הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.

Abstract

סטרואידים סקס, המיוצר על ידי האשכים, לשחק תפקיד חיוני במוח ורקמות יותרת המוח פלסטיות, בשליטה neuroendocrine של רבייה בכל בעלי החוליות על ידי מתן משוב למוח ובלוטות יותרת המוח. דגי טלוסט מחזיקים ברמה גבוהה יותר של פלסטיות רקמות וריאציה באסטרטגיות הרבייה בהשוואה ליונקים ונראה שהם מודלים שימושיים לחקור את תפקידם של סטרואידים מיניים ואת המנגנונים שבאמצעותם הם פועלים. הסרת המקור העיקרי של ייצור סטרואידים מיני באמצעות gonadectomy יחד עם דגימת דם כדי למדוד את רמות הסטרואידים כבר מבוסס היטב למדי אפשרי דגים גדולים יותר, היא טכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים. עם זאת, טכניקות אלה מעלות אתגרים כאשר מיושמות במודלים טלוסט בגודל קטן. כאן, אנו מתארים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה הן אצל זכרים והן אצל נקבה יפנית מדאקה ואחריו דגימת דם. פרוטוקולים אלה מוצגים להיות אפשרי מאוד medaka המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה, בטיחות על תוחלת החיים ואת פנוטיפ של הדג, רבייה במונחים של אישור סטרואידים מין. השימוש בהליכים אלה בשילוב עם היתרונות האחרים של שימוש במודל טלוסט קטן זה ישפר מאוד את ההבנה של מנגנוני משוב בשליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה ופלסטיות רקמות המסופקים על ידי סטרואידים מיניים בחולייתנים.

Introduction

בחולייתנים, סטרואידים מיניים, אשר מיוצרים בעיקר על ידי gonads, לשחק תפקידים חשובים ברגולציה של המוח-יותרת המוח-Gonadal (BPG) ציר באמצעות מנגנוני משוב שונים^1,2,3,4,5. בנוסף, סטרואידים מיניים משפיעים על התפשטות ופעילות של נוירונים במוח^6,7,8 ותאים אנדוקריניים, כולל גונדוטרופים, בבלוטת יותרת המוח^9,10, ובכך משרתים תפקידים מכריעים בפלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח. למרות ידע טוב יחסית ביונקים, המנגנון של ויסות ציר BPG בתיווך סטרואידים מיניים רחוק מלהיות מובן במינים שאינם יונקים, מה שמוביל להבנה לקויה של עקרונות שמורים אבולוציוניים¹¹. יש עדיין מספר מוגבל של מחקרים המתעדים את התפקיד של סטרואידים מיניים על המוח ופלסטיות יותרת המוח, ובכך להעלות את הצורך בחקירות נוספות של התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים על מינים בעלי חוליות מגוונים.

בקרב בעלי חוליות, teleosts הפכו חיות מודל חזקות בטיפול בשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות רבות, כולל תגובת מתח^12,13, צמיחה^14,15, פיזיולוגיה תזונתית^16,17 ורבייה². Teleosts, שבו סטרואידים מיני מיוצגים בעיקר על ידי אסטרדיול (E2) אצל נקבות ו 11-ketotestosterone (11-KT) אצל זכרים^18,19, כבר זמן רב מודלים ניסיוניים אמינים לחקור את העיקרון הכללי של רבייה על פני מינים. Teleosts להראות ייחודיות שלהם חיבור ההיפותלמוס-יותרת המוח^20,21 ותאי גונדוטרופים נפרדים²², אשר לפעמים נוחים להבהרת מנגנונים רגולטוריים. יתר על כן, בשל נוחותם הן לניסויי מעבדה והן לניסויים בשטח, טלוסטים מציעים יתרונות רבים בהשוואה לאורגניזמים אחרים. הם זולים יחסית לרכוש ולתחזק^23,24. בפרט, מודלים טלוסט קטנים כגון דגיזברה (דניו rerio) ואת medaka היפני (Oryzias latipes),הם מינים עם פוריות גבוהה מאוד ומחזור חיים קצר יחסית המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד גנים ומנגנוני מחלות^23,ובכך מספק יתרונות גדולים עוד יותר בטיפול בשפע של שאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, בהתחשב בפרוטוקולים המפותחים הרבים וארגז הכלים הגנטי הזמין למינים אלה²⁵.

