Приготовление обогащенного вирусом инокулята при оральной инфекции медоносных пчел (Apis mellifera)

Резюме

Здесь мы описываем два протокола: во-первых, для размножения, извлечения, очистки и количественной оценки большого количества частиц вируса медоносной пчелы без оболочки, включая метод удаления куколок медоносной пчелы, а во-вторых, для проверки последствий вирусной инфекции с использованием высоковоспроизводимого биоанализа в клетке с высокой пропускной способностью.

Аннотация

Медоносные пчелы имеют большое экологическое и сельскохозяйственное значение во всем мире, но также подвергаются различным нагрузкам, которые негативно влияют на здоровье пчел, включая воздействие вирусных патогенов. Такие вирусы могут вызывать широкий спектр разрушительных последствий и часто могут быть сложными для изучения из-за множества факторов, которые затрудняют отделение эффектов экспериментального лечения от ранее существовавшей фоновой инфекции. Здесь мы представляем метод массового производства больших количеств вирусных частиц вместе с высокопроизводительным биоанализом для проверки вирусной инфекции и эффектов. В связи с нынешним отсутствием непрерывной, свободной от вирусов клеточной линии медоносных пчел вирусные частицы усиливаются in vivo с использованием куколок медоносных пчел, которые извлекаются из улья в больших объемах с использованием минимально стрессовой методологии. Эти вирусные частицы затем могут быть использованы в биоанализах в клетке медоносных пчел для проверки жизнеспособности инокулы, а также различных других динамик вирусной инфекции, включая взаимодействие с питанием, пестицидами и другими патогенами. Основным преимуществом использования таких частиц является то, что это значительно снижает шансы на введение неизвестных переменных в последующих экспериментах по сравнению с текущими альтернативами, такими как заражение через инфицированную пчелиную гемолимфу или гомогенат, хотя при поиске пчел все же следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму фоновое заражение вирусом. Клеточные анализы не заменяют крупномасштабные, реалистичные полевые эксперименты, проверяющие эффекты вирусной инфекции на уровне колонии, а вместо этого функционируют как метод установления базовых вирусных реакций, которые в сочетании с получистыми вирусными частицами могут служить важными инструментами для изучения различных измерений физиологических взаимодействий медоносных пчел и вирусов.

Введение

Медоносные пчелы (Apis mellifera) играют решающую роль в современном глобальном сельскохозяйственном ландшафте, но в настоящее время страдают от комбинации биотических и абиотических стрессоров, включая воздействие пестицидов, плохой корм, паразитов и патогенов ^1,2. Одним из наиболее важных патогенов, вызывающих озабоченность, являются вирусы, многие из которых переносятся другим из основных стрессоров медоносных пчел, паразитическим клещом Варроа (Деструктор Варроа). Эти вирусы могут вызывать множество негативных эффектов у медоносных пчел, включая снижение выживаемости расплода, дефекты развития и паралич, которые могут привести к полному разрушению улья как до, так и после периодов зимовки ^3,4,5. Хотя были достигнуты многообещающие успехи в разработке технологий, используемых для борьбы с вирусной инфекцией ^6,7,8,9, динамика, с помощью которой многие вирусы размножаются, распространяются и взаимодействуют внутри медоносной пчелы или колонии, все еще плохо изучена ^5,10 . Понимание базовой биологии взаимодействия медоносных пчел и вирусов и их взаимосвязей с другими факторами окружающей среды имеет решающее значение для разработки эффективных методов борьбы с вирусами.

Тем не менее, изучение взаимодействия медоносных пчел и вирусов создает проблемы с многочисленными известными и неизвестными факторами, усложняющими процесс. К ним относятся взаимодействия с диетой^11,12, воздействие пестицидов¹³ и генетический фон пчел^14,15. Даже если сосредоточиться только на вирусной инфекции, осложнения являются общими, потому что популяции медоносных пчел, как управляемые, так и дикие, всегда имеют некоторую степень фоновой вирусной инфекции, хотя часто без проявления острых симптомов ^16,17, а последствия коинфекции вируса не совсем понятны¹⁸. Это затруднило изучение эффектов вируса медоносных пчел.

