מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

Abstract

מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב ערך לחשיפת תהליך ההתפתחות העוברי בבעלי חיים שונים. במהלך העשורים האחרונים, Caenorhabditis elegans התגלה כאחד המודלים הטובים ביותר לחקר הפיתוח. מנקודת מבט אופטית, גודלו וגופו השקוף הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופיית DIC (ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית או נומרסקי). מאמר זה ממחיש פרוטוקול לגידול נמטודות C. elegans , הכנה והרכבה של העוברים שלהם, ביצוע מיקרוסקופיה 4D ומעקב אחר שושלות תאים. השיטה מבוססת על רישומי קיטועי זמן מולטיפוקליים של תמונות נומרסקי וניתוח עם תוכנה ספציפית. טכניקה זו חושפת דינמיקה התפתחותית עוברית ברמה התאית. כל פגם עוברי במוטנטים, כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס או אפיון גורל התא, ניתן לזיהוי ולניקוד יעילים. כמעט כל תא של העובר יכול להיות במעקב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. התחקות אחר שושלת התאים השלמה של עובר C. elegans על ידי מיקרוסקופיית DIC 4D היא מייגעת, אך השימוש בתוכנה ספציפית מקל מאוד על משימה זו. בנוסף, טכניקה זו קלה ליישום במעבדה. מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב תכליתי ופותחת את האפשרות לבצע ניתוח חסר תקדים של התפתחות עוברית.

Introduction

מיקרוסקופיה 4D היא מערכת הקלטה רב-פוקלית של קיטועי זמן המאפשרת לחוקרים לרשום ולכמת את הדינמיקה של התאים של דגימה ביולוגית הן מבחינה מרחבית והן לאורך זמן. תרביות תאים, שמרים או רקמות חיות יכולות להיות נתונות לניתוח 4D אך טכניקה זו מתאימה במיוחד לניתוח התפתחות העוברים החיים. הרזולוציה של ניתוח זה מגיעה לרמה של כל תא בודד של העובר. ניתן לזהות כל חלוקת תאים, ולעקוב אחר תנועות התאים לאורך זמן. גורלות התאים נבחנים על פי המיקום והצורה שהתאים רוכשים. השימוש באופטיקה של נומרסקי מגביר את הניגודיות של דגימות שקופות לא מוכתמות באמצעות אלומות אור מקוטבות אורתוגונליות המפריעות למישור המוקד. התמונות המתקבלות נראות תלת מימדיות, מוארות בצד אחד.

שיטות אחרות המבוססות על שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ובבעלי חיים מהונדסים של GFP לזיהוי אוטומטי של גרעינים ויצירת שושלות תאים פותחו ^1,2. היתרון של מערכות אלה ברור: התוכנה גוברת במידה רבה על הצורך בסימון ידני של כל גרעין לאורך פרק זמן (אם כי נדרש פיקוח ידני מסוים בשלבים המאוחרים). עם זאת, תהליכים תאיים הכוללים שינויים בצורת התא או בדינמיקה של הממברנה, כגון אלה המתרחשים במהלך התמיינות תאים, נדידה, אפופטוזיס או בליעת גופות, נשארים מוסתרים כרקע שחור בתמונות הגרעינים המסומנים בפלואורסצנט.

לעומת זאת, מיקרוסקופיית נומרסקי 4D (הנקראת גם מיקרוסקופיית DIC, מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית) מראה הן גרעינים והן שינויים בצורת התא המתרחשים במהלך התפתחותם של בעלי חיים מסוג בר או מוטציה. זה מאפשר מעקב אחר שושלות תאים באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים, תוך שימוש רק באור המועבר. אין צורך כללי להשתמש בבעלי חיים מהונדסים אלא כדי להראות דפוסי ביטוי ספציפיים, ובמקרה זה סריקות פלורסנטיות יכולות להיות משולבות. לכן, זו יכולה להיות הגישה האופטימלית עבור מעבדות רבות העובדות על תהליכים תאיים דינמיים כגון embryogenesis או אפופטוזיס שניתן להדגיש תחת מיקרוסקופיית DIC ^3,4,5,6,7.

מספר תוכניות גמישות וידידותיות למשתמש זמינות ללכידת תמונות מיקרוסקופיות ולשחזור שושלות תאים, מודלים תלת-ממדיים, נתיבי נדידת תאים וכו 'במדגם המוקלט. בניסוי סטנדרטי, התמונות נרכשות בסדרה של מישורי מוקד, במרחק קבוע, שמספרם תלוי בעובי הדגימה. ניתן לייעל את הרזולוציה הטמפורלית של הניתוח על ידי הגדלת תדירות הסריקה. אין כמעט הגבלה על משך ההקלטה מלבד קיבולת האחסון של המחשב. לדוגמה, עבור ניתוח התפתחות עוברי C. elegans , אנו רוכשים באופן שגרתי תמונות על 30 מישורי מוקד (צעד של מיקרון אחד כל אחד), כל 30 שניות במשך 12 שעות.

מערכות אלה יושמו בניתוח של מספר עוברים של בעלי חיים כגון Caenorhabditis elegans ^8,9,10, Drosophila melanogaster¹¹, עוברי נמטודה אחרים^12,13, tardigrades^14,15 ואפילו עוברי עכברים מוקדמים¹⁶. הדרישה היחידה היא שיהיה עובר שקוף המסוגל להתפתח על הכנת המגלשה מתחת למיקרוסקופ.

לסיכום, מיקרוסקופיה 4D מבוססת DIC שימושית במיוחד עבור 1) ניתוח התפתחות עוברית של בעלי חיים קטנים ושקופים: מעקב אחר שושלת תאים, נתיבי נדידת תאים, יצירת מודלים תלת-ממדיים וכו '; 2) הגדרת דפוסי ביטוי גנים; 3) חקר הדינמיקה של תרביות תאים, משמרים ועד תאים אנושיים; 4) ניתוח דינמיקה של רקמות או שברי עוברים; 5) כימות קינטיקה של מוות תאי ובליעת גופות; ו-6) ביצוע ניתוח פילוגנזה השוואתי המבוסס על מאפיינים התפתחותיים עובריים. אם יש עניין באחד מהנושאים הללו (או דומים להם), ניתן להשתמש במיקרוסקופיה 4D.

Protocol

1. לגדל C. elegans על צלחות פטרי

1. הכינו צלחות NGM וזרעו אותן עם E. coli OP50 כמקור המזון (איור 1). לגדל ולתחזק את C. elegans כמתואר¹⁷. אחסן צלחות נזרעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
2. התאימו את הצלחות לטמפרטורה הרצויה לפני הוספת התולעים.
   1. כדי להעביר את התולעים, מוציאים נתח אגר מצלחת ישנה ומניחים אותו על צלחת טרייה.
   2. לחלופין, תפסו בעלי חיים בודדים עם קוטף תולעים סטרילי (חתיכה בקוטר 1 אינץ' של חוט פלטינה בעל 32 מדים עם קצה שטוח, המותקנת על קצה פיפטה של פסטר) והניחו אותן על הצלחת החדשה.
3. לגדל את התולעים בטמפרטורה הרצויה.
   1. לגדל תולעי C. elegans בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה הסטנדרטית. עם זאת, כדי לנתח את הפיתוח של מוטנטים רגישים לתרמו, לבצע דגירה לילה, בדרך כלל ב 25 מעלות צלזיוס. התאם את משך והטמפרטורה של דגירה זו לפי הצורך, בהתאם למוטנט הספציפי.

2. הכינו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית לפני הרכבת העוברים (איור 2)

1. הגדר את המיקרוסקופ ואת בקרות הטמפרטורה לפני הכנת העובר. C. elegans העוברים מתחלקים מהר מאוד. היו מוכנים להתחיל להקליט מיד לאחר הרכבת העוברים.
2. התאם את טמפרטורת ההקלטה ל- 15 ° C, 20 ° C או 25 ° C.
   1. תעדו באופן שגרתי את העוברים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. תעדו מוטנטים רגישים לתרמו בטמפרטורה המגבילה כדי להראות את הפנוטיפים שלהם. הקלט בקרת WT (אם נעשתה בהכנה אחרת) באותה טמפרטורה כמו המוטנטים.
      הערה: עוברי WT מתפתחים מהר יותר ב-25 מעלות צלזיוס ואיטיים יותר ב-15 מעלות צלזיוס ללא הבדלים נוספים בשושלת התאים. מקם את המיקרוסקופים בחדר מבוקר טמפרטורה. שליטה נוספת על ידי קירור או חימום המגלשה רצויה מאוד. ניתן להשיג זאת על ידי זרימת מים בטמפרטורה מסוימת באמצעות טבעת מתכת סביב מטרת המיקרוסקופ והעיבוי. המטרה וההכנה נמצאים במגע ישיר דרך שמן הטבילה והעברת הטמפרטורה יעילה. מערכת זו מאפשרת שליטה מדויקת על טמפרטורת הרישום ועל ביצוע שינויי טמפרטורה במהלך התפתחות העובר.
3. הגדר את פרמטרי הרשומה בתוכנת המיקרוסקופיה.
   1. להקלטה סטנדרטית של C. elegans (ללא סריקות פלואורסצנטיות), בחר:
      z-ערימות של 30 מישורי מוקד, במרחק של 1 מיקרון כל אחת.
      מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack.
      1500 z-stacks (12.5 שעות שיא).
      הערה: ניתן להשתמש הן בתוכניות בקרה מסחריות והן בקוד פתוח של מיקרוסקופ כדי להגדיר זרימת עבודה זו ללכידת תמונות. עכשיו המיקרוסקופ מוכן להקליט.

