Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Resumo

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Resumo

As abelhas são de grande importância ecológica e agrícola em todo o mundo, mas também estão sujeitas a uma variedade de pressões que afetam negativamente a saúde das abelhas, incluindo a exposição a patógenos virais. Esses vírus podem causar uma grande variedade de efeitos devastadores e muitas vezes podem ser desafiadores para estudar devido a múltiplos fatores que dificultam a separação dos efeitos dos tratamentos experimentais da infecção de fundo pré-existente. Aqui apresentamos um método para produzir em massa grandes quantidades de partículas de vírus, juntamente com um bioensaio de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Necessitadas pela atual falta de uma linha celular de abelhas de mel contínua e livre de vírus, as partículas virais são amplificadas in vivo usando pupas de abelha mel, que são extraídas da colmeia em grandes volumes usando metodologia minimamente estressante. Essas partículas de vírus podem então ser usadas em bioensações de gaiolas de abelhas para testar a viabilidade do inocula, bem como várias outras dinâmicas de infecção por vírus, incluindo interações com nutrição, pesticidas e outros patógenos. Uma grande vantagem do uso dessas partículas é que ela reduz consideravelmente as chances de introduzir variáveis desconhecidas na experimentação subsequente quando comparadas às alternativas atuais, como infecção por hemoglifo de abelha infectada ou homogeneização, embora ainda deva ser tomado cuidado ao fornecer as abelhas, para minimizar a contaminação do vírus de fundo. Os ensaios da gaiola não substituem experimentos realistas em larga escala que testam efeitos de infecção por vírus em nível de colônia, mas funcionam como um método para estabelecer respostas virais de linha de base que, em combinação com as partículas de vírus semi-puros, podem servir como ferramentas importantes para examinar várias dimensões das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Introdução

As abelhas de mel (Apis mellifera) desempenham um papel crítico na paisagem agrícola global moderna, mas atualmente sofrem de uma combinação de estressores bióticos e abióticos, incluindo exposição a pesticidas, forragem ruim, parasitas e patógenos ^1,2. Um dos patógenos mais importantes de preocupação são os vírus, muitos dos quais são vetoriados por outro dos maiores estressores de abelhas, o ácaro varroa parasita (destruidor varroa). Esses vírus podem causar uma série de efeitos negativos nas abelhas, incluindo a redução da sobrevida da ninhada, defeitos de desenvolvimento e paralisia que podem levar ao colapso total da colmeia antes e depois do overwintering^{períodos 3,4,5}. Embora tenha havido avanços promissores no desenvolvimento de tecnologias usadas para combater a infecção pelo vírus 6,7,8,9, a dinâmica pela qual muitos vírus se propagam, se espalham e interagem dentro de uma abelha ou colônia ainda são mal compreendidas ^5,10 . Compreender a biologia básica das interações entre abelhas e vírus e suas relações com outros fatores ambientais é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficazes de manejo de vírus.

No entanto, estudar as interações mel-vírus representa desafios com inúmeros fatores conhecidos e desconhecidos que complicam o processo. Estes incluem interações com a dieta^11,12, exposição a pesticidas¹³ e fundo genético de abelhas^14,15. Mesmo focando apenas na infecção por vírus, complicações são comuns porque as populações de abelhas de mel, tanto controladas quanto selvagens, sempre têm algum grau de infecção por vírus de fundo, embora muitas vezes sem manifestar sintomas agudos^16,17, e os efeitos da coinfecção do vírus não são bem compreendidos¹⁸. Isso tornou difícil o estudo dos efeitos do vírus das abelhas.

Muitos estudos sobre o vírus das abelhas têm usado infecções circunstanciais do vírus para procurar interações com outros estressores, observando como as infecções de fundo mudam com outros tratamentos 12,19,20,21. Embora essa abordagem tenha sido bem sucedida na identificação de efeitos importantes, especialmente descobrindo como os tratamentos pesticidas ou dietéticos afetam os níveis e a replicação do vírus, a inoculação com um tratamento de vírus de conteúdo e concentração conhecidos é fundamental para testes experimentais da dinâmica da infecção por vírus. Mesmo assim, separar o tratamento experimental da infecção em segundo plano também pode representar desafios. Em estudos de campo, pesquisadores têm cepas diferenciadas de vírus de asa deformada (DWV) para fornecer evidências para a transmissão de vírus de abelhas de mel para abelhas²², mas usar essa abordagem seria difícil apenas dentro das abelhas. Clones infecciosos de vírus são uma ferramenta poderosa, não apenas para rastrear infecções 23,24,25, mas para estudos de genética reversa de vírus de abelhas de mel e para pesquisas de interação entre vírus e hospedeiros 26,27,28. No entanto, na maioria dos casos, clones infecciosos ainda são necessários para cumprir o ciclo de infecção dentro das células para produzir partículas. Tais partículas são preferidas como inocula para tratamentos experimentais porque sua infectividade é maior do que o RNA viral nu e a inoculação com genomas encapsidados imita uma infecção natural.

