um den Inhalt zu homogenisieren, und achten Sie darauf, Puppen nach Koloniequelle in Röhrchen zu entnehmen, um die Kontamination durch Nichtzielviren zu reduzieren. Stellen Sie sicher, dass keine ganzen Puppen verbleiben und geben Sie die Röhrchen in einen Gefrierschrank von -80 ° C, bis sie für die Ausfällung und Konzentration von Viruspartikeln bereit sind.

4. Konzentration der Viruspartikel

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde nicht für die Wiederherstellung von behüllten Viren getestet.

1. Autoklavieren Sie alle Materialien und Behälter vor der Verwendung. Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Augenschutz sollten während dieses gesamten Prozesses getragen werden. Sterilisieren Sie alle Arbeitsflächen mit Bleichwasser, Ethanol und RNase-Inaktivierungslösung, bevor Sie beginnen.
   1. Bereiten Sie 1x TES (Tris-EDTA-Salz) Puffer vor: Mischen Sie 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA und 150 mM NaCl. Sterilisieren durch Autoklavieren.
2. Homogenisierte Puppen auftauen und in Zentrifugenflaschen überführen. Fügen Sie ungefähr drei Volumina von 1x PBS hinzu (z. B. fügen Sie eine volle 50 ml Tube Puppen zu 150 ml 1x PBS hinzu) und gleichen Sie das Volumen dem der vollsten Flasche an.
3. Zuerst von Hand mischen und dann auf einen Orbitalschüttler bei Raumtemperatur für 10 min legen.
4. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g bei 4 °C für 5 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf, wenn zelluläre Trümmer übrig bleiben.
   1. Wenn der Überstand große Fettkügelchen an der Oberfläche treibt, filtern Sie durch ein Käsetuch in separate sterile Zentrifugenflaschen, bevor Sie fortfahren.
5. Extrahieren Sie den Überstand mit 0,3 Volumen 24:1 Chloroform:Isoamylalkohollösung (z. B. 190 ml Überstand + 57 ml Chloroform:Isoamylalkohol) und mischen Sie ihn durch Inversion. Zentrifuge bei 21.000 x g bei 4 °C für 20 min.
   ACHTUNG: Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Chloroform auf der Haut oder den Augen. Tragen Sie immer die richtige PSA. Alle Chloroform-Abfälle sollten gemäß den institutionellen Leitlinien entsorgt werden.
6. Holen Sie sich die wässrige Phase aus jeder Flasche zurück, indem Sie den Überstand in separate sterile 500-ml-Bechergläser in einem Eisbad oder in einem 4 ° C-Kühlraum umfüllen. Achten Sie darauf, den Überstand nicht mit Chloroform zu kontaminieren, da dies den Reinigungsprozess erschwert. Es ist besser, ein wenig wässrige Phase zu verlieren.
7. Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um jedes Becherglas auf ein Volumen von 200 ml zu bringen. Legen Sie die Bechergläser auf magnetische Rührplatten und lassen Sie sie in eine mittelgroße Rührstange fallen. Stellen Sie die Platten so ein, dass sie bei einer mittleren bis niedrigen Einstellung rühren.
8. Langsam NaCl unter ständigem sanftem Rühren in jedes Becherglas geben, wodurch jeder auf eine Endkonzentration von 2,3% (z. B. 4,6 g NaCl pro 200 ml Überstand) gebracht wird. Polyethylenglykol 8000 (PEG) bis zu einer Endkonzentration von 7% (z. B. 14 g PEG pro 200 ml Überstand) in jedes Becherglas geben.
9. Die Bechergläser mit Alufolie abdecken und mit mittlerer bis niedriger Geschwindigkeit auf Eis oder in einem Kühlraum 1-5 h weiter rühren, um den PEG aufzulösen. Je mehr Zeit für das Rühren aufgewendet wird, desto gründlicher löst sich das PEG auf.
10. Schalten Sie die Rührplatten aus. Bechergläser 1-3 Tage auf Eis oder in einem Kühlraum ausbrüten, damit Viruspartikel und Proteine ausfallen können. Je mehr Zeit für die Inkubation aufgewendet wird, desto mehr Partikel fallen aus.
11. Überführen Sie den Inhalt jedes Becherglases in separate saubere Zentrifugenflaschen und zentrifugieren Sie bei 15.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten, um ein PEG-Partikelpellet zu gewinnen. Verwerfen Sie den Überstand.
12. Schaben Sie das PEG-Partikelpellet vorsichtig von den Seiten der Flasche und suspendieren Sie es in minimalen Mengen von 1x TES-Puffer in sauberen Bechergläsern, indem Sie langsam kleine Mengen TES zu den Pellets geben (ca. 10 ml pro 100 Originalbienen).
13. Führen Sie das suspendierte Pellet mindestens zehnmal durch eine 18-G-Nadel, bevor es in 2-ml-Zentrifugenröhrchen aliquotiert wird. Halten Sie alle Röhren auf Eis, bis Sie für 4.14 bereit sind.
14. Zentrifen Sie 2 ml-Röhrchen bei 13.000 x g bei 4 °C für 15 Minuten, um zusätzliche PEG zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand mit einer 1.000-μL-Pipette in ein weiteres 2-ml-Zentrifugenröhrchen und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, um eine vollständige Entfernung aller PEGs sicherzustellen.
15. Konzentrieren Sie die verbleibenden Partikel innerhalb des Überstands in neuen Zentrifugenröhrchen mit Zentrifugalfiltereinheiten (100 kDa-Grenzwert) über mehrere Runden der Zentrifugation bei 14.000 x g bei Raumtemperatur (RT) für jeweils 10 Minuten, bis etwa ein Fünftel der ursprünglichen Konzentration erreicht wird (10 ml Partikel-TES-Lösung auf etwa 2 ml konzentrierte Partikel). Die Filtereinheiten gibt es in verschiedenen Größen; Wählen Sie die für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben am besten geeigneten aus. Die Einheiten, die in 15 ml-große konische Rohre passen, sind in der Regel am besten geeignet.
16. Resuspendieren Sie die konzentrierten Partikel, indem Sie eine 26 g Injektionsnadel und eine Zentrifuge bei 14.000 x g bei RT für 5 Minuten für eine letzte Runde der PEG-Entfernung passieren. Wenn die Flüssigkeit noch trüb ist, wiederholen Sie den Vorgang, bis alle PEG-Ausfällungen entfernt sind.
17. Aliquot den viskosen Überstand in die gewünschten Mengen bringen und bei -80 °C lagern, bis er gebrauchsfertig ist.