Многие исследования вируса медоносных пчел использовали косвенные вирусные инфекции для поиска взаимодействий с другими стрессорами, наблюдая, как фоновые инфекции изменяются при других методах лечения 12,19,20,21. Хотя этот подход был успешным в выявлении важных эффектов, особенно в обнаружении того, как пестициды или диетические методы лечения влияют на уровни и репликацию вируса, прививка вирусной обработкой известного содержания и концентрации имеет решающее значение для экспериментального тестирования динамики вирусной инфекции. Тем не менее, отделение экспериментального лечения от фоновой инфекции также может представлять проблемы. В полевых исследованиях исследователи дифференцировали штаммы вируса деформированного крыла (DWV), чтобы предоставить доказательства передачи вируса от медоносных пчел^{шмелям 22}, но использование этого подхода было бы затруднено только для медоносных пчел. Вирусные инфекционные клоны являются мощным инструментом не только для отслеживания инфекции ^23,24,25, но и для обратных генетических исследований вирусов медоносных пчел и для исследований взаимодействия вирус-хозяин 26,27,28. Однако в большинстве случаев инфекционные клоны по-прежнему необходимы для выполнения инфекционного цикла внутри клеток для производства частиц. Такие частицы предпочтительны в качестве инокул для экспериментального лечения, потому что их инфекционность выше, чем у голой вирусной РНК, а инокуляция инкапсидированными геномами имитирует естественную инфекцию.

Производство чистых, незагрязненных инокул вируса медоносных пчел (штаммы вируса дикого типа или штаммы, полученные из инфекционных клонов) также создает проблемы. В первую очередь это связано с трудностями в получении надежной, непрерывно реплицирующейся, безвирусной клеточной линии медоносных пчел для получения вирусов чистого штамма^29,30. Хотя некоторые клеточные линии были произведены, эти системы остаются несовершенными; Тем не менее, есть надежда, что жизнеспособная клеточная линия может быть произведена²⁹, что позволит более точно контролировать производство и исследование вируса. До тех пор, пока такая линия не станет широко доступной, большинство протоколов производства вирусов будут по-прежнему полагаться на использование in vivo вирусов производства и очистки 18,31,32,33,34. Эти подходы включают идентификацию и очистку вирусных частиц, представляющих интерес (или производство инфекционного клона) и использование их для заражения медоносных пчел, обычно в виде куколок. Куколкам вводят вирус-мишень, а затем приносят в жертву, а затем извлекают и очищают частицы. Однако, поскольку ни одна пчела не свободна от вирусов, в любом таком концентрате всегда присутствует некоторая степень заражения от следов других вирусов, и, следовательно, необходимо проявлять большую осторожность при выборе пчел с низкой вероятностью фоновых инфекций. Кроме того, методы удаления куколок из гребенчатых ячеек для использования в этих протоколах³³ являются очень трудоемкими и могут вызывать стресс у пчел, ограничивая производство этими средствами^18,32. Здесь мы сообщаем об альтернативном методе, который позволяет в больших масштабах удалять личинок с небольшим трудом и меньшей механической нагрузкой на пчел.

После того, как куколки получены и введены с начальным вирусным инокулятом, их необходимо инкубировать, чтобы обеспечить вирусу время для репликации. Впоследствии полученные вирусные частицы могут быть переработаны в форму, пригодную для заражения экспериментальных пчел. Существует несколько простых методов для достижения этого, в том числе использование сырого гомогената^35,36 или гемолимфы, полученной от вирусно инфицированных пчел в качестве источника инфекции³⁷. Эти методы эффективны, но имеют большую вероятность введения неизвестных переменных из фонового субстрата (например, других факторов в гомогенатах мертвых пчел). Кроме того, желательно концентрировать частицы, если эксперимент требует введения большой, известной дозы вируса за короткий промежуток времени. Поэтому для лучшего контроля предпочтительнее использовать методы, допускающие некоторый уровень очистки и концентрацию вирусных частиц. Как правило, серия этапов осаждения и центрифугирования приведет к удалению почти всего возможного нецелевого вирусного материала³³.

После получения этого концентрированного инокулята полезно количественно оценить вирусные титры (qPCR) и охарактеризовать его биоанализами in vivo, чтобы проверить его жизнеспособность и способность вызывать смертность, а также подтвердить, что повышенные титры вируса получены после заражения. Это может быть достигнуто с помощью инъекционных экспериментов (либо в куколок, либо во взрослых особей) или экспериментов по кормлению (в личинок или взрослых особей). Хотя все эти подходы возможны, кормление групп взрослых пчел в клетке часто является самым быстрым и простым. Клеточный метод анализа также широко используется для тестирования различных других методов лечения на пчелах, включая токсичность пестицидов³⁸, развитие яичников^{39 и влияние питательных} веществ на поведение^40,41 и, следовательно, может стать хорошей основой для экспериментов, связывающих вирусную инфекцию с другими факторами⁴².

Здесь мы описываем надежный метод получения больших количеств получистых, высокообогащенных вирусных частиц без использования дорогостоящей ультрацентрифуги, включая метод удаления куколок, который уменьшает трудовую и механическую нагрузку на пчел, и высоковоспроизводимый, высокопроизводительный биоанализ для тестирования вирусной инфекции и эффектов. Жестко контролируя чистоту вирусной инокулы, исследователи могут уменьшить вариации вирусного ответа медоносной пчелы по сравнению с другими методами вирусной инокуляции. Кроме того, биоанализ может проверять вирусные эффекты на уровне небольших групп с использованием высоковоспроизводимых экспериментальных единиц перед масштабированием до реалистичных в полевых условиях, что гораздо более трудоемко для управления. В сочетании эти два метода предоставляют необходимые инструменты для исследований, которые могут помочь улучшить наше общее понимание физиологических взаимодействий между медоносными пчелами и вирусом.

протокол

1. Массовое извлечение пчел Вариант 1: самоудаление личинок

1. Поместите матку медоносных пчел в пустую, вытянутую рамку Лангстрота и верните ее в свою колонию. Дайте матке отложить яйца на этом каркасе в течение 24 ч.
   1. Проверьте рамку через 24 часа, чтобы убедиться, что большинство гребенчатых клеток содержат недавно отложенные яйца. В зависимости от матки и колонии, яйца иногда откладываются не очень хорошо в первые 24 ч. Если это произойдет, подождите еще 24 часа и отрегулируйте время по мере необходимости.
2. После 24-часового периода яйцекладки отпустите матку. Четко отметьте рамку и верните ее в колонию.
3. Ровно через 192 ч (8 дней) после того, как матка находится в клетке (при условии нормальной откладки яиц в течение первых 24 ч; 8 дней отмечает точку прямо перед окукливанием) снимите отмеченную рамку с колонии. Смахните всех взрослых пчел и перенесите каркас в инкубатор в соответствии с внутренними условиями улья (34 °C и относительная влажность 50% (RH)).
   1. Убедитесь, что большая часть рамки заполнена личинками^5-й звезды, которые можно узнать по их большим, белым, с-образным телам, плотно прижатым к нижним краям гребенчатых ячеек. Вероятно, также будет несколько клеток, уже покрытых восковым укупоркой, особенно вблизи центра рамы.
4. Подготовьте контейнеры, соответствующие высоте и ширине заполненного личинками каркаса, чтобы получить^5-ю звезду личинок, тщательно очистив внутреннюю и внешнюю поверхности с мылом и водой, затем раствором отбеливателя и, наконец, этанолом. Тщательно высушите контейнер, прежде чем продолжить.
   1. Выровняйте дно контейнеров несколькими слоями бумажных полотенец. Затем добавьте несколько перекрывающихся слоев более тонких, абсорбирующих чистящих салфеток (например, деликатных дворников) или фильтровальной бумаги. Материал должен быть абсорбирующим. Избегайте перекрытия верхнего слоя, чтобы улучшить легкость будущего переноса личинок.
5. Поместите рамки лицевой стороной вниз (с фокальными личинками, обращенными вниз) поверх контейнеров, чтобы личинки могли упасть на слой очищающих салфеток.
   1. Накройте контейнер и раму шатром из алюминиевой фольги или другим покрытием, чтобы сохранить влагу и вернуть установку в инкубатор. Оставьте настройку на ночь. Естественная склонность личинок к поиску пищи заставит их выползти из своих клеток и упасть на мягкую поверхность внизу.
6. Подготовьте отдельные лотки для переноса, тщательно очистив их, выполнив те же действия, которые описаны в 1.4. Дайте лоткам высохнуть и обложите дно чистящими салфетками. Лотки не должны соответствовать каким-либо конкретным размерам, но более мелкие лотки позволят легче манипулировать личинками.
   1. Начните переносить личинок из контейнеров в лотки, осторожно снимая отдельные салфетки с верхнего слоя в контейнерах и осторожно выливая личинок на лотки. Личинки должны были упасть в контейнеры за ночь, образовав несколько липких масс (рисунок 1А).
   2. Используйте тупые мягкие щипцы, чтобы отделить личинки и разложить их по всей поверхности лотков. Они не должны быть равномерно расположены и могут быть близко друг к другу, но не должны касаться. Смотрите рисунок 1B для визуального изображения разделенных личинок.
   3. Воспользуйтесь этой возможностью, чтобы удалить любые поврежденные (обесцвеченные) или ниже среднего размера личинки. Они с большей вероятностью умирают во время процесса созревания и могут принести инфекции / грибковый рост по всему лотку.
7. Накройте лоток алюминиевой фольгой, чтобы сохранить влагу и вернуть установку в инкубатор.
8. Ежедневно проверяйте личинок и удаляйте все, которые обесцвечены (темно-коричневые или черные).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки / пре-куколки будут испражняться на чистящие салфетки, проявляясь в виде небольших коричневых пятен. Они также могут производить небольшое количество белых, тонких ремней в рамках процесса укупорки. Ни один из этих случаев не требует замены чистящих салфеток, если они являются абсорбирующими.
9. Позвольте личинкам окупиться и созреть до стадии белоглазого глаза, которую можно определить по их общей форме, соответствующей форме взрослой пчелы, при этом все еще не имея пигментации в глазах и большей части остальной части тела. Это должно произойти между 14 и 15 днями после клетки матки. Куколки теперь готовы к инъекции вируса. Рисунок 1C, 1D для примеров белоглазых куколок.

2. Массовое извлечение пчел Вариант 2: ручное иссечение куколок

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя вариант 2 (иссечение куколки) является жизнеспособным методом экстракции пчел, он также имеет несколько недостатков по сравнению с вариантом 1 (самоудаление личинок). Вариант 2 гораздо более трудоемкий, его сложнее контролировать для роста куколок и, как правило, более стрессовый для самих пчел. По возможности рекомендуется использовать вариант 1.

1. Выберите из подходящей колонии каркас из выводка медоносной пчелы, содержащего куколок на стадии белых глаз или рядом с ней (см. описание в 1.9). Снимите укупорку с гребенчатых клеток, расположенных вблизи центра и краев каркаса, чтобы подтвердить наличие соответствующей стадии развития.
2. Перенесите раму в инкубатор, установленный на 34 °C и относительную влажность 50%. Всегда возвращайте раму в инкубатор, когда она не используется немедленно.
3. Подготовьте и очистите передаточные лотки, идентичные описанным в 1.6.
4. Снимите рамку с инкубатора и установите на угловую подставку под источником света. Смочите небольшую стопку бумажных полотенец водой.
5. Очистите пару тупых жестких щипцов, используя этанол. Используя чистые щипцы, удалите укупорку из клеток, содержащих белоглазых куколок, заботясь о том, чтобы не повредить куколок в процессе.
6. Один за другим аккуратно иссейте куколки из гребенчатых клеток. Безопаснее всего захватывать куколки вокруг грудной клетки и живота с помощью кончиков щипцов, если есть достаточно места. Если нет, однако, куколки также могут быть удалены, захватив голову и медленно выкручивая ее достаточно далеко, чтобы затем схватить по всему телу.
   1. Накройте части рамы, к которым не осуществляется немедленный доступ, влажными бумажными полотенцами, чтобы сохранить влагу. Удалите и замените по мере необходимости во время процесса иссечения.
7. Разместите иссеченные куколки вдоль чистящих салфеток в передаточных лотках, убедившись, что ни одна из них не касается. Любые обезображенные или обесцвеченные куколки должны быть выброшены. Куколки теперь готовы к инъекции вируса.
   1. Выбросьте куколки, которые выделяют жидкость при контакте с салфетками; они, вероятно, были проколоты. Иногда куколки будут демонстрировать небольшие темные пятна меланизации вблизи точек контакта с щипцами в течение 1 ч после удаления. Это не должно влиять на выживание. При появлении больших пятен меланизации пораженные куколки следует отбросить.

3. Инъекция вируса куколки

ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот протокол выполняется впервые (т.е. без предварительных запасов вирусных инокул), сначала извлекайте и концентрируйте частицы с использованием взрослых особей, куколок или личинок из колонии с подозрением на инфекцию. Измерьте вирусные титры в результирующей инокуле, как описано на этапе 5, и определите, какие частицы следует распространять дальше.