A produção de inocula de vírus de abelhas de mel puro e não contaminado (cepas de vírus do tipo selvagem ou aquelas derivadas de clones infecciosos) também representam desafios. Estes se devem principalmente às dificuldades em obter uma linha de células de abelhas de mel confiável, continuamente replicante e livre de vírus para produzir vírus de cepa pura^29,30. Embora algumas linhas celulares tenham sido produzidas, esses sistemas permanecem imperfeitos; ainda assim, há esperança de que uma linha celular viável possa ser produzida²⁹, o que permitiria um controle mais fino da produção e investigação do vírus. Até que essa linha se torne amplamente disponível, a maioria dos protocolos de produção de vírus continuará a depender do uso do vírus in vivo e da purificação 18,31,32,33,34. Essas abordagens envolvem identificar e purificar partículas de vírus de interesse (ou produzir um clone infeccioso) e usá-las para infectar abelhas, geralmente como pupas. As pupas são injetadas com o vírus alvo e depois sacrificadas, e outras partículas são extraídas e purificadas. No entanto, como nenhuma abelha é livre de vírus para começar, há sempre algum grau de contaminação por vestígios de outros vírus em qualquer concentrado, e, portanto, deve-se tomar muito cuidado na escolha de abelhas com baixa probabilidade de infecções de fundo. Além disso, os métodos de remoção da pupae das células pente-pente para uso nesses protocolos³³ são muito trabalhosos e podem induzir o estresse nas abelhas, limitando a produção por esses meios ^18,32. Aqui, relatamos um método alternativo que permite a remoção em larga escala de larvas com pouco trabalho de parto e menos estresse mecânico nas abelhas.

Uma vez que as pupas são obtidas e injetadas com o vírus inicial inóculo, elas devem ser incubadas para fornecer tempo para o vírus se replicar. Posteriormente, partículas de vírus produzidas podem ser processadas em uma forma utilizável para infectar abelhas experimentais. Existem vários métodos simples para conseguir isso, incluindo o uso de um homogene^{mente bruta 35,36} ou hemoglifo gerado a partir de abelhas viralmente infectadas como fonte de infecção³⁷. Esses métodos são eficazes, mas têm maior chance de introduzir variáveis desconhecidas do substrato de fundo (por exemplo, outros fatores nos homogeneizadores de abelhas mortas). Além disso, é desejável concentrar as partículas se um experimento requer dar uma grande dose conhecida de um vírus em um curto período de tempo. Portanto, para um melhor controle, é preferível usar métodos que permitam algum nível de purificação e concentração das partículas do vírus. Geralmente, uma série de etapas de precipitação e centrifugação resultarão na remoção de quase todos os possíveis materiais^{não-alvos do vírus 33}.

Após produzir esse inóculo concentrado, é benéfico quantificar os títulos virais (qPCR) e caracterizá-lo com bioensações in vivo para testar sua viabilidade e capacidade de causar mortalidade, bem como corroborar que o aumento dos do vírus são obtidos após a infecção. Isso pode ser alcançado através de experimentos de injeção (seja em pupas ou adultos) ou experimentos de alimentação (em larvas ou adultos). Embora todas essas abordagens sejam possíveis, alimentar-se de grupos de abelhas adultas em uma gaiola é muitas vezes o mais rápido e simples. O método de ensaio da gaiola também é amplamente utilizado para testar vários outros tratamentos sobre abelhas, incluindo toxicidade de pesticidas³⁸, desenvolvimento de ovário³⁹ e influência nutricional no comportamento^40,41 e, portanto, pode formar uma boa base para experimentos que ligam a infecção pelo vírus a outros fatores⁴².