5. Virus-RNA-Extraktion und -Quantifizierung

1. Extrahieren Sie RNA aus ganzen Bienen oder konzentrierten Viruspartikeln mit einer geeigneten RNA-Extraktionsmethode (z. B. TRIzol RNA-Extraktionsreagenz, gefolgt von einer DNase-Behandlung).
2. Quantifizierung von Virustitern im Inokulum, die in Schritt 5.1 über RT-qPCR erzeugt wurden, vorzugsweise unter Verwendung einer standardkurvenbasierten Methode, die nicht auf der Expression des Wirtsgens¹⁸ beruht, obwohl andere Methoden auch Schätzungen zulassen können.

6. Bioassay zur Virusfütterung

1. Bereiten Sie alle notwendigen Materialien für den Bioassay vor dem Rahmensammelschritt (6.2) oder während der 24-stündigen Bienenentstehungsphase (6.3) vor.
   1. Bereiten Sie saubere Käfige oder andere Gehäuse vor, in denen die für den Bioassay erforderliche Anzahl von Bienen untergebracht werden kann (z. B. Acrylboxkäfige mit den Maßen 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm), indem Sie alle Zuführlöcher mit einem entsprechend großen Zentrifugenröhrchen verstopfen (Abbildung 3). Bestimmen und randomisieren Sie Behandlungen unter den Käfigen und kennzeichnen Sie jede mit ihrer vorgesehenen Behandlung für eine einfache zukünftige Referenz.
   2. Bereiten Sie Inokulumschalen vor, indem Sie einzelne mittelgroße Wägeboote mit dem entsprechenden Käfig und der entsprechenden Behandlung beschriften.
   3. Bereiten Sie die Fütterungslösung vor, indem Sie die entsprechende Menge Saccharose mit deionisiertem Wasser mischen (z. B. 300 g Saccharose pro 1 l Wasser für eine 30% ige Saccharoselösung), wobei Sie darauf achten, das Wasser vor und nach der Zugabe von Saccharose zu sterilisieren. Sterile Saccharoselösung kann mehrere Wochen in einem 4 °C Kühlschrank gelagert werden, sollte aber entsorgt werden, wenn Trübungen auftreten.
   4. Bereiten Sie die Zuführröhrchen vor, indem Sie 15 ml Zentrifugenröhrchen teilweise mit den in 6.1.3 hergestellten Zuführlösungen füllen, umkehren und 1-2 Löcher mit einer Reißnäcke um die Spitze des Röhrchens stochern. Löcher können auch mit einer 18G Injektionsnadel geschmolzen werden, die über einer Flamme erhitzt wird. Stellen Sie sicher, dass die Halterohrkappen sehr fest verschraubt sind, da lose sitzende Kappen langsame Leckagen verursachen können, die die Käfigbewohner über Nacht ertrinken lassen.
      HINWEIS: Fütterungslösungen und das Volumen des Feederrohrs können bei Bedarf an die experimentellen Anforderungen angepasst werden.
   5. Bereiten Sie eine Sammlung vor, die für neu entstandene Bienen empfänglich ist, indem Sie die Ränder einer großen Wanne leicht mit Pflanzenöl oder einer ähnlichen fettigen Substanz beschichten. Bereiten Sie separat mehrere kleine Becher mit der gleichen Beschichtungsmethode vor.
2. Wählen und entfernen Sie Rahmen von Honigbienenbrut am Rande der Eklosion, die aus mindestens drei separaten Bienenstöcken stammen. Entsprechend gealterte Bienen ähneln voll pigmentierten Erwachsenen unter der Kammzellkappe. Ein sicheres Zeichen für das anhaltende Auftauchen ist die Beobachtung von Zellbewohnern, die sich langsam ihren Weg herauskauen und / oder kürzlich entleerte Zellen mit charakteristischen gezackten Kauspuren entlang der Wachskappe.