1. Стерилизуйте все рабочие поверхности с помощью отбеливающей воды и этанола перед началом работы с вирусами медоносных пчел. Нитриловые перчатки следует носить в течение всего процесса.
2. Подготовьте инжекторный аппарат, способный впрыскивать жидкость в количествах ~1 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из недорогих, но эффективных подходов было бы создание устройства ручной работы путем прикрепления подкожной иглы весом 30 г к кончику 100-мкл с несколькими дозаторами (см. Таблицу материалов) с использованием гибкой эпоксидной смолы или другого жидкого клея. Убедитесь, что края крышки иглы плотно прижаты к наконечнику мультидозатора и дайте аппарату высохнуть. На рисунке 2 приведено визуальное изображение примера инжекторного аппарата.
3. Приготовьте раствор для инъекционного разбавления вируса путем смешивания желаемого типа вирусных частиц со стерилизованным 1x PBS (фосфатно-буферизованным физиологическим раствором) в конической центрифужной трубке объемом 15 мл. Общее необходимое количество будет зависеть от количества куколок, которые необходимо ввести, причем каждая куколка требует инъекции 1 мкл (например, 500 куколок = 5 мкл вирусных частиц + 495 мкл PBS).
4. Прикрепите инжекторный аппарат к ручной мультипипетке и проверьте эффективность, вытягивая 100 мкл воды из отдельного стакана и дозируя ее в дозах 1 мкл. Убедитесь, что все дозируемые количества равны, заменяя инжекторное устройство по мере необходимости. Очистите оставшуюся воду из инжектора.
5. Извлеките из инкубатора лотки куколок, образовавшиеся на этапе 1 или 2, и снимите покрытие из алюминиевой фольги.
6. Очистите пару тупых жестких щипцов, используя этанол. Осторожно схватите отдельную куколку вдоль грудной клетки, оказывая достаточное давление, чтобы заставить внутренние жидкости приложиться к животу. Это должно сделать тергитовые деления более очевидными.
7. Наберите 100 мкл раствора вирусных частиц с помощью мультипипетки, вставьте иглу между третьим и четвертым брюшными тергитами и введите 1 мкл раствора вируса. Повторите для каждой куколки, разложенной на лотках, позаботившись о том, чтобы избежать повторных инъекций. Любые куколки, поврежденные во время процесса, должны быть выброшены.
   ВНИМАНИЕ: Все материалы, связанные с вирусными препаратами, обозначены как биологические опасности и должны быть автоклавированы и утилизированы в соответствии с институциональными руководящими принципами. Иглы также следует утилизировать в соответствии с институциональными руководящими принципами.
8. Накройте лотки введенных куколок алюминиевой фольгой и верните в инкубатор. Дайте вирусным частицам размножаться внутри куколок в течение 3-5 дней.
   1. Выполняйте ежедневные проверки куколок и удаляйте любые мертвые или гниющие образцы, чтобы предотвратить накопление бактерий или грибков. Небольшие точки меланизации могут появиться в месте инъекции на брюшной полости, но не должны влиять на выживаемость.
9. Отбирайте пробы куколок в конические центрифужные трубки объемом 50 мл и вихрь для гомогенизации содержимого, заботясь о том, чтобы отбирать куколки в пробирки по колониальному источнику, чтобы уменьшить загрязнение от нецелевых вирусов. Убедитесь, что не осталось целых куколок, и переложите пробирки в морозильную камеру с температурой -80 °C до готовности к осаждению и концентрации вирусных частиц.

4. Концентрация вирусных частиц

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не был протестирован для восстановления вирусов в оболочке.

1. Автоклавируйте все материалы и контейнеры перед использованием. Нитриловые перчатки, лабораторные халаты и средства защиты глаз следует носить во время всего этого процесса. Стерилизуйте все рабочие поверхности с помощью отбеливающей воды, этанола и раствора, инактивирующего РНКазу, перед началом.
   1. Приготовьте 1x TES (Tris-EDTA-соль) буфер: смешайте 10 мМ Tris-HCL pH 7,5, 2 мМ ЭДТА и 150 мМ NaCl. Стерилизуют автоклавированием.
2. Разморозить гомогенизированные куколки и перенести в бутылочки-центрифуги. Добавьте приблизительно три объема 1x PBS (например, добавьте полный пробирку куколок объемом 50 мл к 150 мл 1x PBS) и выровняйте объемы с объемом самой полной бутылки.
3. Перемешайте сначала вручную, а затем поместите на орбитальный шейкер при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Центрифуга при 15 000 х г при 4 °C в течение 5 мин для удаления клеточного мусора. Повторите этот шаг по мере необходимости, если клеточный мусор остается.
   1. Если супернатант имеет большие шарики жира, плавающие на поверхности, процедите марлю в отдельные стерильные бутылки центрифуги, прежде чем продолжить.
5. Экстрагировать надосадочный материал с 0,3 объемами раствора хлороформа:изоамилового спирта 24:1 (например, 190 мл супернатанта + 57 мл хлороформа:изоамилового спирта) и смешивать путем инверсии. Центрифуга при 21 000 х г при 4 °C в течение 20 мин.
   ВНИМАНИЕ: Избегайте прямого контакта с хлороформом на коже или глазах. Всегда носите правильные СИЗ. Все хлороформные отходы должны удаляться в соответствии с институциональными руководящими принципами.
6. Восстановите водную фазу из каждой бутылки, декантируя супернатант в отдельные стерильные стаканы по 500 мл в ледяной ванне или в холодной камере с температурой 4 °C. Позаботьтесь о том, чтобы избежать загрязнения супернатанта хлороформом, так как это затруднит процесс очистки; лучше немного потерять водную фазу.
7. Добавьте воду без РНКазы, чтобы довести каждый стакан до объема 200 мл. Поместите стаканы на магнитные пластины и опустите в перемешивание среднего размера. Установите тарелки для перемешивания при средне-низкой настройке.
8. Медленно добавляйте NaCl к каждому стакану при постоянном мягком перемешивании, доводя каждый до конечной концентрации 2,3% (например, 4,6 г NaCl на 200 мл супернатанта). Добавляйте полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ) в каждый стакан до конечной концентрации 7% (например, 14 г ПЭГ на 200 мл надосадочного вещества).
9. Накройте стаканы алюминиевой фольгой и продолжайте перемешивать со средне-низкой скоростью на льду или в холодном помещении в течение 1-5 ч для растворения ПЭГ. Чем больше времени затрачено на перемешивание, тем тщательнее ПЭГ растворится.
10. Выключите тарелки для перемешивания. Инкубируйте покрытые стаканы в течение 1-3 дней на льду или в холодном помещении, чтобы позволить вирусным частицам и белкам выпасть в осадок. Чем больше времени затрачено на инкубацию, тем больше частиц будет выпадать в осадок.
11. Переложите содержимое каждого стакана в отдельные чистые бутылки для центрифуг и центрифугу при 15 000 х г при 4 °C в течение 30 мин для извлечения гранулы частиц PEG. Выбросьте супернатант.
12. Осторожно соскоблите гранулы частиц PEG с боков бутылки и повторно суспендируйте их в минимальных объемах 1x TES буфера внутри чистых стаканов, медленно добавляя небольшие количества TES к гранулам (примерно 10 мл на 100 оригинальных пчел).
13. Пропустите суспендированную гранулу через иглу 18 Г не менее десяти раз, прежде чем аликвотировать в 2 мл центрифужные трубки. Держите все трубки на льду до готовности к 4.14.
14. Центрифуга 2 мл трубки при 13 000 х г при 4 °C в течение 15 мин для удаления дополнительного ПЭГ. Переместите супернатант в другую 2 мл центрифужную трубку с помощью пипетки объемом 1000 мкл и повторите этап центрифугирования, чтобы обеспечить полное удаление всех ПЭГ.
15. Сконцентрируйте оставшиеся частицы в супернатанте в новых центрифужных трубках с использованием центробежных фильтрующих установок (отсечка 100 кДа) с помощью нескольких раундов центрифугирования при 14 000 х г при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин каждая до достижения примерно одной пятой исходной концентрации (10 мл раствора частиц TES примерно до 2 мл концентрированных частиц). Фильтрующие блоки бывают разных размеров; выбрать наиболее подходящий для количества обрабатываемых образцов. Устройства, которые помещаются в конические трубки размером 15 мл, обычно являются наиболее подходящими.
16. Повторно суспендируют концентрированные частицы, проходя через подкожную иглу 26 Г и центрифугу при 14 000 х г при RT в течение 5 мин для одного заключительного раунда удаления ПЭГ. Если жидкость все еще мутная, повторяйте до тех пор, пока не будет удален весь осадок ПЭГ.
17. Аликвотирование вязкого супернатанта в желаемые количества и хранение при -80 °C до готовности к использованию.

