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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Sexualsteroide, die von den Gonaden produziert werden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophysengewebe und bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung bei allen Wirbeltieren, indem sie dem Gehirn und der Hypophyse Rückmeldung geben. Teleostfische besitzen im Vergleich zu Säugetieren einen höheren Grad an Gewebeplastizität und Variation der Fortpflanzungsstrategien und scheinen nützliche Modelle zu sein, um die Rolle von Sexualsteroiden und die Mechanismen, mit denen sie wirken, zu untersuchen. Die Entfernung der Hauptquelle der Sexualsteroidproduktion durch Gonadektomie zusammen mit Blutentnahme zur Messung des Steroidspiegels ist bei größeren Fischen gut etabliert und ziemlich machbar und ist eine leistungsstarke Technik, um die Rolle und Auswirkungen von Sexualsteroiden zu untersuchen. Diese Techniken werfen jedoch Herausforderungen auf, wenn sie in kleinen Teleostmodellen implementiert werden. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren der Gonadektomie sowohl bei Männern als auch bei weiblichen japanischen Medakas, gefolgt von Blutentnahmen. Diese Protokolle haben sich in Medaka als sehr praktikabel erwiesen, was durch eine hohe Überlebensrate, Sicherheit für die Lebensdauer und den Phänotyp der Fische und Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Clearance von Sexualsteroiden angezeigt wird. Die Verwendung dieser Verfahren in Kombination mit den anderen Vorteilen der Verwendung dieses kleinen Teleostmodells wird das Verständnis der Rückkopplungsmechanismen bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung und der Gewebeplastizität von Sexualsteroiden bei Wirbeltieren erheblich verbessern.

Einleitung

Bei Wirbeltieren spielen Sexualsteroide, die hauptsächlich von den Gonaden produziert werden, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gehirn-Hypophysen-Gonaden-Achse (BPG) durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen1,2,3,4,5. Darüber hinaus beeinflussen Sexualsteroide die Proliferation und Aktivität von Neuronen im Gehirn6,7,8 und endokrinen Zellen, einschließlich Gonadotropen, in der Hypophyse9,10und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophyse. Trotz relativ guter Kenntnisse bei Säugetieren ist der Mechanismus der BPG-Achsenregulation, der durch Sexualsteroide vermittelt wird, bei Nicht-Säugetierarten weit davon entfernt, verstanden zu werden, was zu einem schlechten Verständnis der evolutionär konservierten Prinzipien führt11. Es gibt immer noch eine begrenzte Anzahl von Studien, die die Rolle von Sexualsteroiden auf die Plastizität von Gehirn und Hypophyse dokumentieren, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Rolle und der Auswirkungen von Sexualsteroiden auf verschiedene Wirbeltierarten erhöht.

Unter den Wirbeltieren sind Teleoste zu mächtigen Modelltieren geworden, die zahlreiche biologische und physiologische Fragen beantworten, einschließlich Stressreaktion12,13, Wachstum14,15, Ernährungsphysiologie16,17 und Fortpflanzung2. Teleosten, bei denen Sexualsteroide hauptsächlich durch Östradiol (E2) bei Weibchen und 11-Ketotestosteron (11-KT) bei Männchen18,19vertreten sind, sind seit langem zuverlässige experimentelle Modelle zur Untersuchung des allgemeinen Prinzips der Fortpflanzung über Arten hinweg. Teleoste zeigen Einzigartigkeit in ihrer Hypothalamus-Hypophysen-Verbindung20,21 und verschiedenen Gonadotropzellen22, die manchmal für die Aufklärung von Regulationsmechanismen geeignet sind. Darüber hinaus bieten Teleoste aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Labor- und Feldexperimente viele Vorteile gegenüber anderen Organismen. Sie sind relativ kostengünstig in der Anschaffung und Wartung23,24. Insbesondere kleine Teleostmodelle wie Zebrafische (Danio rerio) und die japanische Medaka (Oryzias latipes) sind Arten mit sehr hoher Fruchtbarkeit und einem relativ kurzen Lebenszyklus, die eine schnelle Analyse der Genfunktion und Krankheitsmechanismen ermöglichen23, was angesichts der zahlreichen gut entwickelten Protokolle und des genetischen Toolkits, die für diese Arten verfügbar sind, noch größere Vorteile bei der Behandlung einer Vielzahl biologischer und physiologischer Fragen bietet25.