Aqui descrevemos um método confiável para produzir grandes quantidades de partículas de vírus semi-puras e altamente enriquecidas sem o uso de uma ultracentrifuagem cara, incluindo um método para remover pupas que reduz o trabalho e o estresse mecânico nas abelhas e um bioensato altamente repetitivo e de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Controlando firmemente a pureza do inocula viral, os pesquisadores são capazes de reduzir a variação da resposta viral das abelhas em relação a outros métodos de inoculação viral. Além disso, o bioensativo pode testar efeitos virais em um nível de pequenos grupos usando unidades experimentais altamente repetíveis antes de escalar para configurações realistas de campo, o que é muito mais trabalhoso para gerenciar. Em combinação, esses dois métodos fornecem as ferramentas necessárias para estudos que podem ajudar a melhorar nossa compreensão geral das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Protocolo

1. Opção de extração de abelhas em massa 1: auto-remoção larval

1. Gaiola uma rainha das abelhas em um quadro vazio e desenhado langstroth e devolvê-la para sua colônia. Deixe a rainha colocar ovos neste quadro por 24 horas.
   1. Verifique o quadro após 24 horas para garantir que a maioria das células do pente contenha ovos recém-colocados. Dependendo da rainha e da colônia, os ovos às vezes não são colocados muito bem nas primeiras 24 horas. Se isso ocorrer, permita um adicional de 24 horas e ajuste o tempo conforme necessário.
2. Após o período de 24 horas de colocação de ovos, solte a rainha. Marque o quadro claramente e devolva-o à colônia.
3. Exatamente 192 h (8 dias) após a caging da rainha (assumindo ovo normal deitado dentro das primeiras 24h; 8 dias marca o ponto logo antes da pupação), remova o quadro marcado da colônia. Escove todas as abelhas adultas e transfira o quadro para uma incubadora que corresponda às condições internas de uma colmeia (34 °C e 50% de umidade relativa (RH)).
   1. Verifique se a maior parte do quadro está cheia de larvas de 5^estrelas , que podem ser reconhecidas por seus corpos grandes, brancos e em forma de C pressionados firmemente contra as bordas inferiores das células do pente. Provavelmente também haverá algumas células já cobertas por uma tampa de cera, especialmente perto do centro da moldura.
4. Prepare recipientes que combinem com a altura e largura do quadro cheio de larvas para receber as 5^mil larvas instar, limpando completamente as superfícies internas e externas com água e sabão, seguidas de uma solução de alvejante e, finalmente, etanol. Seque completamente o recipiente antes de prosseguir.
   1. Fore o fundo dos recipientes com várias camadas de toalhas de papel. Em seguida, adicione várias camadas sobrepostas de lenços de limpeza mais finos e absorventes (por exemplo, limpadores de tarefas delicados) ou papel filtro. O material deve ser absorvente. Evite sobrepor a camada superior para melhorar a facilidade de futura transferência larval.
5. Coloque as molduras viradas para baixo (com larvas focais voltadas para baixo) em cima dos recipientes para que as larvas possam cair sobre a camada de lenços de limpeza.
   1. Cubra o recipiente e a estrutura com um pedaço de papel alumínio ou outra cobertura para reter a umidade e devolva a configuração à incubadora. Deixe a configuração durante a noite. As tendências naturais de busca de alimentos das larvas farão com que elas rastejem para fora de suas células e caiam na superfície acolchoada abaixo.
6. Prepare as bandejas de transferência separadas limpando-as cuidadosamente usando os mesmos passos detalhados em 1.4. Deixe as bandejas secarem e coloque os fundos com lenços umedecidos. As bandejas não precisam combinar dimensões específicas, mas bandejas mais rasas permitirão manipulações larvais mais fáceis.
   1. Comece a transferir as larvas dos recipientes para as bandejas, levantando cuidadosamente os lenços individuais da camada superior dos recipientes e despejando suavemente as larvas nas bandejas. As larvas deveriam ter caído nos recipientes durante a noite, formando várias massas pegajosas (Figura 1A).
   2. Use fórceps macios sem cortes para separar as larvas e colocá-las através da superfície das bandejas. Eles não precisam ser espaçados uniformemente e podem estar próximos um do outro, mas não devem ser tocados. Consulte a Figura 1B para uma representação visual de larvas separadas.
   3. Aproveite para remover qualquer larva danificada (descolorida) ou de tamanho abaixo da média. Estes são mais propensos a morrer durante o processo de maturação e podem trazer infecções/crescimento fúngico em toda a bandeja.
7. Cubra a bandeja com papel alumínio para reter a umidade e devolva a configuração à incubadora.
8. Verifique as larvas diariamente e remova todas as descoloridas (marrom escuro ou preta).
   NOTA: As larvas/pré-pupas defecarão os lenços de limpeza, manifestando-se como pequenas manchas marrons. Eles também podem produzir pequenas quantidades de teia branca e wispy como parte de seu processo de cobertura. Nenhuma dessas ocorrências requer a substituição dos lenços de limpeza, desde que sejam absorventes.
9. Permitir que as larvas pupate e maduro para o estágio olho branco, que pode ser identificado por sua forma geral combinando com a de uma abelha adulta enquanto ainda falta pigmentação em seus olhos e a maior parte do resto de seu corpo. Isso deve ocorrer entre 14 e 15 dias após o ato da rainha. As pupas estão prontas para injeção de vírus. Figura 1C, 1D para exemplos de pupae de olho branco.