5. Извлечение и количественная оценка РНК вируса

1. Экстрагируйте РНК из целых пчел или концентрированных вирусных частиц с использованием любого подходящего метода экстракции РНК (например, реагента экстракции РНК TRIzol с последующей обработкой ДНКазой).
2. Количественная оценка титров вируса в инокуляте, генерируемом на этапе 5.1 с помощью RT-qPCR, предпочтительно с использованием метода, основанного на стандартной кривой, который не полагается на экспрессию гена хозяина¹⁸, хотя другие методы также могут допускать оценки.

6. Биоанализ вирусного питания

1. Подготовьте все необходимые материалы для биоанализа перед этапом сбора каркаса (6,2) или в течение 24-часового периода появления пчел (6,3).
   1. Подготовьте чистые клетки или другие корпуса, способные вместить количество пчел, необходимое для биоанализа (например, клетки акрилового ящика размером 10,16 см х 10,16 см х 7,62 см), заткнув все отверстия питателя центрифужной трубкой соответствующего размера (рисунок 3). Определите и рандомизируйте методы лечения среди клеток и пометьте каждое из них с их назначенным лечением для легкого использования в будущем.
   2. Подготовьте лотки для инокулята, маркируя отдельные весовые лодки среднего размера соответствующей клеткой и обработкой.
   3. Приготовьте питательный раствор, смешав соответствующее количество сахарозы с деионизированной водой (например, 300 г сахарозы на 1 л воды для 30% раствора сахарозы), обязательно стерилизуя воду до и после добавления сахарозы. Стерильный раствор сахарозы можно хранить в холодильнике с температурой 4 °C в течение нескольких недель, но при появлении помутнения следует выбросить.
   4. Подготовьте питательные трубки, частично заполнив центрифужные трубки объемом 15 мл питательными растворами, произведенными в 6.1.3, перевернув их и проделав 1-2 отверстия вокруг кончика трубки с помощью миниатюры. Отверстия также могут быть расплавлены с помощью подкожной иглы 18G, нагретой над пламенем. Убедитесь, что крышки трубок подачи привинчены очень плотно, так как незакрепленные колпачки могут вызвать медленные утечки, которые утопят обитателей клетки в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные растворы и объем питательной трубы могут быть отрегулированы по мере необходимости в соответствии с экспериментальными потребностями.
   5. Подготовьте коллекцию, пригодную для вновь появившихся пчел, слегка покрыв края большой ванны растительным маслом или аналогичным жирным веществом. Отдельно подготовьте несколько маленьких стаканчиков, используя тот же метод нанесения покрытия.
2. Выберите и удалите рамки расплода медоносной пчелы на грани эклозии, полученной по крайней мере из трех отдельных ульев. Соответствующим образом выдержанные пчелы напоминают полностью пигментированных взрослых особей под укупоркой клеток гребня. Верным признаком продолжающегося появления является наблюдение за обитателями клеток, медленно жующими свой выход и / или недавно опорожненными клетками с характерными зубчатыми следами жевания вдоль воскового укупорки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество требуемых кадров будет зависеть от размера эксперимента, количества появляющегося расплода на кадр и времени года. Стандартная глубокая рамка Langstroth содержит ~3000 гребенчатых ячеек на сторону; каркас, содержащий в основном куколок, с некоторыми наблюдаемыми появляющимися, может легко произвести более 400 пчел за 24 часа. Корректируйте в течение всего сезона, по мере необходимости.
3. Смахните всех взрослых пчел, прежде чем поместить рамки в ящики для всходов и перенести их в инкубатор, соответствующий внутренним условиям улья (34 ° C и 50% относительной влажности). Дайте пчелам выйти на поверхность в течение 24 ч.
4. Выньте из инкубатора ящики для всходов и засуньте всех вновь появившихся пчел в ванну для сбора. Обязательно удалите всех пчел из ящиков для всходов, чтобы предотвратить включение неправильно выдержанных пчел в любые последующие чистки. Любая пчела, способная летать, появилась > 24 часа назад и должна быть исключена из биоанализа.
5. Произведите гомогенизированную смесь вновь появившихся пчел, аккуратно перемешав пчел в коллекционной ванне вручную (они не могут жалить в этом возрасте), чтобы свести к минимуму генетические эффекты улья от любой отдельной колонии. Для конкретных применений могут быть желательными другие механизмы для источника колонии.
6. Насчитайте 35 отдельных пчел, поместив каждую из них в одну и ту же смазанную маслом чашку, прежде чем перенести содержимое в акриловую клетку. В качестве альтернативы может быть проще разделить меньшие кратные пчелы на несколько смазанных стаканчиков (например, 5 чашек по 7 пчел в каждой), чтобы избежать ошибок неправильного подсчета. Количество используемых пчел может варьироваться в зависимости от потребностей и применений.
7. Перенесите клетки пчел в инкубатор (34 ° C и 50% относительной влажности), обязательно следуя рандомизированному порядку размещения, созданному в 6.1.1, чтобы свести к минимуму любые потенциальные эффекты микроклимата.
8. Подготовьте рабочее пространство для работы с вирусами, очистив все поверхности и пипетки отбеливающей водой, этанолом и раствором, инактивирующим РНКазу, перед началом. Обязательно надевайте нитриловые перчатки при работе с вирусными частицами.
9. Приготовьте вирусный инокулят желаемой концентрации путем размораживания соответствующего количества концентрированных вирусных частиц (этап 4.17) и тщательного смешивания с достаточным количеством раствора сахарозы (этап 6.1.3) в стерильном контейнере. Для клеток по 35 пчел каждая требует 600 мкл инокулята. Серийные разведения рекомендуются, если желаемая концентрация вируса находится на уровне или ниже 0,1%.
   1. Например, эксперимент с участием 40 клеток, в которых требуется 1% инокулятор вируса, потребует 24 мл раствора вируса, который может быть создан путем объединения 240 мкл концентрированных вирусных частиц с 23,76 мл раствора сахарозы. Рекомендуется включать примерно 15% превышения в первоначальный объем, так как некоторые потери следует ожидать с вязкими жидкостями.
10. На каждый лоток выложить лотки с инокулятом, приготовленные в пункте 6.1.2, отсортированные по типу обработки, и пипетку по 600 мкл соответствующего инокулята.
    1. Осторожно вставьте лотки с инокулятом в соответствующие клетки, заботясь о том, чтобы случайно не выпустить пчел. Воспользуйтесь этой возможностью, чтобы отсканировать пчел и заменить тех, кто мог умереть в процессе передачи.
11. Добавьте к полному расходу инокулы (приблизительно 12-14 ч) перед удалением трубок центрифуги, блокирующих верхнее отверстие питателя, вставив соответствующие питательные трубки, подготовленные в 6.1.4. Это помогает гарантировать, что пчелы в клетке равномерно распределяют инокулятив по всей популяции. Раствор сахарозы предоставляется ad libitum , и трубки должны быть заполнены по мере необходимости на протяжении всего эксперимента.
12. Регистрируйте смертность в каждой клетке с интервалом 12 ч в течение первых 72 ч каждого эксперимента, после чего сдвигайте запись на интервалы 24 ч. Удалите мертвых пчел из клеток, чтобы облегчить будущие подсчеты, сдвинув дверцу клетки вверх достаточно далеко, чтобы пара щипцов могла войти и вычерпнуть мертвых пчел. Обязательно стерилизуйте щипцы над спиртовой лампой между клетками, чтобы предотвратить вирусное перекрестное загрязнение.
13. Выборка пчел для измерения вирусного титра (5,1-5,2) путем случайного отбора живых образцов в каждой клетке и помещения их в центрифужные трубки на сухом льду. Как правило, трех пчел достаточно, чтобы произвести измерения вирусного титра в любой заданный момент времени без обезлюдения клетки.
14. Продолжайте регулярные измерения смертности до тех пор, пока это необходимо.

Результаты

Успешное следование протоколам (Рисунки 1) для инъекций куколок и вирусной экстракции должно производить большое количество вирусных частиц. Тем не менее, отбор проб и инъекция куколок, полученных из различных колоний в несколько временных точек, максимизируют шансы на приобр...

Обсуждение

Здесь мы изложили методы, детализирующие каждый этап процесса амплификации вируса и подготовки запасов инокулята, включая сбор личинок и размножение вируса, экстракцию и концентрацию, а также вирусную обработку в виде экспериментов по кормлению в клетке. Эти методы позволяют производ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375