In zahlreichen Studien wurde die Entfernung von Gonaden (Gonadektomie) zusammen mit Blutentnahmetechniken als Methode zur Untersuchung vieler physiologischer Fragen verwendet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Fortpflanzungsphysiologie von Wirbeltieren bei Säugetieren26,27,28,Vögeln 29 und Amphibien30. Obwohl die Gonadeektomie-Wirkung auf die Fortpflanzungsphysiologie alternativ von Sexualsteroidantagonisten wie Tamoxifen und Clomifen nachgeahmt werden kann, scheint die Wirkung der Medikamente aufgrund bimodaler Wirkungen inkonsistent zu sein31,32. Chronische Exposition gegenüber einem Sexualsteroidantagonisten kann zu einer Ovarialvergrößerung führen33,34, die die Beobachtung seiner Auswirkungen für langfristige Zwecke aufgrund eines ungesunden Phänotyps deaktivieren kann. Darüber hinaus ist es unmöglich, ein Erholungsexperiment nach der Behandlung mit Sexualsteroidantagonisten durchzuführen, um die spezifische Wirkung bestimmter Sexualsteroide zu gewährleisten. Zusammen mit diesen oben genannten Punkten wurden andere Kompromisse bei der Verwendung von Sexsteroid-Antagonisten ausführlich überprüft31,32. Daher erscheint die Gonadektomie auch heute noch als eine leistungsfähige Technik, um die Rolle von Sexualsteroiden zu untersuchen.

Während Gonadektomie- und Blutentnahmetechniken bei größeren Arten wie dem Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)35, Dem Blaukopflippfisch (Thalassoma bifasciatum)36, Dornhai (Scyliorhinus canicula)37 und Wels (Heteropneustes fossilis und Clarias bathracus)38,39) relativ einfach durchzuführen sind, stellen sie Herausforderungen dar, wenn sie bei kleinen Fischen als Medaka angewendet werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 weniger machbar und scheint anfällig für übermäßige körperliche Schäden für kleine Fische zu sein. Darüber hinaus ist ein Gonadektomieverfahren, das üblicherweise für größere Fische40 verwendet wird, nicht für kleine Fische geeignet, die eine hohe Präzision erfordern, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Schließlich ist die Blutentnahme aufgrund des begrenzten Zugangs zu Blutgefäßen und der geringen Blutmenge bei diesen Tieren eine Herausforderung. Daher ist ein klares Protokoll, das jeden Schritt der Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Teleost demonstriert, von Bedeutung.

Dieses Protokoll demonstriert die Schrittweisen Verfahren der Gonadektomie, gefolgt von Blutentnahmen in japanischen Medaka, einem kleinen Süßwasserfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Japanische Medaka haben ein sequenziertes Genom, mehrere molekulare und genetische Werkzeuge zur Verfügung25und ein genetisches Geschlechtsbestimmungssystem, das die Untersuchung sexueller Unterschiede ermöglicht, bevor sekundäre Geschlechtsmerkmale oder Gonaden gut entwickelt sind41. Interessanterweise besitzen japanische Medaka verschmolzene Gonaden im Gegensatz zu vielen anderen Teleost-Arten42. Diese beiden Techniken zusammen dauern insgesamt nur 8 Minuten und vervollständigen die Liste der bereits für diese Spezies vorhandenen Videoprotokolle, darunter die Markierung von Blutgefäßen43,Patch-Clamp an Hypophysenabschnitten44 und Gehirnneuronen45und primäre Zellkultur46. Diese Techniken werden es der Forschungsgemeinschaft ermöglichen, die Rolle von Sexualsteroiden in Feedback-Mechanismen sowie die Plastizität von Gehirn und Hypophyse in Zukunft zu untersuchen und besser zu verstehen.

Protokoll

Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegian University of Life Sciences durchgeführt. Experimente mit Gonadeektomie wurden von der norwegischen Behörde für Lebensmittelsicherheit genehmigt (FOTS ID 24305).

HINWEIS: Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen und weiblichen (6-7 Monate alt, Gewicht ca. 0,35 g, Länge ca. 2,7 cm) japanischen Medaka durchgeführt. Das Geschlecht wurde durch Unterscheidung der sekundären Geschlechtsmerkmale, wie größe und Form der Rücken- und Afterflosse, wie in42,47beschrieben bestimmt.