2. Opção de extração de abelhas em massa 2: excisão pupal manual

NOTA: Embora a opção 2 (excisão pupal) seja um método viável de extração de abelhas, ela também apresenta várias desvantagens quando comparada à opção 1 (autoexame larval). A opção 2 é muito mais trabalhosa, mais difícil de controlar para a idade pupal, e geralmente mais estressante para as próprias abelhas. A opção 1 é recomendada sempre que possível.

1. Selecione um quadro de ninhada de abelha de mel tampada contendo pupae no ou perto do estágio de olho branco (ver 1,9 para uma descrição) de uma colônia adequada. Remova o capping das células do pente localizadas perto do centro e das bordas do quadro para confirmar a presença do estágio de desenvolvimento apropriado.
2. Transfira o quadro para uma incubadora definida para 34 °C e 50% de umidade relativa. Sempre devolva o quadro à incubadora quando não estiver em uso imediato.
3. Prepare e limpe as bandejas de transferência idênticas às descritas em 1.6.
4. Remova a estrutura da incubadora e coloque em um suporte angular sob uma fonte de luz. Umedeça uma pequena pilha de toalhas de papel com água.
5. Limpe um par de fórceps duros sem cortes usando etanol. Usando as fórceps limpas, remova o capping das células que contêm pupas de olho branco, tomando cuidado para não danificar a pupa no processo.
6. Um por um, extirbe suavemente a pupa das células do pente. É mais seguro agarrar a pupa ao redor do tórax e abdômen usando as pontas dos fórceps, se houver espaço suficiente. Se não, no entanto, pupae também pode ser removido segurando a cabeça e lentamente balançando-a longe o suficiente para, em seguida, ser agarrada ao redor do corpo.
   1. Cubra as partes do quadro que não estão sendo acessadas imediatamente com toalhas de papel molhadas para reter a umidade. Remova e substitua conforme necessário durante o processo de excisão.
7. Espaça a pupae excisada ao longo dos lenços de limpeza nas bandejas de transferência, certificando-se de que nenhuma delas está tocando. Qualquer pupa desfigurada ou descolorida deve ser descartada. Pupae estão prontos para injeção de vírus.
   1. Descarte pupas que liberam fluido após contato com os lenços; eles provavelmente foram perfurados. Às vezes, pupas exibem pequenas manchas escuras de melanização perto dos pontos de contato com os fórceps dentro de 1h após a remoção. Isso não deve afetar a sobrevivência. Se grandes manchas de melanização aparecerem, as pupas afetadas devem ser descartadas.

3. Injeção de vírus pupal

NOTA: Se realizar este protocolo pela primeira vez (ou seja, sem estoques de inocula viral anterior), primeiro extraia e concentra partículas usando adultos, pupas ou larvas de uma colônia com suspeita de infecção. Meça os títulos virais no inocula resultante como descrito na etapa 5 e determine quais partículas se propagam ainda mais.