במחקרים רבים, הסרת gonads (gonadectomy) יחד עם טכניקות דגימת דם שימשו כשיטה לחקור שאלות פיזיולוגיות רבות, כולל השפעתה על פיזיולוגיה של פוריות חוליות ביונקים^26,27,28, ציפורים²⁹ ודו חיים³⁰. למרות ההשפעה gonadectomy על פיזיולוגיה הרבייה יכול להיות לחילופין החיות על ידי אנטגוניסטים סטרואידים מין, כגון טמוקסיפן ו clomiphene, ההשפעה של התרופות נראה לא עקבי עקב השפעות bimodal^31,32. חשיפה כרונית אנטגוניסט סטרואידים מין עלול להוביל להגדלת השחלות^33,34, אשר עשוי להשבית תצפית של השפעותיו למטרות לטווח ארוך עקב פנוטיפ לא בריא. בנוסף, אי אפשר לבצע ניסוי התאוששות לאחר טיפול אנטגוניסט סטרואידים סקס, כדי להצדיק את ההשפעה הספציפית של סטרואידים מיניים מסוימים. יחד עם אלה נקודות הנ"ל, פשרות אחרות של שימוש אנטגוניסט סטרואידים סקס נבדקו בהרחבה^31,32. לכן, gonadectomy עדיין מופיע היום כדכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים.

בעוד שטכניקות גונדכרטומיה ודגימה בדם קלות יחסית לביצוע במינים גדולים יותר, כגון בס ים אירופאי(Dicentrarchus labrax)³⁵, ראסה ראש כחול(תלאסומה ביפסיאטום)^36,דגי כלבים(Scyliorhinus)³⁷ ושמנונים(Heteropneustes מאובנים וקלאריאס רחקוס)^38,39,הם מעלים אתגרים כאשר מוחלים בדגים קטנים כמו medaka. לדוגמה, השימוש במערכת משלוח הרדמה דגים (FADS)⁴⁰ הוא פחות ריאלי ונראה נוטה נזק פיזי מוגזם עבור דגים קטנים. בנוסף, הליך כריתת גונדקטומיה המשמש בדרך כלל לדגים גדולים יותר⁴⁰ אינו מתאים לדגים קטנים הדורש דיוק גבוה כדי למנוע נזק מוגזם. לבסוף, דגימת דם היא מאתגרת בשל הגישה המוגבלת לכלי הדם וכמות הדם הקטנה בבעלי חיים אלה. לכן, פרוטוקול ברור המדגים כל שלב של כריתת גונדקטומיה ודגימה דם בטלוסט קטן הוא בעל חשיבות.

פרוטוקול זה מדגים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה ואחריו דגימת דם ב Medaka היפנית, דג מים מתוקים קטן שמקורו במזרח אסיה. Medaka היפני יש גנום רצף, כמה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים²⁵, ומערכת קביעת מין גנטי המאפשר לחקור הבדלים מיניים לפני מאפיינים מיניים משניים או gonads מפותחים היטב⁴¹. מעניין לציין שמדקה היפנית מחזיקה בגונדים מותכים בניגוד למינים טלוסטים רבים אחרים⁴². שתי טכניקות אלה יחד לקחת רק 8 דקות בסך הכל וישלים את הרשימה של פרוטוקולי וידאו כבר קיים עבור מין זה שכלל תיוג של כלי הדם⁴³, מהדק תיקון על סעיפים יותרת המוח⁴⁴ נוירונים במוח⁴⁵, ותרבות תאים^{ראשונית 46}. טכניקות אלה יאפשרו לקהילת המחקר לחקור ולהבין טוב יותר את התפקידים של סטרואידים מיניים במנגנוני משוב, כמו גם פלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח בעתיד.

Protocol

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי החיים הניסיונית באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים. ניסויים באמצעות כריתת גונדקטומיה אושרו על ידי הרשות הנורבגית לבטיחות מזון (FOTS ID 24305).

הערה: הניסויים בוצעו באמצעות זכר ונקבה בוגרים (6-7 חודשים, משקל כ 0.35 גרם, אורך כ 2.7 ס"מ) Medaka יפני. המין נקבע על ידי הבחנה המאפיינים המיניים המשניים, כגון גודל וצורה של סנפיר גב ואנאלי, כמתואר^{ב 42,47}.

