Préparation de l’inoculum enrichi en virus pour l’infection orale des abeilles mellifères (Apis mellifera)

Résumé

Nous décrivons ici deux protocoles: d’abord pour propager, extraire, purifier et quantifier de grandes quantités de particules virales non enveloppées d’abeilles mellifères, y compris une méthode pour éliminer les pupes d’abeilles mellifères et ensuite pour tester les effets de l’infection virale à l’aide d’un essai biologique en cage hautement reproductible et à haut débit.

Résumé

Les abeilles mellifères sont d’une grande importance écologique et agricole dans le monde entier, mais sont également soumises à diverses pressions qui affectent négativement la santé des abeilles, y compris l’exposition à des agents pathogènes viraux. De tels virus peuvent causer une grande variété d’effets dévastateurs et peuvent souvent être difficiles à étudier en raison de multiples facteurs qui rendent difficile la séparation des effets des traitements expérimentaux de l’infection de fond préexistante. Nous présentons ici une méthode pour produire en masse de grandes quantités de particules virales ainsi qu’un essai biologique à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. Rendues nécessaires par l’absence actuelle d’une lignée cellulaire continue et exempte de virus, les particules virales sont amplifiées in vivo à l’aide de pupes d’abeilles mellifères, qui sont extraites de la ruche en grands volumes en utilisant une méthodologie peu stressante. Ces particules virales peuvent ensuite être utilisées dans les essais biologiques en cage d’abeilles mellifères pour tester la viabilité de l’inocula, ainsi que diverses autres dynamiques d’infection virale, y compris les interactions avec la nutrition, les pesticides et d’autres agents pathogènes. Un avantage majeur de l’utilisation de telles particules est qu’elle réduit considérablement les chances d’introduire des variables inconnues dans les expérimentations ultérieures par rapport aux alternatives actuelles, telles que l’infection par l’hémolymphe ou l’homogénat d’abeille infectée, bien qu’il faille toujours faire attention lors de l’approvisionnement des abeilles, à minimiser la contamination virale de fond. Les essais en cage ne remplacent pas les expériences réalistes à grande échelle qui testent les effets de l’infection virale au niveau de la colonie, mais fonctionnent plutôt comme une méthode pour établir des réponses virales de base qui, en combinaison avec les particules virales semi-pures, peuvent servir d’outils importants pour examiner diverses dimensions des interactions physiologiques entre les abeilles mellifères et les virus.

Introduction

Les abeilles mellifères (Apis mellifera) jouent un rôle essentiel dans le paysage agricole mondial moderne, mais souffrent actuellement d’une combinaison de facteurs de stress biotiques et abiotiques, notamment l’exposition aux pesticides, le mauvais fourrage, les parasites et les agents pathogènes ^1,2. L’un des agents pathogènes les plus préoccupants sont les virus, dont beaucoup sont vecteurs par un autre des principaux facteurs de stress des abeilles mellifères, l’acarien parasite Varroa (Varroa destructor). Ces virus peuvent causer une série d’effets négatifs chez les abeilles mellifères, y compris une réduction de la survie de la couvée, des défauts de développement et une paralysie qui peuvent entraîner l’effondrement total de la ruche avant et après les périodes d’hivernage ^3,4,5. Bien qu’il y ait eu des progrès prometteurs dans le développement de technologies utilisées pour lutter contre l’infection virale 6,7,8,9, la dynamique par laquelle de nombreux virus se propagent, se propagent et interagissent au sein d’une abeille ou d’une colonie mellifère est encore mal comprise ^5,10 . Il est essentiel de comprendre la biologie de base des interactions entre les abeilles mellifères et les virus et leurs relations avec d’autres facteurs environnementaux pour mettre au point des techniques efficaces de gestion des virus.

Cependant, l’étude des interactions abeilles-virus pose des défis avec de nombreux facteurs connus et inconnus compliquant le processus. Il s’agit notamment des interactions avec ^{l’alimentation 11,12}, l’exposition^{aux pesticides 13} et le fond génétique des^{abeilles 14,15}. Même en se concentrant uniquement sur l’infection virale, les complications sont fréquentes parce que les populations d’abeilles mellifères, à la fois gérées et sauvages, ont toujours un certain degré d’infection virale de fond, bien que souvent sans manifester de symptômes aigus ^16,17, et les effets de la co-infection virale ne sont pas bien compris 18. Cela a rendu l’étude des effets du virus de l’abeille mellifère difficile à démêler.

De nombreuses études sur le virus de l’abeille mellifère ont utilisé des infections virales circonstancielles pour rechercher des interactions avec d’autres facteurs de stress, en observant comment les infections de fond changent avec d’autres traitements ^12,19,20,21. Bien que cette approche ait réussi à identifier des effets importants, en particulier la découverte de la façon dont les pesticides ou les traitements diététiques affectent les niveaux et la réplication du virus, l’inoculation avec un traitement par virus dont le contenu et la concentration connus est essentielle pour tester expérimentalement la dynamique de l’infection virale. Malgré cela, séparer le traitement expérimental de l’infection de fond peut également poser des défis. Dans les études sur le terrain, les chercheurs ont différencié les souches du virus des ailes déformées (DWV) pour fournir des preuves de la transmission du virus des abeilles mellifères aux bourdons²², mais l’utilisation de cette approche serait difficile chez les abeilles mellifères seules. Les clones infectieux de virus sont un outil puissant, non seulement pour le suivi de ^{l’infection 23,24,25}, mais aussi pour les études de génétique inverse des virus des abeilles mellifères et pour la recherche sur l’interaction virus-hôte 26,27,28. Cependant, dans la plupart des cas, des clones infectieux sont toujours nécessaires pour remplir le cycle d’infection à l’intérieur des cellules pour produire des particules. De telles particules sont préférées comme inocula pour les traitements expérimentaux parce que leur infectiosité est supérieure à celle de l’ARN viral nu et que l’inoculation avec des génomes encapsidés imite une infection naturelle.

La production d’inocula pur et non contaminé du virus de l’abeille mellifère (souches virales de type sauvage ou dérivées de clones infectieux) pose également des défis. Celles-ci sont principalement dues aux difficultés d’obtenir une lignée cellulaire d’abeilles mellifères fiable, se répliquant en continu et sans virus pour produire des virus de souche pure^29,30. Bien que certaines lignées cellulaires aient été produites, ces systèmes restent imparfaits; Néanmoins, il y a de l’espoir qu’une lignée cellulaire viable puisse être produite²⁹, ce qui permettrait un contrôle plus fin de la production et de l’investigation du virus. Jusqu’à ce qu’une telle ligne devienne largement disponible, la plupart des protocoles de production de virus continueront de reposer sur l’utilisation de la production et de la purification de virus in vivo 18,31,32,33,34. Ces approches consistent à identifier et à purifier les particules virales d’intérêt (ou à produire un clone infectieux) et à les utiliser pour infecter les abeilles mellifères, généralement sous forme de pupes. Les nymphes sont injectées avec le virus cible, puis sacrifiées, et d’autres particules sont extraites et purifiées. Cependant, comme aucune abeille n’est exempte de virus au départ, il y a toujours un certain degré de contamination par des traces d’autres virus dans un tel concentré et, par conséquent, il faut faire très attention au choix des abeilles présentant une faible probabilité d’infections de fond. En outre, les méthodes d’élimination des nymphes des cellules du peigne pour les utiliser dans ces protocoles³³ nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent induire un stress chez les abeilles, limitant la production par ces moyens^18,32. Ici, nous rapportons une méthode alternative qui permet l’élimination à grande échelle des larves avec peu de travail et moins de stress mécanique sur les abeilles.

Une fois que les nymphes sont obtenues et injectées avec l’inoculum du virus de départ, elles doivent être incubées pour donner au virus le temps de se répliquer. Par la suite, les particules virales produites peuvent être transformées en une forme utilisable pour infecter les abeilles expérimentales. Il existe plusieurs méthodes simples pour y parvenir, notamment l’utilisation d’un homogénat brut^35,36 ou d’une hémolymphe générée par des abeilles infectées par le virus comme source d’infection³⁷. Ces méthodes sont efficaces, mais elles ont plus de chances d’introduire des variables inconnues à partir du substrat de fond (p. ex., d’autres facteurs dans les homogénats d’abeilles mortes). De plus, il est souhaitable de concentrer les particules si une expérience nécessite de donner une forte dose connue d’un virus dans un court laps de temps. Par conséquent, pour un meilleur contrôle, il est préférable d’utiliser des méthodes qui permettent un certain niveau de purification et de concentration des particules virales. En général, une série d’étapes de précipitation et de centrifugation entraînera l’élimination de presque tout le matériel viral non ciblé possible³³.

Après avoir produit cet inoculum concentré, il est bénéfique de quantifier les titres viraux (qPCR) et de le caractériser avec des essais biologiques in vivo pour tester sa viabilité et sa capacité à causer la mortalité, ainsi que pour corroborer que des titres de virus accrus sont obtenus après l’infection. Cela peut être réalisé par des expériences d’injection (soit chez des pupes ou des adultes) ou des expériences d’alimentation (chez des larves ou des adultes). Bien que toutes ces approches soient possibles, nourrir des groupes d’abeilles adultes dans une cage est souvent le plus rapide et le plus simple. La méthode de dosage en cage est également largement utilisée pour tester divers autres traitements sur les abeilles, y compris la toxicité des pesticides³⁸, le développement des ovaires³⁹ et l’influence nutritionnelle sur le comportement^40,41 et, par conséquent, peut constituer une bonne base pour des expériences liant l’infection virale à d’autres facteurs⁴².

Nous décrivons ici une méthode fiable pour produire de grandes quantités de particules virales semi-pures et hautement enrichies sans utiliser une ultracentrifugeuse coûteuse, y compris une méthode d’élimination des pupes qui réduit le travail et le stress mécanique sur les abeilles et un essai biologique hautement reproductible et à haut débit pour tester l’infection virale et ses effets. En contrôlant étroitement la pureté de l’inocula viral, les chercheurs sont en mesure de réduire la variation de la réponse virale des abeilles mellifères par rapport à d’autres méthodes d’inoculation virale. En outre, le bioessai peut dépister les effets viraux au niveau de petits groupes à l’aide d’unités expérimentales hautement reproductibles avant d’être mis à l’échelle vers des paramètres réalistes sur le terrain, ce qui nécessite beaucoup plus de main-d’œuvre. En combinaison, ces deux méthodes fournissent les outils nécessaires pour les études qui peuvent aider à améliorer notre compréhension globale des interactions physiologiques abeilles-virus.

Protocole

1. Option d’extraction massive des abeilles 1 : auto-élimination larvaire

1. Mettez en cage une reine des abeilles sur un cadre Langstroth vide et étiré et ramenez-la dans sa colonie. Laissez la reine pondre des œufs sur ce cadre pendant 24 h.
   1. Vérifiez le cadre après 24 h pour vous assurer que la plupart des cellules du peigne contiennent des œufs nouvellement pondus. Selon la reine et la colonie, les œufs ne sont parfois pas très bien pondus dans les premières 24 heures. Si cela se produit, prévoyez 24 heures supplémentaires et ajustez le temps si nécessaire.
2. Après la période de ponte de 24 heures, relâchez la reine. Marquez clairement le cadre et retournez-le à la colonie.
3. Exactement 192 h (8 jours) après avoir mis la reine en cage (en supposant une ponte normale dans les 24 premières heures; 8 jours marquent le point juste avant la nymphose), retirez le cadre marqué de la colonie. Brossez toutes les abeilles adultes et transférez le cadre dans un incubateur correspondant aux conditions internes d’une ruche (34 °C et 50 % d’humidité relative (HR)).
   1. Vérifiez que la majeure partie du cadre est remplie de larves^du 5e stade, qui peuvent être reconnues par leurs grands corps blancs en forme de C pressés fermement contre les bords inférieurs des cellules du peigne. Il y aura probablement aussi quelques cellules déjà recouvertes d’un capuchon de cire, en particulier près du centre du cadre.
4. Préparez des récipients correspondant à la hauteur et à la largeur du cadre rempli de larves pour recevoir les larves du^{5e stade} en nettoyant soigneusement les surfaces intérieures et extérieures avec de l’eau et du savon, suivis d’une solution d’eau de Javel et enfin d’éthanol. Séchez soigneusement le récipient avant de continuer.
   1. Tapisser le fond des récipients de plusieurs couches d’essuie-tout. Ajoutez ensuite plusieurs couches superposées de lingettes nettoyantes plus fines et absorbantes (p. ex., essuie-glaces à tâche délicate) ou de papier filtre. Le matériau doit être absorbant. Évitez de chevaucher la couche supérieure pour améliorer la facilité de transfert futur des larves.
5. Placez les cadres face vers le bas (avec les larves focales tournées vers le bas) sur le dessus des récipients afin que les larves puissent tomber sur la couche de lingettes nettoyantes.
   1. Couvrez le récipient et le cadre avec un morceau de papier d’aluminium ou un autre revêtement de tente pour retenir l’humidité et renvoyer l’installation à l’incubateur. Laissez la configuration pendant la nuit. Les tendances naturelles à la recherche de nourriture des larves les feront ramper hors de leurs cellules et tomber sur la surface rembourrée en dessous.
6. Préparez des plateaux de transfert séparés en les nettoyant soigneusement en suivant les mêmes étapes que celles décrites au point 1.4. Laissez sécher les plateaux et superposez les fonds avec des lingettes nettoyantes. Les plateaux n’ont pas besoin de correspondre à des dimensions spécifiques, mais des plateaux moins profonds permettront des manipulations larvaires plus faciles.
   1. Commencez à transférer les larves des récipients vers les plateaux en soulevant soigneusement les lingettes individuelles de la couche supérieure dans les récipients et en versant doucement les larves sur les plateaux. Les larves devraient être tombées dans les récipients pendant la nuit, formant plusieurs masses collantes (Figure 1A).
   2. Utilisez des pinces souples émoussées pour séparer les larves et les disposer sur la surface des plateaux. Ils n’ont pas besoin d’être uniformément espacés et peuvent être proches les uns des autres, mais ne doivent pas se toucher. Voir la figure 1B pour une représentation visuelle des larves séparées.
   3. Profitez-en pour enlever toutes les larves endommagées (décolorées) ou de taille inférieure à la moyenne. Ceux-ci sont plus susceptibles de mourir pendant le processus de maturation et peuvent entraîner des infections / croissance fongique dans tout le plateau.
7. Couvrez le plateau avec du papier d’aluminium sous tente pour retenir l’humidité et remettre l’installation à l’incubateur.
8. Vérifiez les larves tous les jours et retirez celles qui sont décolorées (brun foncé ou noir).
   REMARQUE: Les larves / pré-pupes défèqueront sur les lingettes nettoyantes, se manifestant par de petites taches brunes. Ils peuvent également produire de petites quantités de sangles blanches et essuyantes dans le cadre de leur processus de capsulage. Aucun de ces événements ne nécessite le remplacement des lingettes nettoyantes, tant qu’elles sont absorbantes.
9. Permettre aux larves de se nymphoser et de mûrir jusqu’au stade des yeux blancs, qui peut être identifié par leur forme générale correspondant à celle d’une abeille adulte tout en manquant de pigmentation dans leurs yeux et dans la majeure partie du reste de leur corps. Cela devrait se produire entre 14 et 15 jours après la mise en cage de la reine. Les nymphes sont maintenant prêtes pour l’injection du virus. Figure 1C, 1D pour des exemples de pupes aux yeux blancs.

2. Option d’extraction massique des abeilles 2 : excision manuelle des nymphes

REMARQUE: Bien que l’option 2 (excision nymphale) soit une méthode viable d’extraction des abeilles, elle présente également plusieurs inconvénients par rapport à l’option 1 (auto-élimination larvaire). L’option 2 est beaucoup plus exigeante en main-d’œuvre, plus difficile à contrôler pour l’âge des nymphes et généralement plus stressante pour les abeilles elles-mêmes. L’option 1 est recommandée dans la mesure du possible.

1. Choisissez un cadre de couvée d’abeilles mellifères coiffées contenant des nymphes au stade de l’œil blanc ou à proximité (voir 1.9 pour une description) d’une colonie appropriée. Retirez le recouvrement des cellules de peigne situées près du centre et des bords du cadre pour confirmer la présence du stade de développement approprié.
2. Transférer le cadre dans un incubateur réglé à 34 °C et 50 % d’humidité relative. Retournez toujours le cadre à l’incubateur lorsqu’il n’est pas utilisé immédiatement.
3. Préparer et nettoyer les plateaux de transfert identiques à ceux décrits au point 1.6.
4. Retirez le cadre de l’incubateur et placez-le sur un support incliné sous une source lumineuse. Humidifiez une petite pile d’essuie-tout avec de l’eau.
5. Nettoyez une paire de pinces dures émoussées à l’aide d’éthanol. À l’aide de la pince propre, retirez le capuchon des cellules contenant des pupes aux yeux blancs, en prenant soin de ne pas endommager les nymphes dans le processus.
6. Une par une, extrayez doucement les pupes des cellules du peigne. Il est plus sûr de saisir les nymphes autour du thorax et de l’abdomen à l’aide des pointes de la pince, s’il y a suffisamment d’espace. Sinon, cependant, les nymphes peuvent également être enlevées en saisissant la tête et en la remuant lentement assez loin pour ensuite être saisies autour du corps.
   1. Couvrez les parties du cadre qui ne sont pas immédiatement accessibles avec des serviettes en papier humides pour retenir l’humidité. Retirer et remplacer si nécessaire pendant le processus d’excision.
7. Espacez les pupes excisées le long des lingettes nettoyantes dans les plateaux de transfert, en vous assurant qu’aucune d’entre elles ne se touche. Toute nymphe défigurée ou décolorée doit être jetée. Les nymphes sont maintenant prêtes pour l’injection de virus.
   1. Jeter les nymphes qui libèrent du liquide au contact des lingettes; ils ont probablement été perforés. Parfois, les nymphes présenteront de petites taches sombres de mélanisation près des points de contact avec la pince dans les 1 h suivant le retrait. Cela ne devrait pas affecter la survie. Si de grandes plaques de mélanisation apparaissent, les nymphes affectées doivent être jetées.

3. Injection du virus nymphal

REMARQUE : Si vous exécutez ce protocole pour la première fois (c.-à-d. sans stocks d’inocula viraux antérieurs), extrayez et concentrez d’abord les particules à l’aide d’adultes, de pupes ou de larves d’une colonie soupçonnée d’infection. Mesurez les titres viraux dans l’inocule résultante comme décrit à l’étape 5 et déterminez quelles particules propager davantage.

1. Stérilisez toutes les surfaces de travail à l’aide d’eau de Javel et d’éthanol avant de commencer à travailler avec les virus de l’abeille mellifère. Les gants en nitrile doivent être portés pendant tout le processus.
2. Préparer un appareil injecteur capable d’injecter du liquide en quantités d’environ 1 μL.
   REMARQUE: Une approche peu coûteuse mais efficace consisterait à créer un dispositif fait à la main en attachant une aiguille hypodermique de 30 G à l’extrémité d’une pointe de distributeur multiple de 100 μL (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’époxy flexible ou d’un autre adhésif liquide. Assurez-vous que les bords du capuchon de l’aiguille sont bien scellés contre l’extrémité du distributeur multiple et laissez l’appareil sécher. Voir la figure 2 pour une représentation visuelle d’un exemple d’appareil injecteur.
3. Préparer une solution de dilution par injection de virus en mélangeant le type de particules virales souhaité avec 1x PBS stérilisé (solution saline tamponnée au phosphate) dans un tube centrifugeur conique de 15 mL. La quantité totale nécessaire dépendra du nombre de nymphes qui doivent être injectées, chaque nymphe nécessitant une injection de 1 μL (par exemple, 500 pupes = 5 μL de particules virales + 495 μL de PBS).
4. Fixez l’appareil injecteur à une multi-pipette manuelle et testez l’efficacité en prélevant 100 μL d’eau dans un bécher séparé et en la distribuant à des doses de 1 μL. Assurez-vous que chaque quantité distribuée est égale, en échangeant l’appareil d’injection si nécessaire. Éliminez toute l’eau restante de l’injecteur.
5. Récupérez les plateaux de pupes générés à l’étape 1 ou à l’étape 2 de l’incubateur et retirez le revêtement en papier d’aluminium.
6. Nettoyez une paire de pinces dures émoussées à l’aide d’éthanol. Saisissez doucement la nymphe individuelle le long du thorax, en appliquant juste assez de pression pour forcer les fluides internes à l’abdomen. Cela devrait rendre les divisions tergites plus apparentes.
7. Prélever 100 μL de la solution de particules virales à l’aide de la pipette multiple, insérer l’aiguille entre les troisième et quatrième tergites abdominaux et injecter 1 μL de la solution virale. Répétez pour chaque nymphe disposée sur les plateaux, en prenant soin d’éviter les injections répétées. Toutes les nymphes endommagées pendant le processus doivent être jetées.
   ATTENTION : Tous les matériels liés à la préparation de virus sont désignés comme des risques biologiques et doivent être autoclavés et éliminés conformément aux lignes directrices de l’établissement. Les aiguilles doivent également être éliminées conformément aux directives de l’établissement.
8. Couvrez les plateaux de pupes injectées avec du papier d’aluminium et retournez à l’incubateur. Laissez les particules virales se propager dans les nymphes pendant 3 à 5 jours.
   1. Effectuez des inspections quotidiennes sur les nymphes et retirez tous les spécimens morts ou en décomposition pour prévenir l’accumulation de bactéries ou de champignons. De petits points de mélanisation peuvent apparaître au site d’injection sur l’abdomen, mais ne devraient pas affecter la survie.
9. Échantillonnez les nymphes dans des tubes centrifuges coniques de 50 mL et un vortex pour homogénéiser le contenu, en prenant soin d’échantillonner les nymphes dans des tubes par source de colonie afin de réduire la contamination par des virus non ciblés. Assurez-vous qu’il ne reste pas de nymphes entières et transférez les tubes dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la précipitation et la concentration de particules virales.

4. Concentration de particules virales

REMARQUE : Ce protocole n’a pas été testé pour la récupération des virus enveloppés.

1. Autoclavez tous les matériaux et récipients avant de les utiliser. Des gants en nitrile, des blouses de laboratoire et une protection oculaire doivent être portés pendant tout ce processus. Stérilisez toutes les surfaces de travail à l’aide d’eau de Javel, d’éthanol et d’une solution inactivatrice de RNase avant de commencer.
   1. Préparez 1x tampon TES (Tris-EDTA-sel) : Mélangez 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 2 mM EDTA et 150 mM NaCl. Stériliser par autoclavage.
2. Décongeler les pupes homogénéisées et les transférer dans des bouteilles de centrifugeuses. Ajouter environ trois volumes de 1x PBS (p. ex., ajouter un tube complet de pupes de 50 mL à 150 mL de 1x PBS) et égaliser les volumes à celui de la bouteille la plus pleine.
3. Mélanger d’abord à la main puis en le plaçant sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 10 min.
4. Centrifuger à 15 000 x g à 4 °C pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Répétez cette étape si nécessaire s’il reste des débris cellulaires.
   1. Si le surnageant a de gros globules de graisse flottant à la surface, filtrez à travers l’étamine dans des bouteilles de centrifugeuse stériles séparées avant de continuer.
5. Extraire le surnageant avec 0,3 volume de solution chloroforme:alcool isoamylique 24:1 (p. ex. 190 mL de surnageant + 57 mL de chloroforme:alcool isoamylique) et mélanger par inversion. Centrifuger à 21 000 x g à 4 °C pendant 20 min.
   ATTENTION : Évitez tout contact direct avec le chloroforme sur la peau ou les yeux. Portez toujours un EPI approprié. Tous les déchets de chloroforme doivent être éliminés conformément aux directives institutionnelles.
6. Récupérez la phase aqueuse de chaque bouteille en décant le surnageant dans des béchers stériles séparés de 500 mL dans un bain de glace ou dans une chambre froide à 4 °C. Prenez soin d’éviter de contaminer le surnageant avec du chloroforme, car cela rendra le processus de purification plus difficile; il vaut mieux perdre un peu de phase aqueuse.
7. Ajouter de l’eau sans RNase pour porter chaque bécher à un volume de 200 mL. Placez les béchers sur des plaques magnétiques et déposez-les dans une barre d’agitation de taille moyenne. Réglez les plaques pour qu’elles remuent à un réglage moyen-bas.
8. Ajouter lentement le NaCl à chaque bécher sous agitation douce constante, en portant chacun à une concentration finale de 2,3 % (p. ex., 4,6 g de NaCl par 200 mL de surnageant). Ajouter le polyéthylène glycol 8000 (PEG) à chaque bécher jusqu’à une concentration finale de 7 % (p. ex., 14 g de PEG par 200 mL de surnageant).
9. Couvrir les béchers avec du papier d’aluminium et continuer à remuer à une vitesse moyenne-basse sur de la glace ou dans une chambre froide pendant 1 à 5 h pour dissoudre le PEG. Plus on passe de temps à remuer, plus le PEG se dissout complètement.
10. Éteignez les plaques de remuage. Incuber les béchers couverts pendant 1 à 3 jours sur de la glace ou dans une chambre froide pour permettre aux particules virales et aux protéines de précipiter. Plus on passe de temps à incuber, plus il y a de particules qui vont précipiter.
11. Transférer le contenu de chaque bécher dans des bouteilles de centrifugeuse propres séparées et centrifuger à 15 000 x g à 4 °C pendant 30 min pour récupérer une pastille de particules PEG. Jetez le surnageant.
12. Grattez soigneusement les granulés de particules de PEG sur les côtés de la bouteille et remettez-les en suspension dans des volumes minimaux de 1x tampon TES à l’intérieur des béchers propres en ajoutant lentement de petites quantités de TES aux granulés (environ 10 mL pour 100 abeilles d’origine).
13. Passer la pastille en suspension à travers une aiguille de 18 G au moins dix fois avant de la citer dans des tubes centrifuges de 2 mL. Gardez tous les tubes sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour 4.14.
14. Centrifuger des tubes de 2 mL à 13 000 x g à 4 °C pendant 15 min pour éliminer le PEG supplémentaire. Transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugeuse de 2 mL à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et répéter l’étape de centrifugation pour assurer l’élimination complète de tout le PEG.
15. Concentrer les particules restantes dans le surnageant dans de nouveaux tubes centrifuges à l’aide d’unités de filtration centrifuge (coupure de 100 kDa) via plusieurs cycles de centrifugation à 14 000 x g à température ambiante (RT) pendant 10 min chacun jusqu’à atteindre environ un cinquième de la concentration initiale (10 mL de solution particule-TES à environ 2 mL de particules concentrées). Les unités de filtration sont disponibles en différentes tailles; sélectionnez le plus approprié pour le nombre d’échantillons traités. Les unités qui s’insèrent dans des tubes coniques de 15 mL sont généralement les plus appropriées.
16. Remettre en suspension les particules concentrées en passant à travers une aiguille hypodermique de 26 G et centrifuger à 14 000 x g à TA pendant 5 min pour une dernière série d’élimination du PEG. Si le liquide est encore trouble, répétez jusqu’à ce que tout le précipité de PEG soit retiré.
17. Aliquoter le surnageant visqueux dans les quantités souhaitées et conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

5. Extraction et quantification de l’ARN du virus

1. Extraire l’ARN d’abeilles entières ou de particules virales concentrées à l’aide de toute méthode d’extraction d’ARN appropriée (p. ex., réactif d’extraction d’ARN TRIzol suivi d’un traitement à la DNase).
2. Quantifier les titres de virus dans l’inoculum générés à l’étape 5.1 via la RT-qPCR, de préférence en utilisant une méthode basée sur une courbe standard qui ne repose pas sur l’expression du gène hôte¹⁸, bien que d’autres méthodes puissent également permettre des estimations.

6. Essai biologique sur l’alimentation virale

1. Préparer tout le matériel nécessaire pour l’essai biologique avant l’étape de collecte du cadre (6.2) ou pendant la période d’émergence des abeilles de 24 heures (6.3).
   1. Préparer des cages propres ou d’autres enclos capables d’accueillir le nombre d’abeilles nécessaires à l’essai biologique (p. ex., des cages en acrylique mesurant 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) en bouchant tous les trous d’alimentation avec un tube de centrifugeuse de taille appropriée (figure 3). Déterminez et randomisez les traitements parmi les cages et étiquetez chacune d’elles avec leur traitement désigné pour une référence future facile.
   2. Préparez les plateaux d’inoculum en étiquetant les bateaux de poids individuels de taille moyenne avec leur cage et leur traitement correspondants.
   3. Préparer la solution d’alimentation en mélangeant la quantité appropriée de saccharose avec de l’eau désionisée (p. ex., 300 g de saccharose par 1 L d’eau pour une solution de saccharose à 30 %), en veillant à stériliser l’eau avant et après l’ajout de saccharose. La solution de saccharose stérile peut être conservée dans un réfrigérateur à 4 °C pendant plusieurs semaines, mais doit être jetée si une nébulosité apparaît.
   4. Préparer les tubes d’alimentation en remplissant partiellement les tubes de centrifugeuse de 15 mL avec des solutions d’alimentation produites en 6.1.3, en les inversant et en perçant 1 à 2 trous autour de l’extrémité du tube avec un pouce. Les trous peuvent également être fondus à l’aide d’une aiguille hypodermique 18G chauffée au-dessus d’une flamme. Assurez-vous que les bouchons des tubes d’alimentation sont vissés très étroitement, car des bouchons lâches peuvent provoquer des fuites lentes qui noieront les habitants de la cage pendant la nuit.
      REMARQUE: Les solutions d’alimentation et le volume du tube d’alimentation peuvent être ajustés si nécessaire pour répondre aux besoins expérimentaux.
   5. Préparez une collection réceptive pour les abeilles nouvellement émergées en recouvrant légèrement les bords d’une grande baignoire d’huile végétale ou d’une substance grasse similaire. Séparément, préparez plusieurs petites tasses en utilisant la même méthode de revêtement.
2. Sélectionnez et retirez les cadres de couvée d’abeilles mellifères au bord de l’éclosion provenant d’au moins trois ruches distinctes. Les abeilles vieillies de manière appropriée ressemblent à des adultes entièrement pigmentés sous le capuchon cellulaire du peigne. Un signe certain de l’émergence continue est l’observation des habitants des cellules mâchant lentement leur sortie et / ou des cellules récemment vidées avec des marques de mastication déchiquetées caractéristiques le long du recouvrement de cire.
   REMARQUE: La quantité exacte de cadres requis dépendra de la taille de l’expérience, de la quantité de couvain émergente par image et de la période de l’année. Un cadre profond Langstroth standard contient environ 3 000 cellules de peigne par côté; un cadre contenant principalement des nymphes coiffées, dont certaines émergent observées, peut facilement produire plus de 400 abeilles en 24 h. Ajustez tout au long de la saison, au besoin.
3. Brossez toutes les abeilles adultes avant de placer les cadres dans des boîtes d’émergence et de les transférer dans un incubateur correspondant aux conditions internes d’une ruche (34 °C et 50 % HR). Laissez les abeilles émerger pendant 24 h.
4. Retirez les boîtes d’émergence de l’incubateur et brossez toutes les abeilles nouvellement émergées dans la baignoire de collecte. Assurez-vous également de retirer toutes les abeilles des boîtes d’émergence pour éviter l’inclusion d’abeilles mal vieillies dans les brossages ultérieurs. Toute abeille capable de voler a émergé > il y a 24 heures et devrait être exclue de l’essai biologique.
5. Produire un mélange homogénéisé d’abeilles nouvellement émergées en mélangeant doucement les abeilles dans la baignoire de collecte à la main (elles ne peuvent pas piquer à cet âge) pour minimiser les effets génétiques de la ruche de toute colonie individuelle. Pour des applications spécifiques, d’autres dispositions pour la source de la colonie peuvent être souhaitables.
6. Comptez 35 abeilles individuelles, en les plaçant chacune dans la même tasse graissée avant de transférer le contenu dans une cage en acrylique. Alternativement, il peut être plus facile de séparer les plus petits multiples d’abeilles en plusieurs gobelets graissés (par exemple, 5 tasses de 7 abeilles chacune) pour éviter les erreurs de comptage. Le nombre d’abeilles utilisées peut varier en fonction des besoins et des applications.
7. Transférer les cages des abeilles dans un incubateur (34 °C et 50 % HR), en veillant à suivre l’ordre de placement aléatoire créé dans le 6.1.1 pour minimiser les effets potentiels du microclimat.
8. Préparez l’espace de travail pour le travail de virus en nettoyant toutes les surfaces et les pipettes avec de l’eau de Javel, de l’éthanol et une solution d’inactivation de la RNase avant de commencer. Assurez-vous de porter des gants en nitrile lorsque vous manipulez des particules virales.
9. Préparer l’inoculum du virus à une concentration désirée en décongelant une quantité appropriée de particules virales concentrées (étape 4.17) et en mélangeant soigneusement avec une solution de saccharose suffisante (étape 6.1.3) dans un récipient stérile. Pour les cages de 35 abeilles, chacune nécessite 600 μL d’inoculum. Des dilutions en série sont recommandées si la concentration virale souhaitée est égale ou inférieure à 0,1 %.
   1. Par exemple, une expérience impliquant 40 cages qui ont toutes besoin d’un inoculum de virus à 1% nécessitera 24 mL de solution virale, qui peuvent être créées en combinant 240 μL de particules virales concentrées avec 23,76 mL de solution de saccharose. Il est recommandé d’inclure environ 15% d’excédent dans le volume initial, car certaines pertes sont à prévoir avec des liquides visqueux.
10. Disposer les plateaux d’inoculum préparés au point 6.1.2 triés par type de traitement et pipeter 600 μL de l’inoculum approprié sur chaque plateau.
    1. Insérez soigneusement les plateaux d’inoculum dans leurs cages correspondantes, en prenant soin de ne pas relâcher accidentellement les abeilles. Profitez de cette occasion pour scanner les abeilles et remplacer celles qui pourraient être mortes au cours du processus de transfert.
11. Prévoir la consommation complète de l’inocula (environ 12-14 h) avant de retirer les tubes de centrifugeuse bloquant le trou d’alimentation supérieur en insérant les tubes d’alimentation appropriés préparés au point 6.1.4. Cela permet de s’assurer que les abeilles dans la cage partagent l’inoculum uniformément à travers la population. La solution de saccharose est fournie ad libitum et les tubes doivent être remplis au besoin tout au long de l’expérience.
12. Enregistrez la mortalité dans chaque cage à des intervalles de 12 h pendant les 72 premières heures de chaque expérience, après quoi l’enregistrement est passé à des intervalles de 24 heures. Retirez les abeilles mortes des cages pour augmenter la facilité des comptages futurs en faisant glisser la porte de la cage juste assez loin pour qu’une paire de pinces puisse atteindre et ramasser les abeilles mortes. Assurez-vous de stériliser les pinces au-dessus d’une lampe à alcool entre les cages pour éviter la contamination croisée virale.
13. Échantillonnez les abeilles pour les mesures de titres viraux (5.1-5.2) en sélectionnant au hasard des spécimens vivants dans chaque cage et en les plaçant dans des tubes centrifuges sur de la glace carbonique. En règle générale, trois abeilles suffisent pour produire des mesures de titre viral à un moment donné sans dépeupler également la cage.
14. Poursuivre les mesures régulières de la mortalité aussi longtemps que nécessaire.

Résultats

Le respect réussi des protocoles (figures 1) pour l’injection nymphale et l’extraction virale devrait produire de grandes quantités de particules virales. Cependant, l’échantillonnage et l’injection de pupes provenant de diverses colonies à plusieurs moments maximisent les chances d’acquérir le virus cible avec une faible contamination. La dynamique par laquelle les virus se répliquent et interagissent les uns avec les autres au sein d’une abeille mellifère n’est pas bien comprise; e...

Discussion

Ici, nous avons décrit des méthodes détaillant chaque étape du processus d’amplification du virus et de préparation du stock d’inoculum, y compris la collecte des larves et la propagation, l’extraction et la concentration du virus, ainsi que le traitement viral sous la forme d’expériences d’alimentation en cage. Ces méthodes permettent de produire des particules virales semi-pures (figure 4), dont l’efficacité peut être quantifiée de manière cohérente par des tests de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375