3. להכין ולהרכיב את העוברים

1. הכינו כרית אגר דקה והומוגנית כצעד ראשון בהשגת תמונה יפה (איור 3).
   1. מכינים 50 מ"ל של תמיסת אגר של 4.5% במים שעברו דה-יוניזציה. מחממים לרתיחה במיקרוגל ויוצקים 0.5 – 1 מ"ל לתוך צינורות זכוכית 3 מ"ל.
   2. אטמו בזהירות את הצינורות עם סרט שעווה כדי למנוע ייבוש. צינורות אגר אטומים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.
   3. על ספסל המעבדה, יש בלוק חום ב 80 °C (80 °F) עם:
      מבחנה של ג'לי נפט טהור (מומס), עם מברשת צבע עדינה בפנים.
      מבחנה עם מים מזוקקים המכילים פיפטה של פסטר.
      הערה: זה מבטיח שכל החומרים הנדרשים יהיו חמים, והאגר לא יתמצק בתהליך הכנת הפד.
   4. הסירו את סרט השעווה מראש אחד מצינורות האגר, וחממו אותו בזהירות מעל מבער אלכוהול כדי להמיס את האגר. יש לנקוט משנה זהירות, שכן אגר חם שנפלט מצינור הזכוכית עלול לגרום לכוויות.
   5. לאחר שהאגר נמס, הניחו את הצינור בגוש החום כדי לשמור על האגר בצורה נוזלית.
   6. לחלופין, מניחים את צינורות האגר לתוך גוש החום 1 שעה לפני הניסוי כדי להמיס אותם מבלי להשתמש במבער. יש להשליך את האגר המומס לאחר יום אחד.
   7. הניחו שקופית מיקרוסקופ (שקופית A) בין שניים אחרים על פיסת פלסטיק.
   8. קח שקופית נוספת (שקופית B) והחזק אותה עם האצבעות ביד אחת.
   9. עם היד השנייה, מניחים טיפה קטנה של אגר מומס במרכז שקופית A באמצעות פיפטת הפסטר החמה.
   10. לחץ מיד על שקופית B על טיפת האגר כדי ליצור כרית דקה מאוד בין שקופיות A ו- B. שמור את השקופיות האלה דחוקות זו לזו עד שלב 3.2.3.
2. הר את העוברים.
   1. אספו 5-10 הרמפרודיטים גרבידיים עם הקוטף והניחו אותם בכוס שען מלאה במים.
   2. השתמשו באזמל כדי לפתוח את הנמטודות ההרמפרודיט ולחלץ ביצים מוקדמות (1-4 תאים) מהרחם, מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
   3. קח את השקופית משלב 3.1.10 והחליק בעדינות את שקופית B כדי לחשוף את כרית האגר בשקופית A.
   4. מניחים ביצה מוקדמת במרכז כרית האגר על ידי צנרת עם צינור נימי.
   5. לחלופין, פיפטו טיפה המכילה סט של עוברים על כרית האגר ולאחר מכן חפשו עוברים בשלב מוקדם. בצע שלב זה תחת הסטריאומיקרוסקופ.
   6. במידת הצורך, הזיזו את הביצה על ידי הצמדתה עם ריס המודבק לקצה הקיסם.
   7. יש להסיר עודפי מים עם הפיפטה הנימית.
      הערה: ניתן להכין פיפטה נימית בקלות על ידי חימום פיפטה של פסטר מעל מבער אלכוהול ומשיכתו משני הקצוות.
   8. בזהירות לכסות את ההכנה עם כיסוי. כדי להימנע מבועות אוויר, הניחו קצה אחד של הכיסוי על המגלשה והחליקו בעדינות אזמל לאורך הקצה הסמוך כדי לעטוף באיטיות ובאופן אלכסוני את הכיסוי על ההכנה.
   9. השתמשו בפיפטה כדי למלא 3/4 מהחלל המקיף את כרית האגר במים. השאירו 1/4 מהחלל עם אוויר.
   10. אטמו את מכסה הכיסוי בג'לי נפט כדי למנוע ייבוש במהלך תקופות הקלטה ארוכות.
   11. השתמשו במברשת העדינה כדי להרחיב שכבה דקה של ג'לי נפט מומס סביב קצה הכיסוי.
       הערה: כעת ההכנה מוכנה להקלטה.

4. התאימו את ה-DIC והתחילו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית

1. הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ. מקד את העובר באמצעות מטרת ההגדלה הנמוכה (פי 5 או 10x).
2. שנה ליעד הטבילה פי 100.
3. התאם את הרכיבים האופטיים של המיקרוסקופ כדי לקבל תמונת נומרסקי.
   1. מקד את המעבה.
   2. לפתוח לחלוטין את הצמצם של המעבה ולסגור את הסרעפת שדה (זה יספק צמצם מספרי גבוה יותר ולכן, רזולוציה גדולה יותר).
   3. בדקו ששני המקטבים במיקרוסקופ מכוונים לגרום להכחדת האור המרבית.
   4. סובבו את מנסרת וולאסטון כדי לקבל תמונה תלת-ממדית נחמדה של העובר, מוארת בצד אחד. סובבו את המנסרה לכיוון השני כדי לקבל את האפקט של הארת העובר בצד השני.
      הערה: ניתן לבצע שלבים אלה על דגימת בדיקה לפני ההקלטה, כך שנדרש רק כוונון עדין בדגימה המנותחת.
4. הפעל את לכידת התמונה במיקרוסקופ.

5. נתחו את סרט ה-4D (איור 4).

הערה: לאחר השלמת ההקלטה, השתמש בתוכנת מעקב אחר שושלת תאים כדי לשחזר ולנתח שושלת תאים.

תוכנה למעקב אחר שושלת תאים היא כלי רב עוצמה לביצוע ניתוחים מפורטים של התפתחות עוברית או דינמיקה בתרביות תאים או שברי רקמות. התוכנית מחלצת ומכמתת מספר מערכי נתונים על הדינמיקה התאית של הדגימה הכוללים יצירת שושלת התאים השלמה של כל תא ותא מתועד, כולל חלוקות תאים, אורך מחזור התא, נדידה או אפופטוזיס וכן הקינטיקה שלו. בנוסף, התמיינות תאים יכולה להיות ניקוד על ידי שינויים מורפולוגיים של התא או על ידי ביטוי של סמנים ספציפיים. בעיקרון, מסך התוכנה מציג שני חלונות: בחלון השמאלי, ניתן להפעיל את הסרט הארבע-ממדי קדימה ואחורה או למעלה ולמטה לרמות העליונות או התחתונות, כך שניתן יהיה לעקוב אחר כל תא בזמן ובמרחב לאורך ההקלטה. על האלמנה הימנית נוצרת שושלת התאים. לחיצה על גרעין התא בסרט הארבע-ממדי יוצרת נקודה בחלון השושלת המאחסנת את המידע של שם התא, גורלו וקואורדינטות מרחביות. שושלת התאים של תא מסוים נוצרת על ידי השמעת הסרט הארבע-ממדי קדימה ולחיצה מעת לעת על הגרעין כדי לסמן את המיטוזה של אותו תא ספציפי לאורך זמן. חזרה על תהליך זה עבור כל אחד מהתאים המתועדים יוצרת את שושלת התאים השלמה של העובר או הדגימה. המידע המאוחסן עבור קואורדינטות מרחביות של כל תא משמש מאוחר יותר לשחזור מודלים תלת-ממדיים של עוברים ונתיבי נדידת תאים.

1. פתח את תוכנת איתור השושלת וצור פרויקט חדש על ידי מעבר לתפריט הסרגל העליון ובחירה:
   | קבצים פרויקט חדש.
2. בחר את תבנית שושלת התאים בהתאם לטמפרטורת ההקלטה: DB08 להקלטה ב- 25 °C, DB10 להקלטה ב- 20 °C ו- DB12 להקלטה ב- 15 °C.
3. הגדר את פרמטרי ההקלטה בחלון המתהווה: ספירת סריקות (בדרך כלל 1500), זמן בין סריקות (30 שניות), ספירת רמות (30) ומרחק בין רמות (1 מיקרון).
4. בחר את קובץ התמונה ואת העיצוב.
   1. בחר את ספריית התמונות שבה נשמרו התמונות.
   2. בחר אם יש לשמור תמונות כתמונות בודדות (תמונה אחת לכל רמה וזמן) או כערימות z מרובות תמונות.
   3. קבע את שמות הקבצים ואת תבנית התמונה. באופן שגרתי, תמונות בודדות נשמרות תחת השמות הבאים:
      X0000L00C1 (לסריקה 0, רמה 0, ערוץ 1)
      X0000L01C1 (לסריקה 0, רמה 1, ערוץ 1)
      X0000L02C1 (לסריקה 0, רמה 2, ערוץ 1)
      ...
      X0001L00C1 (לסריקה 1, רמה 0, ערוץ 1)
      X0001L01C1 (לסריקה 1, רמה 1, ערוץ 1)
      ...
      X0300L04C1 (לסריקה 300, רמה 4, ערוץ 1)
      ...
      הערה: שמירת התמונות בתבנית דחוסה חוסכת מקום בדיסק הקשיח.
5. הגדר את ערוצי האור: 1 עבור אופטיקת DIC, 2 עבור GFP, 3 עבור RFP וכו '. הוסף את אלה ששימשו בהקלטת 4D. לחץ על "עיבוד ערוצים מופעל" כדי לזהות אותם.
6. התחילו להתחקות אחר שושלת התאים של העובר. המסך מכיל כעת שני חלונות עיקריים: חלון הווידאו וחלון שושלת התאים.
   1. בחלון השושלת, בחר ענף שושלת והשתמש בעכבר כדי ללחוץ על גרעין התא המתאים לתא זה בחלון הווידאו.
   2. עקוב אחר התא באופן מרחבי ולאורך זמן על-ידי הפעלת סרט 4D קדימה, אחורה או למעלה או למטה ברמה, באמצעות מקשי הסמן.
   3. לחץ מעת לעת על גרעין התא. זה יוצר נקודה בענף השושלת ורושם את הקואורדינטות המרחביות של התא בשלב זה. כתוצאה מכך, שושלת התאים מתקדמת, ושחזורים תלת-ממדיים של העובר אפשריים.
   4. סמן מיטוזה על ידי לחיצה על מקש ההחזרה. לאחר מכן בחר אחד מתאי הבת ועקוב אחריו כמו קודם.
7. חזור על התהליך (שלבים 5.6.1 עד 5.6.4) כדי לעקוב אחר שאר התאים העובריים כדי להתחקות אחר שושלת התאים השלמה, או כדי לעקוב אחר תאים ספציפיים בעלי עניין כגון אלה העוברים אפופטוזיס.
8. השווה את השושלת המוטנטית עם שושלת התאים הסטריאוטיפית WT C. elegans .

תוצאות

כדי לאפיין התפתחות עוברית של מוטציה C. elegans עבור הגן gsr-1, המקודדת את האנזים גלוטתיון רדוקטאז, הנדרש לחידוש גלוטתיון מופחת (GSH) ומעורב בשמירה על הומאוסטזיס של חמצון-חיזור בנמטודה, ביצענו מיקרוסקופיה 4D של מוטציה למחיקה gsr-1 (tm3574) שהיא אובדן של אלל תפקודי הגורמת לפנוטיפ מעצר עוברי מוקדם¹⁸. גם נמטודות ה-WT וגם המוטציות המאוזנות של Gsr-1 (tm3574) C. elegans גדלו על צלחות NGM שנזרעו עם E. coli OP50 כמקור המזון¹⁷. תולעי gsr-1 (tm3574) גודלו כהטרוזיגוס בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך שני דורות ולאחר מכן תולעים הומוזיגוטיות מופרדות (המסוגלות לגדול עד לבגרות הודות לעומס האימהי) הועברו ל -25 מעלות צלזיוס לדגירה של לילה לפני ניתוח העוברים. לוחות תולעים הודגמו בתוך קופסאות קרטון כדי למנוע עיבוי (איור 1). נמטודות גרבידיות נחתכו כדי לחלץ עוברים צעירים.

כדי להשוות את ההתפתחות העוברית של המוטאנט לעומת ה-WT הסטריאוטיפי בתנאים זהים, הוכנסו עובר WT (כבקרה) ועובר gsr-1 (tm3574) לאותה הכנה זה ליד זה. זרימת עבודה של מיקרוסקופיה 4D הופעלה על מיקרוסקופ זקוף ממונע סטנדרטי המצויד באופטיקה DIC. פרמטרי ההקלטה שנבחרו בתוכנית הבקרה של המיקרוסקופ היו: z-stacks של 30 מישורי מוקד במרחק של מיקרון אחד כל אחד, מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack ו-1500 z-stacks (12.5 שעות של הקלטה). טמפרטורת ההקלטה הותאמה ל-25 מעלות צלזיוס (הן בחדר והן על במת המיקרוסקופ) (איור 2).

לאחר השלמת ההקלטה, קובץ התמונות נפתח, ושושלת התאים שוחזרה באמצעות תוכנת מעקב אחר שושלת על ידי לחיצה על גרעיני תאים המוצגים בחלון הווידאו (איור 4). שושלת התאים העובריים המוטנטית gsr-1 (tm3574) הושוותה לשושלת C. elegans WT המתוארת ברקע. תוצאה מרכזית הייתה זיהוי של עיכוב הדרגתי במחזור התא במהלך ההתפתחות העוברית. כתוצאה מכך, עוברים מוטנטיים נעצרו בשלבי ביניים ואילו עוברי WT התקדמו ולבסוף בקעו כזחלים.

הכנה ותצפית ישירה על עוברים תחת המיקרוסקופ או תצפית חיסונית עם נוגדנים נגד סמנים עובריים מאוחרים יכולה לחשוף את נוכחותם של אחוז גבוה של עוברים צעירים במוטציה בהשוואה ל- WT. ניתן להסיק את מעצר העובר כהסבר הסביר ביותר. עם זאת, הוכחה ישירה וכימות מדויק של עיכוב מחזור התא ניתנים להצגה ולכימות באלגנטיות ובקלות רק באמצעות ניסוי מיקרוסקופיה 4D. ניתן גם לדמיין מאפיינים חשובים אחרים של התפתחות עוברית כגון התמיינות תאים או אפופטוזיס (איור 5) באופן דינמי באמצעות מיקרוסקופיה 4D המציעה ניתוח מפורט של היבטים מרובים של התפתחות בניסוי יחיד.

איור 1: נמטודות C. elegans גדלות בתנאי מעבדה. נמטודות גדלות על צלחות NGM עם זרעי E. coli, מאוחסנות בקופסאות קרטון ומדגרות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס, 20 מעלות צלזיוס או 25 מעלות צלזיוס.

איור 2: צילום מסך של תוכנת הקלטה למיקרוסקופיה 4D. דוגמה לשתי תוכנות שונות לבקרת מיקרוסקופים (A ו-B). תוכניות אלה יוצרות זרימות עבודה כדי לשלוט במיקרוסקופ ובלכידת התמונה במהלך הקלטת מיקרוסקופיה 4D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תצלומים סדרתיים של הכנת כרית אגר והרכבה של עובר C. elegans . א. צינורות אגר מוכנים. בי-סי. הכנת כרית האגר. ד. החלקה מלאה חלקית במים. ה. איטום המגלשה בג'לי נפט. ו. הכנה סופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: צילומי מסך טוריים של תוכנת מעקב אחר שושלת תאים. התוכנית מאפשרת שחזור של שושלת התאים העובריים של מוטציה לעיכוב מחזור התא (משמאל) ועובר WT (מימין) C. elegans . A. שלב מוקדם של ההתפתחות. בי-סי. התפתחות שני העוברים מתקדמת עם הזמן. ד. עובר WT מתפתח כראוי ומתחיל התארכות ואילו המוטאנטים נעצרים. בכל המקרים התוכנית מציגה את חלון הווידאו ואת חלון השושלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: צורת שבירה של עדשים של תאים אפופטוטיים בעובר C. elegans WT. ניתן להעריך את גורל התא, המוגדר על ידי מאפיינים מורפולוגיים, על ידי מיקרוסקופיה 4D. התמונה מראה עובר C. elegans בשלב השעועית. תאים חיים מראים גרעינים בעלי צורה חלקה המוקפים בציטופלסמה גרגירית. לעומת זאת, תאים אפופטוטיים (חצים צהובים) מתעבים ומאמצים צורה דמוית עדשים, מתפרקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

אחד האתגרים הגדולים בביולוגיה המודרנית הוא הבנת ההתפתחות של אורגניזמים רב-תאיים. C. elegans התגלה כאחד המודלים המתאימים ביותר לחקר התיאום העדין בין התפשטות תאים לבין התמיינות תאים בעובר המתפתח. מנקודת מבט אופטית, גופו השקוף וגודלו הקטן הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופ DIC. אורגניזמים אחרים בעלי מאפיינים דומים עברו גם הם ניתוח מיקרוסקופיה 4D 11,12,13,14,15,16.

עבור אותם מחקרים התפתחותיים, השבתת גנים על ידי גנטיקה קדימה או לאחור מספקת רמז למעורבותה באמבריוגנזה. לאחר שהוכח כי גן ממלא תפקיד בהתפתחות, השלב הבא הוא להגדיר את תפקידו המדויק בביסוס תוכנית הגוף הנכונה. חיסון היא הגישה שנבחרה עבור רוב הדגמים. טכניקה זו מבהירה בעיות בהתמיינות תאים או בביטוי של סמנים ספציפיים. עם זאת, מגבלה מרכזית של גישה זו היא שהיא מספקת רק מבט סטטי על הביטוי של סמנים בודדים או יותר בנקודה קבועה בהתפתחות. תצוגה דינמית של סמנים אלה לאורך ההתפתחות יכולה להתקבל רק על ידי צביעת עוברים שונים בנקודות זמן שונות. בנוסף, שחזור שושלת תאים אינו אפשרי בדגימות קבועות כאלה.

מיקרוסקופיה 4D היא גישה משלימה לחקר ההתפתחות העוברית. טכניקה זו חושפת דינמיקת התפתחות ברזולוציה ברמת התא. כל פגם בעובר כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס, מפרט גורל התא וכו' יופיע בסרט 4D שניתן לדמיין קדימה ואחורה, לכמת אותו ולהבקיע אותו על ידי החוקר. באמצעות טכניקה זו, כמעט כל תא ותא בעובר ניתן לעקוב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. עוברים שעברו מיקרוסקופיה 4D עם אור נראה בלבד ואופטיקה של נומרסקי אינם עוברים פוטו-דמה. סריקות פלואורסצנטיות יכולות גם להיות משולבות בתוך ההקלטה כדי לזהות מתי והיכן מתבטא גן. עוברים הסובלים מפוטודמאמג' משמעותי מזוהים על ידי הארכת מחזור התא שגורמת להקרנת UV חזקה בהשוואה לעובר שושלת WT סטנדרטי. במקרה כזה, ניתן להפחית את הפוטודמאג' על ידי הפחתת עוצמת מנורת ה-UV והגדלת הרגישות למצלמה או זמן החשיפה. מאפיינים מורפולוגיים וסמנים מולקולריים יכולים לעזור להבהיר את ההתפתחות העוברית של כל מוטציה.

הגדרת מערכת מיקרוסקופיה 4D קלה ליישום במעבדה, ולאחר תרגול מסוים, מאפשרת ניתוח ללא תחרות של דינמיקת תאים ומעקב אחר שושלות של תרביות תאים ודגימות שקופות חיות ברמת רזולוציה של כל תא ותא בשדה המיקרוסקופ. מעקב אחר שושלת תאים בתמונות DIC עדיין מעובד ביד. זה גוזל זמן, ולמרות שהתוכנה מזהה שגיאות שושלת כגון ענפי שושלת שונים המסמנים את אותו תא, טעויות אפשריות. בעוד שזיהוי אוטומטי של תאים המסומנים ב-GFP מפותח היטב², תוכנת מעקב שושלת משלימה המבוססת על תאים לא מסומנים ותמונות של אור נראה עדיין נמצאת בשלב מוקדם ולא ממש שימושית לניתוח עוברים מלא. ללא כל ספק, יישום של מערכות זיהוי תמונה בתחום המיקרוסקופיה של האור הנראה יביא להתקדמות רבה בתחום זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caenorhabditis elegans (N2)	GCG (Caenorhabditis Genetics Center)	N2	WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis elegans (VZ454)	GCG (Caenorhabditis Genetics Center)	VZ454	gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/
Cell Lineage Tracing software	SIMI	Simi BioCell	This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html
Microscope camera	Hamamatsu	Orca-R2	Miscroscope camera for both transmitted and UV light
Microscope control software	Caenotec	Time to Live	This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de
Microscope control software	Micro-manager	Micro-manager	This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/
Motorized microscope	Leica	Leica DM6000	Motorized upright microscope to perform 4D microscopy
Standard equipment in a Molecular Biology lab.
Stereomicroscope	Leica	MZ16FA	Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.