1. Esterilize todas as superfícies de trabalho usando água alvejante e etanol antes de começar a trabalhar com vírus das abelhas. Luvas de nitrilho devem ser usadas durante todo o processo.
2. Prepare um aparelho injetor capaz de injetar fluido em quantidades de ~1 μL.
   NOTA: Uma abordagem barata, mas eficaz, seria criar um dispositivo artesanal anexando uma agulha hipodérmica de 30 G à ponta de uma ponta multi-dispensador de 100 μL (ver Tabela de Materiais) usando epóxi flexível ou outro adesivo líquido. Certifique-se de que as bordas da tampa da agulha estão seladas firmemente contra a ponta do distribuidor multi-dispensador e deixe o aparelho secar. Consulte a Figura 2 para uma representação visual de um aparelho injetor de exemplo.
3. Prepare uma solução de diluição de injeção de vírus misturando o tipo desejado de partículas de vírus com 1x PBS esterilizado (soro fisiológico tamponado com fosfato) em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. A quantidade total necessária dependerá do número de pupas que precisam ser injetadas, com cada pupa exigindo uma injeção de 1 μL (por exemplo, 500 pupas = 5 partículas de vírus μL + 495 μL PBS).
4. Conecte o aparelho injetor a uma multi-pipeta manual e teste a eficácia, elaborando 100 μL de água de um béquer separado e distribuindo-o em doses de 1 μL. Certifique-se de que cada quantidade dispensada é igual, trocando o aparelho injetor conforme necessário. Limpe qualquer água restante do injetor.
5. Recupere as bandejas de pupas geradas na etapa 1 ou passo 2 da incubadora e remova a cobertura da folha de alumínio.
6. Limpe um par de fórceps duros sem cortes usando etanol. Segure suavemente a pupa individual ao longo do tórax, aplicando pressão suficiente para forçar fluidos internos ao abdômen. Isso deve tornar as divisões tergitas mais aparentes.
7. Elasenhe 100 μL da solução de partículas do vírus usando a multi pipeta, insira a agulha entre o terceiro e quarto tergitos abdominais e injete 1 μL da solução do vírus. Repita para cada pupa disposta nas bandejas, tomando cuidado para evitar repetidas injeções. Qualquer pupa danificada durante o processo deve ser descartada.
   ATENÇÃO: Todos os materiais relacionados à preparação de vírus são designados como riscos biológicos e devem ser autoclavados e descartados seguindo as diretrizes institucionais. As agulhas também devem ser eliminadas seguindo as diretrizes institucionais.
8. Cubra as bandejas de pupas injetadas com papel alumínio e retorne à incubadora. Permita que as partículas do vírus se propaguem dentro da pupae por 3-5 dias.
   1. Realize inspeções diárias na pupae e remova quaisquer espécimes mortos ou apodrecidos para evitar o acúmulo de bactérias ou fungos. Pequenos pontos de melanização podem aparecer no local da injeção no abdômen, mas não devem afetar a sobrevivência.
9. Prove a pupa em tubos de centrífugas cônicas de 50 mL e vórtice para homogeneizar o conteúdo, tendo o cuidado de provar pupas em tubos por fonte de colônia para reduzir a contaminação de vírus não-alvo. Certifique-se de que não restam filhotes inteiros e transfira os tubos para um congelador de -80 °C até que estejam prontos para precipitação e concentração de partículas do vírus.

4. Concentração de partículas de vírus

NOTA: Este protocolo não foi testado para a recuperação de vírus envoltos.

1. Autoclave todos os materiais e recipientes antes de usar. Luvas de nitrida, jalecos e proteção ocular devem ser usadas durante todo esse processo. Esterilize todas as superfícies de trabalho usando água alvejante, etanol e solução de inativação RNase antes de começar.
   1. Prepare 1x TES (Tris-EDTA-sal) tampão: Misture 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA e 150 mM NaCl. Esterilizar por autoclavagem.
2. Descongele pupas homogeneizadas e transfira para garrafas centrífugas. Adicione aproximadamente três volumes de PBS 1x (por exemplo, adicione um tubo completo de 50 mL de pupae a 150 mL de 1x PBS) e equalize os volumes ao da garrafa mais completa.
3. Misture primeiro à mão e, em seguida, colocando em um agitador orbital à temperatura ambiente por 10 minutos.
4. Centrifugar a 15.000 x g a 4 °C por 5 min para remover detritos celulares. Repita esta etapa conforme necessário se os detritos celulares permanecerem.
   1. Se o supernatante tiver grandes glóbulos de gordura flutuando na superfície, filtre através de pano de queijo em garrafas de centrífugas estéreis separadas antes de prosseguir.
5. Extrair o supernante com 0,3 volumes de clorofórmio 24:1 solução de álcool isoamyl (por exemplo, 190 mL de supernaspeuta + 57 mL de clorofórmio:álcool isoamyl) e misturar por inversão. Centrifugar a 21.000 x g a 4 °C por 20 min.
   ATENÇÃO: Evite contato direto com clorofórmio na pele ou nos olhos. Use sempre EPI adequado. Todos os resíduos de clorofórmio devem ser eliminados seguindo as diretrizes institucionais.
6. Recupere a fase aquosa de cada garrafa decantando o sobrenante em béquers estéreis separados de 500 mL em um banho de gelo ou em uma sala fria de 4 °C. Tome cuidado para evitar contaminar o supernatante com clorofórmio, pois dificultará o processo de purificação; é melhor perder um pouco de fase aquosa.
7. Adicione água livre RNase para levar cada béquer até um volume de 200 mL. Coloque os béquers em placas de agitação magnética e solte em uma barra de mexida de tamanho médio. Ajuste as placas para mexer em um ajuste médio-baixo.
8. Adicione lentamente NaCl a cada béquer sob constante agitação suave, trazendo cada um até uma concentração final de 2,3% (por exemplo, 4,6 g NaCl por 200 mL de supernante). Adicione polietileno glicol 8000 (PEG) a cada béquer até uma concentração final de 7% (por exemplo, 14 g PEG por 200 mL do supernante).
9. Cubra os béquers com papel alumínio e continue mexendo a uma velocidade média-baixa no gelo ou em uma sala fria por 1-5 h para dissolver o PEG. Quanto mais tempo gasto mexendo, mais minuciosamente o PEG se dissolverá.
10. Desligue as placas de agitação. Incubar os béquers cobertos por 1-3 dias no gelo ou em uma sala fria para permitir que partículas e proteínas do vírus precipitam. Quanto mais tempo gasto incubando, mais partículas precipitarão.
11. Transfira o conteúdo de cada béquer em garrafas de centrífugas limpas separadas e centrífuga a 15.000 x g a 4 °C por 30 min para recuperar uma pelota de partícula PEG. Descarte o supernatante.
12. Raspe cuidadosamente a pelota de partículas PEG dos lados da garrafa e resuspenque-as em volumes mínimos de tampão 1x TES dentro de béquers limpos adicionando lentamente pequenas quantidades de TES às pelotas (aproximadamente 10 mL por 100 abelhas originais).
13. Passe a pelota suspensa através de uma agulha de 18 G pelo menos dez vezes antes de aliquor em tubos de centrífugas de 2 mL. Mantenha todos os tubos no gelo até ficar pronto para 4.14.
14. Centrifugar tubos de 2 mL a 13.000 x g a 4 °C por 15 min para remover PEG adicional. Transfira o supernatante para outro tubo de centrífuga de 2 mL usando uma pipeta de 1.000 μL e repita a etapa de centrifugação para garantir a remoção completa de toda a PEG.
15. Concentre as partículas restantes dentro do supernascimento em novos tubos de centrífugas usando unidades de filtro centrífugas (corte de 100 kDa) através de várias rodadas de centrifugação a 14.000 x g em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos cada até atingir aproximadamente um quinto da concentração original (10 mL de solução de partícula-TES para cerca de 2 mL de partículas concentradas). As unidades de filtro vêm em tamanhos diferentes; selecionar o mais adequado para o número de amostras que estão sendo processadas. As unidades que se encaixam em tubos cônicos do tamanho de 15 mL são geralmente as mais apropriadas.
16. Resuspengem as partículas concentradas passando por uma agulha hipodérmica de 26 G e centrífuga a 14.000 x g em RT por 5 minutos para uma rodada final de remoção de PEG. Se o fluido ainda estiver nublado, repita até que todos os PEG precipitados sejam removidos.
17. Aliquot o supernatante viscoso em quantidades desejadas e armazene a -80 °C até estar pronto para uso.

5. Extração e quantificação do RNA do vírus

1. Extrair RNA de abelhas inteiras ou partículas de vírus concentrados usando qualquer método de extração de RNA apropriado (por exemplo, reagente de extração de RNA TRIzol seguido de tratamento DNase).
2. Quantifique os tituladores de vírus no inóculo gerados na etapa 5.1 via RT-qPCR, de preferência usando um método baseado em curva padrão que não depende da expressão genética hospedeira¹⁸, embora outros métodos também possam permitir estimativas.

6. Bioensaio alimentar viral

1. Prepare todos os materiais necessários para o bioensaudito antes da etapa de coleta de quadros (6.2) ou durante o período de emergência das abelhas de 24 horas (6.3).
   1. Prepare gaiolas limpas ou outros gabinetes capazes de abrigar o número de abelhas necessárias para o bioensaudito (por exemplo, gaiolas de caixa de acrílico medindo 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) conectando todos os orifícios do alimentador com um tubo de centrífuga de tamanho apropriado (Figura 3). Determine e randomize tratamentos entre as gaiolas e rotule cada uma com seu tratamento designado para fácil referência futura.
   2. Prepare as bandejas de inóculo rotulando barcos de pesagem individuais de médio porte com sua gaiola e tratamento correspondentes.
   3. Prepare a solução de alimentação misturando a quantidade adequada de sacarose com água deionizada (por exemplo, 300 g de sacarose por 1 L de água para uma solução de 30% de sacarose), certificando-se de esterilizar a água antes e depois de adicionar sacarose. A solução de sacarose estéril pode ser armazenada em uma geladeira de 4 °C por várias semanas, mas deve ser descartada se aparecer alguma nebulosidade.
   4. Prepare os tubos alimentador preenchendo parcialmente tubos de centrífugas de 15 mL com soluções de alimentação produzidas em 6.1.3, invertendo-os e cutucando 1-2 furos ao redor da ponta do tubo com uma tachinha. Os orifícios também podem ser derretidos usando uma agulha hipodérmica 18G aquecida sobre uma chama. Certifique-se de que as tampas do tubo do alimentador estão parafusadas com muita força, pois as tampas de encaixe solto podem causar vazamentos lentos que afogarão os habitantes da gaiola durante a noite.
      NOTA: As soluções de alimentação e o volume do tubo alimentador podem ser ajustados conforme necessário para atender às necessidades experimentais.
   5. Prepare uma coleção de recipientes para abelhas recém-emergidas, revestindo levemente as bordas de uma banheira grande com óleo vegetal ou uma substância gordurosa semelhante. Separadamente, prepare vários copos pequenos usando o mesmo método de revestimento.
2. Selecione e remova quadros de mel na ninhada de abelhas à beira do eclosão originado de pelo menos três colmeias separadas. Abelhas apropriadamente envelhecidas se assemelham a adultos totalmente pigmentados sob o tampa da célula do pente. Um sinal certo de emergência contínua é observar os habitantes das células lentamente mastigando seu caminho para fora e/ou células recentemente esvaziadas com marcas de mastigação irregulares características ao longo da tampa da cera.
   NOTA: A quantidade exata de quadros necessários dependerá do tamanho do experimento, da quantidade de ninhada emergente por quadro e da época do ano. Um quadro profundo langstroth padrão contém ~3.000 células de pente por lado; um quadro contendo principalmente pupas tampadas, com alguns emergentes observados pode facilmente produzir mais de 400 abelhas em 24 horas. Ajuste ao longo da estação, conforme necessário.
3. Escove todas as abelhas adultas antes de colocar as molduras em caixas de emergência e transferi-las para uma incubadora que corresponda às condições internas de uma colmeia (34 °C e 50% DE RH). Deixe as abelhas emergirem por 24 h.
4. Remova as caixas de emergência da incubadora e escove todas as abelhas recém-emergidas na banheira de coleta. Certifique-se de remover todas as abelhas das caixas de emergência também para evitar a inclusão de abelhas envelhecidas incorretamente em quaisquer escovas subsequentes. Qualquer abelha capaz de voar emergiu > 24 h atrás e deve ser excluída do bioensaio.
5. Produzir uma mistura homogeneizada de abelhas recém-emergidas misturando suavemente as abelhas na banheira de coleta à mão (elas não podem picar nesta idade) para minimizar os efeitos genéticos da colmeia de qualquer colônia individual. Para aplicações específicas, outros arranjos para a fonte da colônia podem ser desejáveis.
6. Conte 35 abelhas individuais, colocando cada uma na mesma xícara untada antes de transferir o conteúdo para uma gaiola de acrílico. Alternativamente, pode ser mais fácil separar múltiplos menores de abelhas em vários copos untados (por exemplo, 5 xícaras de 7 abelhas cada) para evitar erros de contagem errada. O número de abelhas utilizadas pode ser variado com base em necessidades e aplicações.
7. Transfira as gaiolas de abelhas para uma incubadora (34 °C e 50% RH), certificando-se de seguir a ordem de colocação aleatória criada em 6.1.1 para minimizar eventuais efeitos microclima.
8. Prepare o espaço de trabalho para o trabalho do vírus limpando todas as superfícies e pipetas com água alvejante, etanol e solução de inativação RNase antes de começar. Certifique-se de usar luvas de nitrito sempre que manusear partículas de vírus.
9. Prepare o inóculo do vírus de uma concentração desejada descongelando uma quantidade apropriada de partículas concentradas do vírus (etapa 4.17) e misturando-se completamente com solução suficiente de sacarose (passo 6.1.3) em um recipiente estéril. Para gaiolas de 35 abelhas, cada uma requer 600 μL de inóculo. Diluições seriais são recomendadas se a concentração do vírus desejado estiver em ou abaixo de 0,1%.
   1. Por exemplo, um experimento envolvendo 40 gaiolas que todos precisam de um inóculo de vírus de 1% exigirá 24 mL de solução de vírus, que pode ser criado combinando 240 μL de partículas de vírus concentradas com 23,76 mL de solução de sacarose. Recomenda-se incluir aproximadamente 15% de excesso no volume inicial, pois algumas perdas são esperadas com líquidos viscosos.
10. Coloque as bandejas de inóculo preparadas em 6.1.2 classificadas por tipo de tratamento e pipeta 600 μL do inóculo apropriado em cada bandeja.
    1. Insira cuidadosamente as bandejas inóculos em suas gaiolas correspondentes, tomando cuidado para não liberar acidentalmente nenhuma abelha. Aproveite esta oportunidade para escanear as abelhas e substituir qualquer um que possa ter morrido no processo de transferência.
11. Permitir o consumo completo do inócula (aproximadamente 12-14 h) antes de remover os tubos de centrífuga que bloqueiam o orifício superior do alimentador que insere os tubos alimentador apropriados preparados em 6.1.4. Isso ajuda a garantir que as abelhas na gaiola compartilhem o inóculo uniformemente em toda a população. A solução de sacarose é fornecida ad libitum e os tubos devem ser recarregados conforme necessário ao longo do experimento.
12. Regissuço a mortalidade dentro de cada gaiola em intervalos de 12h para as primeiras 72 horas de cada experimento, seguindo o qual muda a gravação para intervalos de 24h. Remova as abelhas mortas das gaiolas para aumentar a facilidade das contagens futuras, deslizando a porta da gaiola para cima o suficiente para um par de fórceps para alcançar e colher abelhas mortas. Certifique-se de esterilizar os fórceps sobre uma lâmpada de álcool entre as gaiolas para evitar a contaminação cruzada viral.
13. Amostra de abelhas para medidas de titer viral (5.1-5.2) selecionando acidentalmente espécimes vivos dentro de cada gaiola e colocando-as em tubos de centrífugas em gelo seco. Normalmente, três abelhas são suficientes para produzir medidas de titer virais a qualquer ponto de tempo sem também despovoar a gaiola.
14. Continue medições regulares de mortalidade pelo tempo que for necessário.

Resultados

Seguindo com sucesso os protocolos (Figuras 1) para injeção de pupal e extração viral devem produzir grandes quantidades de partículas de vírus. No entanto, a amostragem e a injeção de pupas provenientes de uma variedade de colônias em vários pontos de tempo maximiza as chances de adquirir vírus alvo com baixa contaminação. A dinâmica pela qual os vírus se replicam e interagem entre si dentro de uma abelha não é bem compreendida; juntamente com a probabilidade de infecção pré-existent...

Discussão

Aqui delineamos métodos detalhando cada etapa do processo de amplificação do vírus e preparação do estoque inóculo, incluindo coleta de larvas e propagação de vírus, extração e concentração, bem como tratamento viral na forma de experimentos de alimentação de gaiolas. Esses métodos permitem a produção de partículas de vírus semi-puros (Figura 4), da qual a eficácia pode ser quantificada consistentemente por testes de mortalidade por dose-resposta para vírus letais para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375