1. הכנת מכשירים ופתרונות

1. הכן פתרון מלאי הרדמה (0.6% טריקיין).
   1. לדלל 0.6 גרם של Tricaine (MS-222) ב 100 מ"ל של 10x פוספט חוצץ מלוח (PBS).
   2. להפיץ 1 מ"ל של פתרון מלאי Tricaine לתוך כמה צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.
2. הכן מי התאוששות (0.9% פתרון NaCl) על ידי הוספת 18 גרם של NaCl לתוך 2 ליטר של מים באקווריום. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
3. הכן את כלי החתך על ידי שבירת סכין גילוח באלכסון כדי לקבל נקודה חדה(איור 1A).
4. הכן פתרון נוגד קרישה בדם (0.05 U/μL של נתרן הפרין) על ידי דילול 25 μL של נתרן הפרין לתוך 500 μL של 1x PBS. יש לאחסן את הפתרון נוגד קרישה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
5. הכן שתי מחטי זכוכית מזכוכית באורך 90 מ"מ על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מחטים (איור 1B) בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: הקוטר החיצוני של מחט הזכוכית הוא 1 מ"מ, בעוד הקוטר הפנימי הוא 0.6 מ"מ.
6. הכן מכסה צינור פלסטיק בגודל 1.5 מ"ל על ידי חיתוך המכסה ובצע חור שמתאים לקוטר החיצוני של המחט(איור 1C). כדי להפוך את החור, לחמם קצה אחד של נימי זכוכית 9 מ"מ ולדקור את נימי הזכוכית מחומם דרך המכסה. לחלופין, להשתמש במחט כדי לדקור דרך המכסה עד קוטר החור מתאים עם נימי זכוכית 9 מ"מ.

2. הליך כריתת גונדקטומיה

1. הכן 0.02% של פתרון הרדמה על ידי דילול צינור אחד של מניות Tricaine (0.6%) ב 30 מ"ל של מים אקווריום.
2. הכן כלי ניתוח כולל מלקחיים דקים במיוחד ושני מלקחיים עדינים (אחד עם קצה רחב יחסית), מספריים קטנים, חוט ניילון ותער כמתואר בשלב 1.3.
3. מרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה של 0.02% למשך 30-60 שניות.
   הערה: משך ההרדמה תלוי בגודל ובמשקל של הדג ויש להתאים אותו. כדי להבטיח כי הדג הוא מרדים לחלוטין, גוף הדג ניתן לצבוט בעדינות באמצעות מלקחיים. אם הדג לא מגיב, ניתן להתחיל את כריתת הגונדקטומיה.
4. מוציאים את הדגים מהתמיסה ההרדמה ומניחים את הדג אופקית על צידו, מחוץ למים תחת מיקרוסקופ הרדמה.
5. כריתת אובלות (OVX) אצל נקבות
   1. יש להסיר ביצים (ביצים התלויות מחוץ לגוף הנקבה) אם בכלל ולגרד את המאזניים באזור החתכים(איור 2A).
   2. יש לבצע בעדינות חתך באורך של כ-2-2.5 מ"מ בין הצלעות, בין הסנפירים האגן לאנאלי(איור 2A),באמצעות סכין הגילוח. לאחר מכן, לצבוט בעדינות את הבטן דגים תוך לקיחת השחלות לאט לאט באמצעות מלקחיים עדינים עם קצה רחב.
   3. חותכים את קצה השחלות באמצעות מלקחיים עדינים ומניחים את השחלות בצד(איור 2B).
      הערה: יש להקפיד לא לשבור את שק השחלות במידת האפשר. אם שק השחלות שבור, הסר כל עקבות gonad לחלוטין ככל האפשר מבלי להשאיר אפילו כל ביצים שאינן ביוץ.
6. כריתת סחלב אצל זכרים
   1. יש לבצע בעדינות חתוך בין הצלעות שמעל פי הטבעת (איור 2A), ולפתוח את החתירה באיטיות באמצעות מלקחיים עדינים.
   2. תפסו בעדינות את האשכים באמצעות המלקחיים העדינים ואיטיות הוציאו את האשכים. לאחר מכן, חתכו את קצה האשכים כדי להסיר לחלוטין את האשכים (איור 2B). לכריתת סחלבים זכרים, כל ההכנות דומות לנקבות עד לחלק ההחתכה. כאשר תופסים את האשכים, לפעמים השומן הדומה האשכים מתקבל. עם זאת, לאחר שחזור השומן, ניתן לנסות למצוא את האשכים שוב (איור 2B).
      הערה: הן עבור זכרים והן עבור נקבות, חשוב למזער את גודל ההסתה בבטן כדי למנוע נזק מוגזם שיכול להוביל לתמותה. לפעמים המעיים עשויים להופיע גם דרך ההסתעפות יחד עם הגונדים, כדי לוודא שהם מוחזרים כראוי בתוך ההסתעפות לפני הסגירה. ידע מוקדם על השחלות ומיקום האשכים בבטן מדאקה הוא חיוני.
7. לתבל את החתירה באופן דומה אצל זכרים ונקבות(איור 3).
   1. מניחים את חוט הניילון ליד אזור ההשתכה ודוקרים את העור מצד ימין של ההשתכה דרך חלל הגוף הפנימי באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקחת את החוט במלקחיים עדינים (איור 3;1-2).
   2. דקרו את העור מצד שמאל של ההסתעפות דרך חלל הגוף החיצוני כדי להוציא את החוט (איור 3;3-4).
   3. סגור את פתח החתך ובצע שני קשרים וחתוך את החוט המוגזם (איור 3;4-6).
      הערה: התפר חייב להיות הדוק כראוי, ואת החוט הנותר על הדג חייב להיות ארוך מספיק כדי למנוע התרופפות של התפר. כל ההליך מהרדמה עד תפירה בדרך כלל לוקח עד 6 דקות. זמן רב יותר עלול להוביל לתמותה.
   4. שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום.
      הערה: דג Gonadectomized בדרך כלל להראות התנהגות נורמלית לאחר 1-2 שעות במי ההתאוששות. לכן, בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לדגום את הדגים לאחר מרווח זמן זה.

