הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

Summary

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

Abstract

כדי לחקור את ההשפעות של תאי גזע mesenchymal (MSCs) על התחדשות התא וטיפול, שיטה זו עוקבת אחר נדידת MSC ושינויים מורפולוגיים לאחר תרבות משותפת עם אפיתל שבלול. האיבר של קורטי היה משותק על כיסוי פלסטיק על ידי לחיצה על חלק מהקרום של רייסנר שנוצר במהלך הניתוח. MSCs מוגבל על ידי גליל זכוכית היגר לכיוון אפיתל cochlear כאשר הצילינדר הוסר. לוקליזציה השלטת שלהם נצפתה modiolus של האיבר של קורטי, מיושר בכיוון דומה לזה של סיבי העצב. עם זאת, כמה MSCs היו לוקליזציה באזור הלימבוס והראה צורה מוארכת אופקית. בנוסף, ההגירה לאזור תאי השיער הוגדלה, והמורפולוגיה של ה- MSCs השתנתה לצורות שונות לאחר הטיפול בקנאמיצין. לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהשיתוף של MSCs עם אפיתל שבלול יהיה שימושי להתפתחות טיפולית באמצעות השתלת תאים ולחיקרי התחדשות תאים שיכולים לבחון תנאים וגורמים שונים.

Introduction

אובדן שמיעה יכול להתרחש מולדת או יכול להיגרם בהדרגה על ידי מספר גורמים, כולל הזדקנות, תרופות, ורעש. אובדן שמיעה הוא לעתים קרובות קשה לטפל כי זה מאוד מאתגר לשחזר תפקוד לקוי פעם תאי השיער האחראים על השמיעה פגומים¹. על פי ארגון הבריאות העולמי, 461 מיליון בני אדם ברחבי העולם מעריכים כי יש אובדן שמיעה, המהווה 6.1% מאוכלוסיית העולם. מבין הסובלים מירידה בשמיעה, 93% הם מבוגרים ו-7% הם ילדים.

מספר גישות נוסו לטפל באובדן שמיעה; יש לציין כי גישת התחדשות באמצעות MSCs התפתחה כטיפול מבטיח. כאשר הרקמה פגומה, MSCs משתחררים באופן טבעי לתוך מערכת הדם ונדדים לאתר הפציעה שבו הם מפרישים מולקולות שונות כדי ליצור microenvironment המקדם^{התחדשות 2}. לפיכך, חשוב לפתח שיטה לטיפול ברקמות פגומות באמצעות הגירה של MSCs מושתל חיצונית כדי למקד איברים ואת הפרשתם הבאים של מולקולות הגורמות ויסות חיסוני חזק, אנגיוגנזה, ואנטי אפופטוזיס כדי לשפר את השיקום של תפקוד התא הפגוע^3,4,5.

תהליך הביות שבו MSCs נודדים לרקמות פגומות עשוי להיות המכשול החשוב ביותר להתגבר עליו. MSCs יש מנגנון ביות מערכתי עם שלבים רציפים של קשירה / גלגול, הפעלה, מעצר, גלגול /diapedesis, והגירה^6,7,8. נכון לעכשיו, נעשים מאמצים לזהות דרכים לשיפור צעדים אלה. אסטרטגיות שונות, כולל שינוי גנטי, הנדסת משטח התא, הפריה חוץ גופית, והדרכה מגנטית, נבדקו^6,7. בנוסף, נעשו מספר ניסיונות לקדם את ההגנה וההתחדשות של תאי שיער שמיעתיים על ידי ביות MSCs לאתר של שבלול פגום. עם זאת, מעקב אחר MSCs ב vivo הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית ודורש מיומנויות מיוחדות מאוד⁹.

כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לבחינת הביות של MSCs בשבלול באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן לשגות המצלם את נדידת התאים במשך מספר שעות (איור 1). הוא פותח בתחילת המאה ה^-20 והפך לאחרונה לכלי רב עוצמה לחקר הגירה של תאים ספציפיים.

איור 1: תקציר גרפי. (A) לאחר שהאיבר המנותח של קורטי דבק בכיסוי פלסטיק באמצעות מלקחיים, הכיסוי ממוקם על צלחת מיקרוסקופית עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, ו- (B) גליל הזכוכית ממוקם. (C) לאחר מילוי החלק הפנימי של גליל הזכוכית עם בינוני, (D) GFP שכותרתו MSCs עם בינוני מתווספים בזהירות מחוץ הצילינדר. (E)לאחר הדגירה בן לילה,(F)הצילינדר זכוכית מוסר, ותמונות נלקחות עם מיקרוסקופ confocal. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSCs = תאי גזע mesenchymal. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