1. Vorbereitung von Instrumenten und Lösungen

  1. Bereiten Sie anästhetische Stammlösung (0,6% Tricain) vor.
    1. Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).
    2. 1 ml der Tricain-Stammlösung in mehrere 1,5 mL Kunststoffröhrchen verteilen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
  2. Bereiten Sie Auflischerwasser (0,9% NaCl-Lösung) vor, indem Sie 18 g NaCl in 2 l Aquarienwasser geben. Lagern Sie die Lösung bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie die Schnittwerkzeuge vor, indem Sie einen Rasierer diagonal brechen, um einen scharfen Punkt zu erhalten (Abbildung 1A).
  4. Herstellung einer gerinnungshemmenden Blutlösung (0,05 U/μL Natrium heparin), indem 25 μL Natrium heparin in 500 μL 1x PBS verdünnt werden. Lagern Sie die gerinnungshemmende Lösung bis zum Gebrauch bei 4 °C.
  5. Bereiten Sie zwei Glasnadeln aus einer 90 mm langen Glaskapillare vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Nadelzieher ziehen (Abbildung 1B) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: Der Außendurchmesser der Glasnadel beträgt 1 mm, während der Innendurchmesser 0,6 mm beträgt.
  6. Bereiten Sie einen 1,5-ml-Kunststoffrohrdeckel vor, indem Sie den Deckel schneiden und ein Loch machen, das zum Außendurchmesser der Nadel passt (Abbildung 1C). Um das Loch zu machen, erhitzen Sie ein Ende der 9 mm Glaskapillar und stechen Sie die erhitzte Glaskapillar durch den Deckel. Alternativ stechen Sie mit einer Nadel durch den Deckel, bis der Durchmesser des Lochs mit der 9-mm-Glaskapillare zusammenpasst.

2. Gonadektomie

  1. Bereiten Sie 0,02% der Anästhesielösung vor, indem Sie eine Tube Tricain-Brühe (0,6%) in 30 ml Aquarienwasser verdünnen.
  2. Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich einer ultrafeinen und zwei feinen Heppzette (eine mit relativ breiter Spitze), einer kleinen Schere, einem Nylonfaden und einem Rasierer, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
  3. Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-60 Sekunden in die 0,02% ige Anästhesielösung legen.
    HINWEIS: Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe und dem Gewicht des Fisches ab und muss angepasst werden. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kann der Fischkörper mit einer Zette sanft eingeklemmt werden. Reagiert der Fisch nicht, kann mit der Gonadektomie begonnen werden.
  4. Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung heraus und legen Sie den Fisch horizontal auf die Seite, außerhalb des Wassers unter einem Seziermikroskop.
  5. Ovariektomie (OVX) bei Frauen
    1. Entfernen Sie eiabgelagerte Eier (Eier, die außerhalb des weiblichen Körpers hängen), falls vorhanden, und kratzen Sie die Schuppen im Schnittbereich (Abbildung 2A).
    2. Machen Sie vorsichtig einen etwa 2-2,5 mm langen Schnitt zwischen den Rippen, zwischen den Becken- und Afterflossen (Abbildung 2A) mit der Rasierklinge. Dann kneifen Sie vorsichtig den Fischbauch, während Sie die Eierstöcke nach und nach mit einer feinen Zette mit breiter Spitze herausnehmen.
    3. Schneiden Sie das Ende der Eierstöcke mit einer feinen Zette ab und legen Sie die Eierstöcke beiseite (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, den Eierstocksack möglichst nicht zu brechen. Wenn der Eierstocksack gebrochen ist, entfernen Sie alle Gonadenspuren so vollständig wie möglich, ohne auch nur nicht eisprungende Eier zu hinterlassen.
  6. Orchidektomie bei Männern
    1. Machen Sie vorsichtig einen Schnitt zwischen den Rippen über dem Anus (Abbildung 2A) und öffnen Sie den Schnitt langsam mit einer feinen Zette.
    2. Greifen Sie die Hoden vorsichtig mit der feinen Zinnen und nehmen Sie die Hoden langsam heraus. Schneiden Sie anschließend das Ende der Hoden ab, um die Hoden vollständig zu entfernen (Abbildung 2B). Bei der männlichen Orchidektomie sind alle Präparate bis zum Schnittteil ähnlich wie bei Denbinnen. Beim Greifen der Hoden wird manchmal das Fett erhalten, das den Hoden ähnelt. Nach der Wiederherstellung des Fettes ist es jedoch möglich, die Hoden wieder zu finden (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Sowohl für Männer als auch für Frauen ist es wichtig, die Schnittgröße im Bauch zu minimieren, um übermäßige Schäden zu vermeiden, die zur Mortalität führen können. Manchmal kann der Darm auch durch den Schnitt zusammen mit den Gonaden erscheinen, also stellen Sie sicher, dass sie vor dem Verschluss ordnungsgemäß in den Schnitt zurückgeführt werden. Vorkenntnisse über die Lage der Eierstöcke und Hoden im Medaka-Abdomen sind unerlässlich.
  7. Nähen Sie den Schnitt ähnlich bei Männchen und Weibchen (Abbildung 3).
    1. Legen Sie den Nylonfaden neben den Schnittbereich und stechen Sie die Haut von der rechten Seite des Schnitts durch die innere Körperhöhle mit einer ultrafeinen Zette, um den Faden mit einer feinen Zette aufzunehmen (Abbildung 3; 1-2).
    2. