Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)

Resumen

Aquí describimos dos protocolos: primero para propagar, extraer, purificar y cuantificar grandes cantidades de partículas de virus no envueltas de abejas melíferas, incluido un método para eliminar las pupas de abejas melíferas y segundo para probar los efectos de la infección viral utilizando un bioensayo de jaula altamente repetible y de alto rendimiento.

Resumen

Las abejas melíferas son de gran importancia ecológica y agrícola en todo el mundo, pero también están sujetas a una variedad de presiones que afectan negativamente la salud de las abejas, incluida la exposición a patógenos virales. Tales virus pueden causar una amplia variedad de efectos devastadores y, a menudo, pueden ser difíciles de estudiar debido a múltiples factores que dificultan la separación de los efectos de los tratamientos experimentales de la infección de fondo preexistente. Aquí presentamos un método para producir en masa grandes cantidades de partículas de virus junto con un bioensayo de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Necesarias por la falta actual de una línea celular de abejas melíferas continua y libre de virus, las partículas virales se amplifican in vivo utilizando pupas de abejas melíferas, que se extraen de la colmena en grandes volúmenes utilizando una metodología mínimamente estresante. Estas partículas de virus se pueden usar en bioensayos de jaulas de abejas melíferas para probar la viabilidad de los inóculos, así como varias otras dinámicas de infección por virus, incluidas las interacciones con la nutrición, los pesticidas y otros patógenos. Una ventaja importante del uso de tales partículas es que reduce en gran medida las posibilidades de introducir variables desconocidas en la experimentación posterior en comparación con las alternativas actuales, como la infección a través de la hemolinfa de abeja infectada u homogeneización, aunque aún se debe tener cuidado al obtener las abejas, para minimizar la contaminación del virus de fondo. Los ensayos en jaulas no son un sustituto de los experimentos a gran escala y realistas en el campo que prueban los efectos de la infección por virus a nivel de colonia, sino que funcionan como un método para establecer respuestas virales de referencia que, en combinación con las partículas de virus semipuras, pueden servir como herramientas importantes para examinar varias dimensiones de las interacciones fisiológicas entre la abeja melífera y el virus.

Introducción

Las abejas melíferas (Apis mellifera) desempeñan un papel fundamental en el panorama agrícola mundial moderno, pero actualmente sufren de una combinación de factores estresantes bióticos y abióticos, incluida la exposición a pesticidas, forraje deficiente, parásitos y patógenos ^1,2. Uno de los patógenos más importantes de preocupación son los virus, muchos de los cuales son vectorizados por otro de los principales factores estresantes de las abejas melíferas, el ácaro parásito Varroa (Varroa destructor). Estos virus pueden causar una serie de efectos negativos en las abejas melíferas, incluida la reducción de la supervivencia de la cría, los defectos de desarrollo y la parálisis que pueden conducir al colapso total de la colmena tanto antes como después de los períodos de hibernación ^3,4,5. Aunque ha habido avances prometedores en el desarrollo de tecnologías utilizadas para combatir la infección por virus 6,7,8,9, la dinámica por la cual muchos virus se propagan, propagan e interactúan dentro de una abeja melífera o colonia aún no se conocen ^5,10 . Comprender la biología básica de las interacciones entre las abejas melíferas y los virus y sus relaciones con otros factores ambientales es fundamental para desarrollar técnicas efectivas de manejo de virus.

Sin embargo, el estudio de las interacciones entre la abeja melífera y el virus plantea desafíos con numerosos factores conocidos y desconocidos que complican el proceso. Estos incluyen interacciones con la dieta^11,12, exposición a pesticidas¹³ y antecedentes genéticos de^{abejas 14,15}. Incluso cuando se centra solo en la infección por virus, las complicaciones son comunes porque las poblaciones de abejas melíferas, tanto manejadas como silvestres, siempre tienen algún grado de infección por virus de fondo, aunque a menudo sin manifestar síntomas agudos ^16,17, y los efectos de la coinfección por virus no se comprenden bien¹⁸. Esto ha hecho que el estudio de los efectos del virus de la abeja melífera sea difícil de desentrañar.

Muchos estudios sobre el virus de las abejas melíferas han utilizado infecciones por virus circunstanciales para buscar interacciones con otros factores estresantes, observando cómo cambian las infecciones de fondo con otros tratamientos 12,19,20,21. Si bien este enfoque ha tenido éxito en la identificación de efectos importantes, especialmente al descubrir cómo los pesticidas o los tratamientos dietéticos afectan los niveles de virus y la replicación, la inoculación con un tratamiento de virus de contenido y concentración conocidos es fundamental para las pruebas experimentales de la dinámica de la infección por virus. Aun así, separar el tratamiento experimental de la infección de fondo también puede plantear desafíos. En estudios de campo, los investigadores han diferenciado cepas del virus del ala deformada (DWV) para proporcionar evidencia de la transmisión del virus de las abejas melíferas a los abejorros²², pero el uso de este enfoque sería difícil solo dentro de las abejas melíferas. Los clones infecciosos de virus son una herramienta poderosa, no solo para rastrear la infección 23,24,25, sino también para estudios de genética inversa de virus de abejas melíferas y para la investigación de la interacción virus-huésped 26,27,28. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los clones infecciosos todavía son necesarios para cumplir con el ciclo de infección dentro de las células para producir partículas. Tales partículas se prefieren como inóculo para tratamientos experimentales porque su infectividad es mayor que el ARN viral desnudo y la inoculación con genomas encapsidados imita una infección natural.

La producción de inóculos puros y no contaminados del virus de las abejas melíferas (cepas de virus de tipo silvestre o derivadas de clones infecciosos) también plantea desafíos. Estos se deben principalmente a las dificultades para obtener una línea celular de abeja melífera confiable, de replicación continua y libre de virus para producir virus de cepa pura^29,30. Si bien se han producido algunas líneas celulares, estos sistemas siguen siendo imperfectos; Aún así, existe la esperanza de que se pueda producir una línea celular viable²⁹, lo que permitiría un control más fino de la producción e investigación del virus. Hasta que dicha línea esté ampliamente disponible, la mayoría de los protocolos de producción de virus seguirán dependiendo del uso de la producción y purificación de virus in vivo 18,31,32,33,34. Estos enfoques implican identificar y purificar partículas de virus de interés (o producir un clon infeccioso) y usarlas para infectar a las abejas melíferas, generalmente como pupas. Las pupas se inyectan con el virus objetivo y luego se sacrifican, y se extraen y purifican más partículas. Sin embargo, debido a que ninguna abeja está libre de virus para empezar, siempre hay algún grado de contaminación por rastros de otros virus en cualquier concentrado de este tipo y, por lo tanto, se debe tener mucho cuidado al elegir abejas con una baja probabilidad de infecciones de fondo. Además, los métodos para eliminar las pupas de las células del peine para su uso en estos protocolos³³ son muy laboriosos y pueden inducir estrés en las abejas, limitando la producción por estos medios^18,32. Aquí, informamos un método alternativo que permite la eliminación a gran escala de larvas con poca mano de obra y menos estrés mecánico en las abejas.

Una vez que se obtienen las pupas y se inyectan con el inóculo del virus inicial, deben incubarse para proporcionar tiempo al virus para replicarse. Posteriormente, las partículas de virus producidas pueden procesarse en una forma utilizable para infectar abejas experimentales. Existen varios métodos simples para lograr esto, incluido el uso de un homogeneizado crudo^35,36 o hemolinfa generada a partir de abejas infectadas viralmente como fuente de infección³⁷. Estos métodos son efectivos, pero tienen una mayor probabilidad de introducir variables desconocidas del sustrato de fondo (por ejemplo, otros factores en los homogeneizados de las abejas muertas). Además, es deseable concentrar las partículas si un experimento requiere administrar una dosis grande y conocida de un virus en un corto período de tiempo. Por lo tanto, para un mejor control, es preferible utilizar métodos que permitan cierto nivel de purificación y concentración de las partículas del virus. En general, una serie de pasos de precipitación y centrifugación darán como resultado la eliminación de casi todo el posible material de virus no objetivo³³.

Después de producir este inóculo concentrado, es beneficioso cuantificar los títulos virales (qPCR) y caracterizarlo con bioensayos in vivo para probar su viabilidad y capacidad de causar mortalidad, así como para corroborar que se obtienen títulos de virus aumentados después de la infección. Esto se puede lograr a través de experimentos de inyección (ya sea en pupas o adultos) o experimentos de alimentación (en larvas o adultos). Si bien todos estos enfoques son posibles, alimentar a grupos de abejas adultas en una jaula es a menudo lo más rápido y simple. El método de ensayo de jaula también se usa ampliamente para probar varios otros tratamientos en abejas, incluida la toxicidad por pesticidas³⁸, el desarrollo de^{ovarios 39} y la influencia nutricional en el comportamiento^40,41 y, por lo tanto, puede formar una buena base para experimentos que vinculan la infección por virus con otros factores⁴².

Aquí describimos un método confiable para producir grandes cantidades de partículas de virus semipuras y altamente enriquecidas sin usar una costosa ultracentrífuga, incluido un método para eliminar pupas que reduce el trabajo de parto y el estrés mecánico en las abejas y un bioensayo altamente repetible y de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Al controlar estrechamente la pureza del inóculo viral, los investigadores pueden reducir la variación en la respuesta viral de las abejas melíferas en relación con otros métodos de inoculación viral. Además, el bioensayo puede detectar efectos virales a nivel de grupos pequeños utilizando unidades experimentales altamente repetibles antes de escalar a entornos realistas de campo, lo que es mucho más laborioso de manejar. En combinación, estos dos métodos proporcionan las herramientas necesarias para los estudios que pueden ayudar a mejorar nuestra comprensión general de las interacciones fisiológicas entre las abejas melíferas y los virus.

Protocolo

1. Opción de extracción masiva de abejas 1: autoeliminación de larvas

1. Enjaula a una reina abeja melífera en un marco langstroth vacío y prolongado y devuélvela a su colonia. Deje que la reina ponga huevos en este marco durante 24 h.
   1. Revise el marco después de 24 h para asegurarse de que la mayoría de las células del peine contengan huevos recién puestos. Dependiendo de la reina y la colonia, los huevos a veces no se ponen muy bien en las primeras 24 h. Si esto ocurre, espere 24 horas adicionales y ajuste el tiempo según sea necesario.
2. Después del período de puesta de huevos de 24 h, libere a la reina. Marque el marco claramente y devuélvalo a la colonia.
3. Exactamente 192 h (8 días) después de enjaular a la reina (suponiendo la puesta normal de huevos dentro de las primeras 24 h; 8 días marca el punto justo antes de la pupación), retire el marco marcado de la colonia. Cepille todas las abejas adultas y transfiera el marco a una incubadora que coincida con las condiciones internas de una colmena (34 ° C y 50% de humedad relativa (HR)).
   1. Verifique que la mayor parte del marco esté lleno de larvas de^5º instar, que se pueden reconocer por sus cuerpos grandes, blancos y en forma de C presionados firmemente contra los bordes inferiores de las celdas del peine. Es probable que también haya algunas células ya cubiertas por una tapa de cera, especialmente cerca del centro del marco.
4. Prepare recipientes que coincidan con la altura y el ancho del marco lleno de larvas para recibir las larvas de^5º instar limpiando a fondo las superficies internas y externas con agua y jabón, seguido de una solución de lejía y, finalmente, etanol. Seque bien el recipiente antes de continuar.
   1. Forra la parte inferior de los recipientes con varias capas de toallas de papel. Luego agregue varias capas superpuestas de toallitas de limpieza más delgadas y absorbentes (por ejemplo, limpiaparabrisas de tareas delicadas) o papel de filtro. El material debe ser absorbente. Evite superponer la capa superior para mejorar la facilidad de la futura transferencia larvaria.
5. Coloque los marcos boca abajo (con las larvas focales hacia abajo) en la parte superior de los recipientes para que las larvas puedan caer sobre la capa de toallitas de limpieza.
   1. Cubra el recipiente y el marco con una pieza de papel de aluminio u otra cubierta para retener la humedad y devolver la configuración a la incubadora. Deje la configuración durante la noche. Las tendencias naturales de búsqueda de alimentos de las larvas harán que se arrastren fuera de sus células y caigan sobre la superficie acolchada de abajo.
6. Prepare bandejas de transferencia separadas limpiándolas a fondo siguiendo los mismos pasos detallados en 1.4. Deje que las bandejas se sequen y cubra los fondos con toallitas de limpieza. Las bandejas no necesitan coincidir con ninguna dimensión específica, pero las bandejas menos profundas permitirán manipulaciones larvales más fáciles.
   1. Comience a transferir las larvas de los contenedores a las bandejas levantando cuidadosamente las toallitas individuales de la capa superior de los recipientes y vertiendo suavemente las larvas en las bandejas. Las larvas deberían haber caído en los recipientes durante la noche, formando varias masas pegajosas (Figura 1A).
   2. Use pinzas blandas romas para separar las larvas y colocarlas en la superficie de las bandejas. No necesitan estar espaciados uniformemente y pueden estar cerca el uno del otro, pero no deben tocarse. Consulte la Figura 1B para obtener una representación visual de larvas separadas.
   3. Aproveche esta oportunidad para eliminar cualquier larva dañada (descolorida) o de tamaño inferior a la media. Estos tienen más probabilidades de morir durante el proceso de maduración y pueden traer infecciones / crecimiento de hongos en toda la bandeja.
7. Cubra la bandeja con papel de aluminio para retener la humedad y devuelva la configuración a la incubadora.
8. Revise las larvas diariamente y elimine las que estén descoloridas (marrón oscuro o negro).
   NOTA: Las larvas / pre-pupas defecarán en las toallitas de limpieza, manifestándose como pequeñas manchas marrones. También pueden producir pequeñas cantidades de correas blancas y tenues como parte de su proceso de tapado. Ninguna de estas ocurrencias requiere el reemplazo de las toallitas de limpieza, siempre y cuando sean absorbentes.
9. Permita que las larvas pupen y maduren hasta la etapa de ojos blancos, que se puede identificar por su forma general que coincide con la de una abeja adulta mientras aún carece de pigmentación en sus ojos y en la mayor parte del resto de su cuerpo. Esto debe ocurrir entre 14 y 15 días después de la jaula de la reina. Las pupas ya están listas para la inyección del virus. Figura 1C, 1D para ejemplos de pupas de ojos blancos.

2. Opción de extracción masiva de abejas 2: escisión manual de pupas

NOTA: Aunque la opción 2 (escisión de pupas) es un método viable de extracción de abejas, también presenta varios inconvenientes en comparación con la opción 1 (autoeliminación de larvas). La opción 2 es mucho más intensiva en mano de obra, más difícil de controlar para la edad de las pupas y, en general, más estresante para las propias abejas. Se recomienda la opción 1 siempre que sea posible.

1. Seleccione un marco de cría de abeja melífera tapada que contenga pupas en o cerca de la etapa de ojos blancos (consulte 1.9 para una descripción) de una colonia adecuada. Retire la tapa de las celdas del peine ubicadas cerca del centro y los bordes del marco para confirmar la presencia de la etapa de desarrollo adecuada.
2. Transfiera el marco a una incubadora a 34 °C y 50% de humedad relativa. Siempre devuelva el marco a la incubadora cuando no esté en uso inmediato.
3. Preparar y limpiar bandejas de transferencia idénticas a las descritas en 1.6.
4. Retire el marco de la incubadora y colóquelo en un soporte en ángulo debajo de una fuente de luz. Humedezca una pequeña pila de toallas de papel con agua.
5. Limpie un par de pinzas duras romas con etanol. Usando las pinzas limpias, retire la tapa de las células que contienen pupas de ojos blancos, teniendo cuidado de no dañar las pupas en el proceso.
6. Uno por uno, extirpe suavemente las pupas de las células del peine. Es más seguro agarrar las pupas alrededor del tórax y el abdomen usando las puntas de las pinzas, si hay suficiente espacio. Sin embargo, si no es así, las pupas también se pueden eliminar agarrando la cabeza y moviéndola lentamente lo suficiente como para luego agarrarla alrededor del cuerpo.
   1. Cubra las partes del marco a las que no se accede inmediatamente con toallas de papel mojadas para retener la humedad. Retire y reemplace según sea necesario durante el proceso de escisión.
7. Espacie las pupas extirpadas a lo largo de las toallitas de limpieza en las bandejas de transferencia, asegurándose de que ninguna de ellas se toque. Cualquier pupa desfigurada o descolorida debe ser descartada. Las pupas ya están listas para la inyección del virus.
   1. Deseche las pupas que liberan líquido al entrar en contacto con las toallitas; es probable que hayan sido perforados. A veces, las pupas exhibirán pequeñas manchas oscuras de melanización cerca de los puntos de contacto con los fórceps dentro de 1 h después de la eliminación. Esto no debería afectar la supervivencia. Si aparecen parches grandes de melanización, las pupas afectadas deben descartarse.

3. Inyección del virus pupal

NOTA: Si realiza este protocolo por primera vez (es decir, sin existencias previas de inóculos virales), primero extraiga y concentre partículas utilizando adultos, pupas o larvas de una colonia con sospecha de infección. Mida los títulos virales en el inóculo resultante como se describe en el paso 5 y determine qué partículas propagar más.

1. Esterilice todas las superficies de trabajo con agua de lejía y etanol antes de comenzar a trabajar con los virus de las abejas melíferas. Los guantes de nitrilo deben usarse durante todo el proceso.
2. Prepare un aparato inyector capaz de inyectar líquido en cantidades de ~1 μL.
   NOTA: Un enfoque económico pero efectivo sería crear un dispositivo hecho a mano uniendo una aguja hipodérmica de 30 G a la punta de una punta multisistedor de 100 μL (consulte la Tabla de materiales) utilizando epoxi flexible u otro adhesivo líquido. Asegúrese de que los bordes de la tapa de la aguja estén sellados herméticamente contra la punta del dispensador múltiple y permita que el aparato se seque. Consulte la Figura 2 para una representación visual de un aparato inyector de ejemplo.
3. Prepare una solución de dilución por inyección de virus mezclando el tipo deseado de partículas de virus con 1x PBS esterilizado (solución salina tamponada con fosfato) en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml. La cantidad total necesaria dependerá del número de pupas que deban inyectarse, y cada pupa requerirá una inyección de 1 μL (por ejemplo, 500 pupas = 5 μL de partículas de virus + 495 μL de PBS).
4. Conecte el aparato inyector a una multipipeta manual y pruebe la eficacia extrayendo 100 μL de agua de un vaso de precipitados separado y dispensándolo en dosis de 1 μL. Asegúrese de que cada cantidad dispensada sea igual, intercambiando el aparato inyector según sea necesario. Limpie el agua restante del inyector.
5. Recupere las bandejas de pupas generadas en el paso 1 o paso 2 de la incubadora y retire la cubierta de papel de aluminio.
6. Limpie un par de pinzas duras romas con etanol. Agarre suavemente la pupa individual a lo largo del tórax, aplicando la presión suficiente para forzar los fluidos internos al abdomen. Esto debería hacer que las divisiones tergitas sean más evidentes.
7. Extraiga 100 μL de la solución de partículas de virus utilizando la pipeta múltiple, inserte la aguja entre el tercer y cuarto tergites abdominales e inyecte 1 μL de la solución de virus. Repita para cada pupa colocada en las bandejas, teniendo cuidado de evitar la repetición de las inyecciones. Cualquier pupa dañada durante el proceso debe ser descartada.
   PRECAUCIÓN: Todos los materiales relacionados con la preparación del virus se designan como riesgos biológicos y deben ser esterilizados en autoclave y eliminados siguiendo las pautas institucionales. Las agujas también deben desecharse siguiendo las pautas institucionales.
8. Cubra las bandejas de pupas inyectadas con papel de aluminio y vuelva a la incubadora. Permita que las partículas del virus se propaguen dentro de las pupas durante 3-5 días.
   1. Realice inspecciones diarias en las pupas y elimine cualquier muestra muerta o podrida para prevenir la acumulación de bacterias o hongos. Pueden aparecer pequeños puntos de melanización en el lugar de la inyección en el abdomen, pero no deben afectar la supervivencia.
9. Muestree las pupas en tubos de centrífuga cónica de 50 ml y vórtice para homogeneizar el contenido, teniendo cuidado de muestrear pupas en tubos por fuente de colonia para reducir la contaminación de virus no objetivo. Asegúrese de que no queden pupas enteras y transfiera los tubos a un congelador de -80 °C hasta que estén listos para la precipitación y concentración de partículas de virus.

4. Concentración de partículas de virus

NOTA: Este protocolo no se ha probado para la recuperación de virus envueltos.

1. Autoclave todos los materiales y contenedores antes de usarlos. Se deben usar guantes de nitrilo, batas de laboratorio y protección ocular durante todo este proceso. Esterilice todas las superficies de trabajo con agua de lejía, etanol y solución inactivadora de RNasa antes de comenzar.
   1. Prepare 1x tampón TES (Tris-EDTA-salt): Mezcle 10 mM Tris-HCL pH 7.5, 2 mM EDTA y 150 mM NaCl. Esterilizar en autoclave.
2. Descongele las pupas homogeneizadas y transfiéralas a las botellas de centrífuga. Agregue aproximadamente tres volúmenes de 1x PBS (por ejemplo, agregue un tubo completo de 50 ml de pupas a 150 ml de 1x PBS) e iguale los volúmenes a los de la botella más llena.
3. Mezclar primero a mano y luego colocando en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Centrifugar a 15.000 x g a 4 °C durante 5 min para eliminar los residuos celulares. Repita este paso según sea necesario si quedan restos celulares.
   1. Si el sobrenadante tiene grandes glóbulos de grasa flotando en la superficie, filtre a través de la gasa en botellas de centrífuga estériles separadas antes de continuar.
5. Extraer el sobrenadante con 0,3 volúmenes de cloroformo 24:1:solución de alcohol isoamílico (por ejemplo, 190 ml de sobrenadante + 57 ml de cloroformo:alcohol isoamílico) y mezclar por inversión. Centrifugadora a 21.000 x g a 4 °C durante 20 min.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto directo con cloroformo en la piel o los ojos. Siempre use el EPP adecuado. Todos los residuos de cloroformo deben eliminarse siguiendo las directrices institucionales.
6. Recupere la fase acuosa de cada botella decantando el sobrenadante en vasos de precipitados estériles separados de 500 ml en un baño de hielo o en una cámara frigorífica de 4 °C. Tenga cuidado de evitar contaminar el sobrenadante con cloroformo, ya que dificultará el proceso de purificación; es mejor perder un poco de fase acuosa.
7. Agregue agua libre de RNasa para llevar cada vaso de precipitados hasta un volumen de 200 ml. Coloque los vasos de precipitados en placas de agitación magnéticas y deje caer en una barra de agitación de tamaño mediano. Coloque las placas para que se revuelvan a un ajuste medio-bajo.
8. Agregue lentamente NaCl a cada vaso de precipitados bajo una agitación suave y constante, llevando cada uno a una concentración final de 2.3% (por ejemplo, 4.6 g de NaCl por 200 mL de sobrenadante). Añadir polietilenglicol 8000 (PEG) a cada vaso de precipitados hasta una concentración final del 7% (por ejemplo, 14 g de PEG por 200 ml del sobrenadante).
9. Cubra los vasos de precipitados con papel de aluminio y continúe revolviendo a una velocidad media-baja sobre hielo o en una cámara frigorífica durante 1-5 h para disolver el PEG. Cuanto más tiempo se dedique a agitar, más a fondo se disolverá el PEG.
10. Apague las placas de agitación. Incubar los vasos de precipitados cubiertos durante 1-3 días en hielo o en una cámara frigorífica para permitir que las partículas de virus y las proteínas precipiten. Cuanto más tiempo se dedique a la incubación, más partículas precipitarán.
11. Transfiera el contenido de cada vaso de precipitados a botellas de centrífuga limpias separadas y centrífuga a 15.000 x g a 4 °C durante 30 minutos para recuperar un pellet de partículas PEG. Deseche el sobrenadante.
12. Raspe cuidadosamente el pellet de partículas PEG de los lados de la botella y resuspóndalos en volúmenes mínimos de 1x tampón TES dentro de vasos de precipitados limpios agregando lentamente pequeñas cantidades de TES a los gránulos (aproximadamente 10 ml por cada 100 abejas originales).
13. Pase el gránulo suspendido a través de una aguja de 18 G al menos diez veces antes de alícuota en tubos de centrífuga de 2 ml. Mantenga todos los tubos en hielo hasta que estén listos para las 4.14.
14. Centrífuga de 2 ml de tubos a 13.000 x g a 4 °C durante 15 min para eliminar peg adicional. Transfiera el sobrenadante a otro tubo centrífugo de 2 ml utilizando una pipeta de 1.000 μL y repita el paso de centrifugación para garantizar la eliminación completa de todo el PEG.
15. Concentre las partículas restantes dentro del sobrenadante en nuevos tubos de centrífuga utilizando unidades de filtro centrífugo (corte de 100 kDa) a través de varias rondas de centrifugación a 14.000 x g a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos cada una hasta alcanzar aproximadamente una quinta parte de la concentración original (10 ml de solución de partículas-TES a aproximadamente 2 ml de partículas concentradas). Las unidades de filtro vienen en diferentes tamaños; seleccionar la más adecuada para el número de muestras que se están procesando. Las unidades que caben en tubos cónicos de 15 ml suelen ser las más adecuadas.
16. Resuspend las partículas concentradas pasando a través de una aguja hipodérmica de 26 G y centrífuga a 14,000 x g a RT durante 5 min para una ronda final de eliminación de PEG. Si el líquido todavía está turbio, repita hasta que se elimine todo el precipitado de PEG.
17. Alícuota el sobrenadante viscoso en las cantidades deseadas y guárdelo a -80 °C hasta que esté listo para su uso.

5. Extracción y cuantificación de ARN del virus

1. Extraiga arnés de abejas enteras o partículas de virus concentradas utilizando cualquier método de extracción de ARN apropiado (por ejemplo, reactivo de extracción de ARN TRIzol seguido de tratamiento con DNasa).
2. Cuantificar los títulos de virus en el inóculo generado en el paso 5.1 a través de RT-qPCR, preferiblemente utilizando un método basado en la curva estándar que no se basa en la expresión^{del gen del huésped 18}, aunque otros métodos también pueden permitir estimaciones.

6. Bioensayo de alimentación viral

1. Preparar todos los materiales necesarios para el bioensayo antes de la etapa de recolección del marco (6.2) o durante el período de emergencia de la abeja de 24 horas (6.3).
   1. Prepare jaulas limpias u otros recintos capaces de albergar el número de abejas necesarias para el bioensayo (por ejemplo, jaulas de caja acrílica que midan 10,16 cm x 10,16 cm x 7,62 cm) tapando todos los orificios del alimentador con un tubo de centrífuga del tamaño adecuado (Figura 3). Determine y aleatorice los tratamientos entre las jaulas y etiquete cada uno con su tratamiento designado para facilitar la referencia futura.
   2. Preparar bandejas de inóculo etiquetando las embarcaciones de pesaje individuales de tamaño mediano con su correspondiente jaula y tratamiento.
   3. Prepare la solución de alimentación mezclando la cantidad adecuada de sacarosa con agua desionizada (por ejemplo, 300 g de sacarosa por 1 L de agua para una solución de sacarosa al 30%), asegurándose de esterilizar el agua antes y después de agregar sacarosa. La solución de sacarosa estéril se puede almacenar en un refrigerador de 4 °C durante varias semanas, pero debe desecharse si aparece alguna turbidez.
   4. Prepare los tubos de alimentación llenando parcialmente los tubos centrífugos de 15 ml con soluciones de alimentación producidas en 6.1.3, invirtiéndolos y colocando 1-2 orificios alrededor de la punta del tubo con una chincheta. Los agujeros también se pueden derretir usando una aguja hipodérmica de 18G calentada sobre una llama. Asegúrese de que las tapas de los tubos de alimentación estén atornilladas muy bien, ya que las tapas sueltas pueden causar fugas lentas que ahogarán a los habitantes de la jaula durante la noche.
      NOTA: Las soluciones de alimentación y el volumen del tubo alimentador se pueden ajustar según sea necesario para satisfacer las necesidades experimentales.
   5. Prepare una colección recepble para las abejas recién emergidas recubriendo ligeramente los bordes de una tina grande con aceite vegetal o una sustancia grasa similar. Por separado, prepare varias tazas pequeñas utilizando el mismo método de recubrimiento.
2. Seleccione y elimine los marcos de cría de abejas melíferas al borde de la eclosión procedentes de al menos tres colmenas separadas. Las abejas envejecidas apropiadamente se asemejan a adultos completamente pigmentados debajo de la tapa de la célula del peine. Un signo seguro de emergencia en curso es observar a los habitantes de las células masticando lentamente su salida y / o células recientemente vacías con marcas de masticación dentadas características a lo largo de la tapa de cera.
   NOTA: La cantidad exacta de fotogramas requeridos dependerá del tamaño del experimento, la cantidad de crías emergentes por fotograma y la época del año. Un marco profundo langstroth estándar contiene ~ 3,000 celdas de peine por lado; un marco que contiene principalmente pupas tapadas, con algunos emergiendo observados puede producir fácilmente más de 400 abejas en 24 h. Ajustar a lo largo de la temporada, según sea necesario.
3. Cepille todas las abejas adultas antes de colocar los marcos en cajas de emergencia y transfiéralos a una incubadora que coincida con las condiciones internas de una colmena (34 ° C y 50% HR). Deje que las abejas emerjan durante 24 h.
4. Retire las cajas de emergencia de la incubadora y cepille todas las abejas recién emergidas en la tina de recolección. Asegúrese de eliminar todas las abejas de las cajas de emergencia también para evitar la inclusión de abejas envejecidas incorrectamente en cualquier cepillado posterior. Cualquier abeja capaz de volar surgió hace > 24 horas y debe ser excluida del bioensayo.
5. Produzca una mezcla homogeneizada de abejas recién emergidas mezclando suavemente las abejas en la tina de recolección a mano (no pueden picar a esta edad) para minimizar los efectos genéticos de la colmena de cualquier colonia individual. Para aplicaciones específicas, pueden ser convenientes otros arreglos para la fuente de colonias.
6. Cuente 35 abejas individuales, colocando cada una en la misma taza engrasada antes de transferir el contenido a una jaula acrílica. Alternativamente, puede ser más fácil separar múltiplos más pequeños de abejas en varias tazas engrasadas (por ejemplo, 5 tazas de 7 abejas cada una) para evitar errores de conteo erróneo. El número de abejas utilizadas puede variar en función de las necesidades y aplicaciones.
7. Transfiera las jaulas de abejas a una incubadora (34 ° C y 50% HR), asegurándose de seguir el orden de colocación aleatorio creado en 6.1.1 para minimizar cualquier efecto microclimático potencial.
8. Prepare el espacio de trabajo para el trabajo con virus limpiando todas las superficies y pipetas con agua con lejía, etanol y solución inactivadora de RNasa antes de comenzar. Asegúrese de usar guantes de nitrilo cuando manipule partículas de virus.
9. Preparar el inóculo del virus de una concentración deseada descongelando una cantidad adecuada de partículas de virus concentradas (paso 4.17) y mezclándolo bien con suficiente solución de sacarosa (paso 6.1.3) en un recipiente estéril. Para jaulas de 35 abejas, cada una requiere 600 μL de inóculo. Se recomiendan diluciones seriadas si la concentración deseada del virus es igual o inferior al 0,1%.
   1. Por ejemplo, un experimento que involucra 40 jaulas que necesitan un inóculo de virus al 1% requerirá 24 ml de solución de virus, que se puede crear combinando 240 μL de partículas de virus concentradas con 23,76 ml de solución de sacarosa. Se recomienda incluir aproximadamente un 15% de exceso en el volumen inicial, ya que se esperan algunas pérdidas con líquidos viscosos.
10. Coloque las bandejas de inóculo preparadas en 6.1.2 clasificadas por tipo de tratamiento y pipete 600 μL del inóculo apropiado en cada bandeja.
    1. Inserte cuidadosamente las bandejas de inóculo en sus jaulas correspondientes, teniendo cuidado de no liberar accidentalmente ninguna abeja. Aproveche esta oportunidad para escanear las abejas y reemplazar las que puedan haber muerto en el proceso de transferencia.
11. Permitir el consumo completo del inóculo (aproximadamente 12-14 h) antes de retirar los tubos de centrífuga que bloquean el orificio de alimentación superior insertando los tubos de alimentación apropiados preparados en 6.1.4. Esto ayuda a garantizar que las abejas en la jaula compartan el inóculo de manera uniforme en toda la población. La solución de sacarosa se proporciona ad libitum y los tubos deben rellenarse según sea necesario a lo largo del curso del experimento.
12. Registre la mortalidad dentro de cada jaula a intervalos de 12 h durante las primeras 72 h de cada experimento, después de lo cual cambie el registro a intervalos de 24 h. Retire las abejas muertas de las jaulas para aumentar la facilidad de los recuentos futuros deslizando la puerta de la jaula lo suficientemente lejos como para que un par de fórceps alcancen y saquen a las abejas muertas. Asegúrese de esterilizar los fórceps sobre una lámpara de alcohol entre las jaulas para evitar la contaminación cruzada viral.
13. Muestree abejas para mediciones de títulos virales (5.1-5.2) seleccionando al azar especímenes vivos dentro de cada jaula y colocándolos en tubos de centrífuga sobre hielo seco. Por lo general, tres abejas son suficientes para producir mediciones de títulos virales en cualquier punto de tiempo dado sin despoblar también la jaula.
14. Continúe con las mediciones regulares de mortalidad durante el tiempo que sea necesario.

Resultados

Seguir con éxito los protocolos (Figuras 1) para la inyección de pupas y la extracción viral debe producir grandes cantidades de partículas de virus. Sin embargo, el muestreo y la inyección de pupas procedentes de una variedad de colonias en múltiples puntos de tiempo maximiza las posibilidades de adquirir el virus objetivo con baja contaminación. La dinámica por la cual los virus se replican e interactúan entre sí dentro de una abeja melífera no se entiende bien; junto con la probabilidad de ...

Discusión

Aquí hemos esbozado métodos que detallan cada paso del proceso de amplificación del virus y preparación de la población de inóculos, incluida la recolección de larvas y la propagación, extracción y concentración del virus, así como el tratamiento viral en forma de experimentos de alimentación en jaulas. Estos métodos permiten la producción de partículas de virus semipuras (Figura 4), cuya eficacia puede cuantificarse consistentemente mediante pruebas de mortalidad dosis-respue...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375