כל פרוטוקולי המחקר מעורבים עכברי ICR אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת Yonsei במכללת וונג'ו לרפואה. הניסויים בוצעו על פי הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית. בפרוטוקול זה, עכברי ICR בהריון הוחזקו במחזור אור / כהה 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. ניתוח קוכליאה

1. לעקר את מכסה המנוע של רקמת הזרימה למינארית על ידי הפעלת האור האולטרה סגול במשך ~ 30 דקות, ולרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול לפני השימוש. אפשר למשטחים להתייבש.
2. מניחים מכשירי ניתוח ב 70% אתנול במשך 10 דקות, ויבש לפני השימוש.
3. השתמש בלהב הפעלה כדי לערוף את ראשם של עכברים בני 3-4 ימים לאחר הלידה (איור 2A).
4. מניחים את הגולגולת מתחת לסטריאומיקרוסקופ במכסה המנוע של זרימת הלמינארי, ומשרים את הרקמה ב-70% אתנול.
5. להשרות במהירות את הרקמה בתמיסת ניתוח רקמות (1x פתרון מלח מאוזן של האנק, 1 מ"מ HEPES) כדי להסיר את האתנול.
6. חותכים את קו האמצע של הגולגולת בלהב כירורגי(איור 2B,C).
7. חשוף את הגולגולת על ידי משיכת העור לפני זמן מה וחיתוך תעלת השמיעה החיצונית של האוזן(איור 2D).
8. חותכים מהקצה השני לחלק האחורי של הגולגולת לאורך קו העין(איור 2E).
9. פתחו את הגולגולת והסירו את המוח הפתח, המוח הקטן וגזע המוח בעזרת מלקחיים קהים(איור 2F,G).
10. בעזרת מלקחיים זעירים, הפרד את השבלול מעצם הזמן(איור 2H).
11. מעבירים את השבלול לצלחת פטרי המכילה תמיסת ניתוח רקמות.
12. נתק בזהירות את כל קפסולת שיבולת השועל, והשאיר רק את הרקמה הרכה הפנימית של השוליאר (איור 2I,J).
13. החזיקו את המודיעין של השבלול עם מלקחיים ותעל השבלול עם זוג מלקחיים נוסף, והפרידו לאט לאט בין שתי הרקמות (איור 2K).
14. הסירו את הווסקולאריס ואת הקרום הטקטורלי על ידי קילוף עדין שלהם(איור 2L,M).
15. מניחים כיסוי פלסטיק מעוקר בתמיסת ניתוח רקמות חדשה, ולאחר מכן מניחים את האיבר של קורטי על כיסוי בקוטר 9 מ"מ, מוודאים שהממברנה הבזילארית פונה כלפי מטה (איור 2N-P).
16. לשתק את הרקמה על ידי לחיצה על קרום רייסנר ואת רקמת modiolus הנותרים על מכסה עם מלקחיים (איור 2N-P).
17. מעבירים את הכיסוי עם הרקמה המוטבעת למרכז צלחת קונפוקלית בקוטר 35 מ"מ.
18. מניחים את גליל שיבוט הזכוכית על המנה, עם explant שבלול ממוקם במרכז המנה, ומוסיפים 100 μL של מדיום תרבות explant (DMEM / F12, 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% תוספת N2, ampicillin (10 מיקרוגרם / מ"ל))¹⁰ בתוך הצילינדר (איור 2Q).
19. צלחת 5 ×^{10 3} תאים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שמקורו בעצם העכבר, MSCs מתויגים ב-2 מ"ל של מדיום תרבות (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% תוספת N2, 10 מיקרוגרם/מ"ל של אמפיצילין) מחוץ לגליל הזכוכית (איור 2R).
    1. כאשר MSCs הם 80-90% confluent, להעביר אותם על ידי ניתוק אותם עם חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין.
20. מעבירים בזהירות את המנה הקונפוקלית לאינקובטור לח ומדגרים לילה ב-37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO_2.
21. שאפו את כל המדיום בתוך ומחוץ לצילינדר, ולאחר מכן הסירו את גליל הזכוכית מהצלחת הקונפוקלית.
22. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת הקונפוקלית, ומדגירה את מנת תרבית הרקמה באינקובטור לח עד שהיא מוכנה לניתוח.

איור 2. ניתוח של לכישלת עכבר ושיתוף פעולה של האיבר של קורטי ו- MSCs. עריפתראשו של העכבר, (B) ו - (C) ניתוח קשתי של הראש, (D) ו - (E) ניתוח קורנל של המוח, (F) ו - (G) הסרת המוח ועצם הזמן, (H) השבלול, (אני) הסרת קיר השבלול הגרמי, ( J ) בידוד של השבלול, ( K ) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (J) בידוד של השבלול, (K) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (L) הפרדת סטריה vascularis (SV) ורצועה ספירלית (SL) מהאיבר של קורטי, (M) הסרת קרום tectorial, (N-P) קיבוע של שבלול על תלוש כיסוי פלסטיק, (Q) מיקום של coverlip ו גליל זכוכית בצלחת confocal, (R)חיסון של MSCs. בר בקנה מידה לבן (A-E) = 1 ס"מ; כתום (F, G, P) ו פס בקנה מידה צהוב (H,I) = 1 מ"מ; פס בקנה מידה ירוק (J-O) = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הדמיה לשגות בזמן

1. לניסויים המוצגים כאן, השתמש במערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מערכת אינקובטור הבמה העליונה.
2. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקאלי, את האור הפלואורסצנטי ואת המחשב.
3. הגדר את התנאים של החממה הבמה העליונה להציב על הבמה של מיקרוסקופ confocal ל 37 °C (69 °F) ו 5% CO₂ אטמוספרה.
4. מניחים את צלחת המדגם על כלי התיקון של המנה, מכסים במכסה תיקון המנה וסוגר את התא עם מכסה התנור העליון.
5. התאם את גודל התצוגה ואת המוקד כדי להתאים לשפות אחר האיבר של Corti ו- MSCs בשדה התצוגה.
6. פתח את תוכנת עיבוד התמונה. תחת אפשרות האיתור, בחר באובייקט 20x Plan-Apochromat (צמצם מספרי 0.8) ובאזור חיתוך של 0.5x.
7. תחת רכישה, לחץ על התקנה חכמה ובחר EGFP.
8. פתח את כרטיסיית הערוץ תחת רכישה, והגדר את עוצמת הלייזר ל- 0.2%, את חור הפינה ל- 44 מיקרומטר, את הרווח הראשי ל- 750 Vואת הרווח הדיגיטלי ל- 1.0.
9. לחץ על ESID תחת הגדרת הדמיה, והגדר את רווח ESID ל- 4 ואת הרווח הדיגיטלי ל- 7.5.
10. לחץ על אריחים יתד לייצר 210 אריחים.
11. פתח את אסטרטגיית מיקוד ובחר את מצב המוקד.
12. תחת סידרת זמן, הגדר את משך הזמן ל- 24 שעות ואת מרווח הזמן ל- 10 דקות.
13. תחת רכישה, להגדיר את גודל המסגרת ל 512 x 512 פיקסלים, מהירות הסריקה ל 8, הכיוון דו כיווני, הממוצע ל 4x, ואת הסיביות לפיקסל ל 16.
14. לחץ על להתחיל ניסוי כדי להתחיל את הניסוי.

3. שינוי קובץ תמונה

1. תחת עיבוד, לחץ על תפירה, ולהגדיר את הכיסוי המינימלי ל 5% ואת המעבר המקסימלי ל 10%.
2. לחץ על ייצוא הסרט, להגדיר לא דחוס, ולהגדיר את המהירות ל 7.5.

4. חיסון

1. שאפתן את המדיום בזהירות, ולשטוף את המדגם פעמיים עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) במשך 5 דקות.
2. לתקן את המדגם עם 4% פורמלין ב PBS במשך 15 דקות, ולשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
3. לחלחל המדגם ב 0.1% טריטון X-100 ב PBS במשך 10 דקות, ולשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
4. הוסף 250 μL של phalloidin-iFluor 647 מגיב (1:1000 דילול PBS), ולהדגיר את המדגם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר.
5. לשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
6. מעבירים את הכיסוי לשקופית הזכוכית ומוסיפים 2 טיפות של פתרון הרכבה.
7. הנח כיסוי בשקופית בעדינות.
8. לאטום את הכיסוי עם לק ברור ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך עד התאים נצפו.
9. צלם את השקופית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מסנן מתאים בהתרגשות/פליטה (Ex/Em)=650/665 ננומטר עבור פאלודין וב- Ex/Em=488/507 nm עבור EGFP.

תוצאות

אין ויטרו הגירה של MSCs במצב תלת מימדי הוערך על ידי מערכת Transwell או על ידי שיטת ריפוי הפצע המסורתית כדי לצפות הגירה במצב דו מימדי (2D)¹¹. האיבר של קורטי הוא מבנה מורכב המורכב מתאים שונים כגון תאי בוצ'ר, תאי קלאודיוס, תאי דיטר, תאי עמוד, תאי הנסן, תאי שיער החיצוניים, תאי...

Discussion

השתלת MSCs לאתרים פגומים כדי לקדם את ההתחדשות של תאים פגומים נחקרה בהרחבה, ואת ההשפעה הטיפולית ניכרת. ההשתלה והבידול הבאים של MSCs דווחו כדי לשחזר את השמיעה בחולדות עם אובדן שמיעה המושרה על ידי חומצה 3-nitropropionic¹³. למרות לי ואח 'להחיל MSCs על בני אדם טרנס-ורידים, הם לא השיגו שום שיפור משמ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787