3. הליך דגימת דם

1. הכן את הכלים: מחט זכוכית, נימי סיליקון, צינור פלסטיק עם חור, צינור פלסטיק ריק 1.5 מ"ל, מיני צנטריפוגה וסרט הדבקה.
2. יש להעשיר את הדגים באמצעות פתרון הרדמה של 0.02% כמתואר בשלב 2.1 ולהניח את הדגים מתחת למיקרוסקופ ניתוח במיקום אנכי (איור 4A). מניחים את הדג על משטח בהיר כדי להקל על ההדמיה של וריד הדקירה.
3. התקן את מגירת הדם על ידי חיבור מחט זכוכית לנופלרי הסיליקון(איור 4B). לשבור את קצה המחט עם מלקחיים קצה רחב וציפוי החלק הפנימי של המחט עם פתרון נוגד קרישה על ידי שאיבה ופיצוץ.
   הערה: השימוש של פראייר נימי סיליקון עם אורך של לפחות 50 ס"מ מומלץ לאמצעי בטיחות כדי למנוע כל מגע ישיר של הדם בעת שאיבה. בנוסף, ודא כי פתיחת קצה המחט הוא גדול מספיק כדי לאפשר ציור הדם.
4. כוון את המחט לכיוון אזור הדו-פדנקל של הדג, כוון לווריד הדו-פדונקל(איור 5A)ומשוך את הדם באמצעות הפה עד שלפחות רבע מהנפח הכולל של המחט יתמלא (איור 5B).
   הערה: חשוב להפסיק לניקה לפני הסרת המחט מגוף הדג.
5. שחרר את המחט ולשים חתיכת קלטת בסמיכות של הצד החד של המחט. הניחו את המכסה עם חור בצינור איסוף והכניסו את המחט לתוך הצינור דרך החור עם קצה המחט מבחוץ(איור 5C).
6. שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום.
   הערה: כדי לבצע דגימת דם שנייה מאותו דג, לדגום את הדם שבוע לאחר דגימת הדם הראשונה.
7. פלאש לסובב את הדם שנאסף במשך 1-2 שניות עם 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הדם בצינור.
8. המשך ישירות ליישומים במורד הזרם או לאחסן את הדם ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.
   הערה: עיין במחקר הקודם עבור מיצוי סטרואידים סקס מכל הדם⁴⁸.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כל צעד לביצוע כריתת גונדקטומיה ודגימה בדם בטלוסט מודל בגודל קטן, medaka היפני. שיעור ההישרדות של הדגים לאחר כריתת השחלות (OVX) אצל הנקבות הוא 100% (10 מתוך 10 דגים) ואילו 94% (17 מתוך 18 דגים) של הזכרים שרדו לאחר כריתת סחלב. בינתיים, לאחר שבוצע הליך דגימת הדם, שרדו כל הדגי...

Discussion

כפי שדווח בספרות קודמת, gonadectomy ודגימה דם שימשו זמן רב במינים מודל אחרים כדי לחקור שאלות הקשורות לתפקיד של סטרואידים מיניים ברגולציה של ציר BPG. עם זאת, טכניקות אלה נראה מקובל רק עבור בעלי חיים גדולים יותר. בהתחשב בגודל הקטן של מודל הטלוסט הנפוץ, medaka יפנית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור gonadectomy...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry