Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Resumo

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Resumo

As abelhas são de grande importância ecológica e agrícola em todo o mundo, mas também estão sujeitas a uma variedade de pressões que afetam negativamente a saúde das abelhas, incluindo a exposição a patógenos virais. Esses vírus podem causar uma grande variedade de efeitos devastadores e muitas vezes podem ser desafiadores para estudar devido a múltiplos fatores que dificultam a separação dos efeitos dos tratamentos experimentais da infecção de fundo pré-existente. Aqui apresentamos um método para produzir em massa grandes quantidades de partículas de vírus, juntamente com um bioensaio de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Necessitadas pela atual falta de uma linha celular de abelhas de mel contínua e livre de vírus, as partículas virais são amplificadas in vivo usando pupas de abelha mel, que são extraídas da colmeia em grandes volumes usando metodologia minimamente estressante. Essas partículas de vírus podem então ser usadas em bioensações de gaiolas de abelhas para testar a viabilidade do inocula, bem como várias outras dinâmicas de infecção por vírus, incluindo interações com nutrição, pesticidas e outros patógenos. Uma grande vantagem do uso dessas partículas é que ela reduz consideravelmente as chances de introduzir variáveis desconhecidas na experimentação subsequente quando comparadas às alternativas atuais, como infecção por hemoglifo de abelha infectada ou homogeneização, embora ainda deva ser tomado cuidado ao fornecer as abelhas, para minimizar a contaminação do vírus de fundo. Os ensaios da gaiola não substituem experimentos realistas em larga escala que testam efeitos de infecção por vírus em nível de colônia, mas funcionam como um método para estabelecer respostas virais de linha de base que, em combinação com as partículas de vírus semi-puros, podem servir como ferramentas importantes para examinar várias dimensões das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Introdução

As abelhas de mel (Apis mellifera) desempenham um papel crítico na paisagem agrícola global moderna, mas atualmente sofrem de uma combinação de estressores bióticos e abióticos, incluindo exposição a pesticidas, forragem ruim, parasitas e patógenos ^1,2. Um dos patógenos mais importantes de preocupação são os vírus, muitos dos quais são vetoriados por outro dos maiores estressores de abelhas, o ácaro varroa parasita (destruidor varroa). Esses vírus podem causar uma série de efeitos negativos nas abelhas, incluindo a redução da sobrevida da ninhada, defeitos de desenvolvimento e paralisia que p....

Protocolo

1. Opção de extração de abelhas em massa 1: auto-remoção larval

1. Gaiola uma rainha das abelhas em um quadro vazio e desenhado langstroth e devolvê-la para sua colônia. Deixe a rainha colocar ovos neste quadro por 24 horas.
   1. Verifique o quadro após 24 horas para garantir que a maioria das células do pente contenha ovos recém-colocados. Dependendo da rainha e da colônia, os ovos às vezes não são colocados muito bem nas primeiras 24 horas. Se isso ocorrer, permita um adicional de 24 horas e ajuste o tempo conforme necessário.
2. Após o período de 24 horas de colocação de ovos, solte a rainha. Marque o quadro claramente e devolva-o à col....

Resultados

Seguindo com sucesso os protocolos (Figuras 1) para injeção de pupal e extração viral devem produzir grandes quantidades de partículas de vírus. No entanto, a amostragem e a injeção de pupas provenientes de uma variedade de colônias em vários pontos de tempo maximiza as chances de adquirir vírus alvo com baixa contaminação. A dinâmica pela qual os vírus se replicam e interagem entre si dentro de uma abelha não é bem compreendida; juntamente com a probabilidade de infecção pré-existent.......

Discussão

Aqui delineamos métodos detalhando cada etapa do processo de amplificação do vírus e preparação do estoque inóculo, incluindo coleta de larvas e propagação de vírus, extração e concentração, bem como tratamento viral na forma de experimentos de alimentação de gaiolas. Esses métodos permitem a produção de partículas de vírus semi-puros (Figura 4), da qual a eficácia pode ser quantificada consistentemente por testes de mortalidade por dose-resposta para vírus letais para.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375