   HINWEIS: Die genaue Anzahl der erforderlichen Frames hängt von der Größe des Experiments, der Menge der entstehenden Brut pro Frame und der Jahreszeit ab. Ein Standard-Langstroth Tiefenrahmen enthält ~3.000 Kammzellen pro Seite; Ein Rahmen, der hauptsächlich gekappte Puppen enthält, wobei einige beobachtet werden, kann leicht 400 + Bienen in 24 h produzieren. Passen Sie sich während der gesamten Saison nach Bedarf an.
3. Bürsten Sie alle erwachsenen Bienen ab, bevor Sie die Rahmen in Auflaufkästen legen und sie in einen Inkubator überführen, der den inneren Bedingungen eines Bienenstocks entspricht (34 ° C und 50% RH). Lassen Sie Bienen für 24 Stunden auftauchen.
4. Entfernen Sie die Auslaufboxen aus dem Inkubator und bürsten Sie alle neu entstandenen Bienen in die Sammelwanne. Stellen Sie sicher, dass Sie auch alle Bienen aus den Auslaufkästen entfernen, um zu verhindern, dass falsch gealterte Bienen in nachfolgende Bürsten einbezogen werden. Jede Biene, die fliegen kann, ist vor 24 Stunden > aufgetaucht und sollte vom Bioassay ausgeschlossen werden.
5. Produzieren Sie eine homogenisierte Mischung aus neu entstandenen Bienen, indem Sie die Bienen in der Sammelwanne vorsichtig von Hand mischen (sie können in diesem Alter nicht stechen), um die genetischen Auswirkungen eines einzelnen Volkes zu minimieren. Für spezifische Anwendungen können andere Vorkehrungen für die Koloniequelle wünschenswert sein.
6. Zählen Sie 35 einzelne Bienen aus und legen Sie jede in den gleichen gefetteten Becher, bevor Sie den Inhalt in einen Acrylkäfig geben. Alternativ kann es einfacher sein, kleinere Vielfache von Bienen in mehrere gefettete Becher (z. B. 5 Tassen mit jeweils 7 Bienen) zu trennen, um Fehlzählungsfehler zu vermeiden. Die Anzahl der verwendeten Bienen kann je nach Bedarf und Anwendung variiert werden.
7. Überführen Sie die Bienenkäfige in einen Inkubator (34 °C und 50% RH) und achten Sie darauf, die in 6.1.1 erstellte zufällige Platzierungsreihenfolge einzuhalten, um mögliche Auswirkungen auf das Mikroklima zu minimieren.
8. Bereiten Sie den Arbeitsbereich auf Virusarbeiten vor, indem Sie alle Oberflächen und Pipetten mit Bleichwasser, Ethanol und RNase-Inaktivierungslösung reinigen, bevor Sie beginnen. Achten Sie darauf, Nitrilhandschuhe zu tragen, wenn Sie mit Viruspartikeln umgehen.
9. Das Virusinokulum in der gewünschten Konzentration wird hergestellt, indem eine geeignete Menge konzentrierter Viruspartikel aufgetaut (Schritt 4.17) und gründlich mit ausreichend Saccharoselösung (Schritt 6.1.3) in einem sterilen Behälter gemischt wird. Für Käfige mit 35 Bienen benötigt jeder 600 μL Inokulum. Serielle Verdünnungen werden empfohlen, wenn die gewünschte Viruskonzentration bei oder unter 0,1% liegt.
   1. Zum Beispiel erfordert ein Experiment mit 40 Käfigen, die alle ein 1% iges Virusinokulum benötigen, 24 ml Viruslösung, die durch Kombination von 240 μL konzentrierter Viruspartikel mit 23,76 ml Saccharoselösung erzeugt werden kann. Es wird empfohlen, etwa 15% Überschreitung in das Anfangsvolumen einzubeziehen, da bei viskosen Flüssigkeiten mit einigen Verlusten zu rechnen ist.
10. Die in 6.1.2 hergestellten Impfschalen werden nach Behandlungsart sortiert ausgelegt und 600 μL des entsprechenden Impfstoffs auf jede Schale pipettiert.
    1. Setzen Sie die Impfschalen vorsichtig in die entsprechenden Käfige ein und achten Sie darauf, dass Sie nicht versehentlich Bienen freisetzen. Nutzen Sie diese Gelegenheit, um die Bienen zu scannen und diejenigen zu ersetzen, die möglicherweise im Transferprozess gestorben sind.
11. Der Verzehr des Impfstoffs ist vollständig (ca. 12-14 h) zu ermöglichen, bevor die Zentrifugenröhrchen, die das obere Zuführloch blockieren, entfernt werden, wobei die entsprechenden Dosierröhrchen nach 6.1.4 eingeführt werden. Dies trägt dazu bei, dass die Bienen im Käfig das Inokulum gleichmäßig über die Population verteilen. Saccharoselösung wird ad libitum bereitgestellt und die Röhrchen sollten im Laufe des Experiments bei Bedarf nachgefüllt werden.
12. Zeichnen Sie die Mortalität in jedem Käfig in 12-Stunden-Intervallen für die ersten 72 Stunden jedes Experiments auf, woraufhin die Aufzeichnung auf 24-Stunden-Intervalle verschoben wird. Entfernen Sie tote Bienen aus den Käfigen, um die zukünftige Zählung zu erleichtern, indem Sie die Käfigtür gerade weit genug nach oben schieben, damit eine Pinzette nach innen greifen und tote Bienen ausschöpfen kann. Achten Sie darauf, die Pinzette über einer Alkohollampe zwischen den Käfigen zu sterilisieren, um eine virale Kreuzkontamination zu verhindern.
13. Proben Sie Bienen für virale Titermessungen (5.1-5.2), indem Sie willkürlich lebende Proben in jedem Käfig auswählen und in Zentrifugenröhrchen auf Trockeneis legen. Typischerweise reichen drei Bienen aus, um zu einem bestimmten Zeitpunkt virale Titermessungen durchzuführen, ohne auch den Käfig zu entvölkern.
14. Setzen Sie regelmäßige Mortalitätsmessungen so lange wie nötig fort.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Befolgung der Protokolle (Abbildungen 1) für die Puppeninjektion und die Virusextraktion sollte große Mengen an Viruspartikeln erzeugen. Die Probenahme und Injektion von Puppen, die zu mehreren Zeitpunkten aus einer Vielzahl von Kolonien stammen, maximiert jedoch die Chancen, Zielviren mit geringer Kontamination zu erwerben. Die Dynamik, durch die sich Viren innerhalb einer Honigbiene replizieren und miteinander interagieren, ist nicht gut verstanden; In Verbindung mit der Wahrscheinli...

Diskussion

Hier haben wir Methoden beschrieben, die jeden Schritt der Virusamplifikation und des Impfbestandsvorbereitungsprozesses detailliert beschreiben, einschließlich der Larvensammlung und Virusvermehrung, -extraktion und -konzentration sowie der Virusbehandlung in Form von Käfigfütterungsexperimenten. Diese Methoden ermöglichen die Herstellung von halbreinen Viruspartikeln (Abbildung 4), deren Wirksamkeit durch Dosis-Wirkungs-Mortalitätstests für Viren, die für Erwachsene tödlich sind, k...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375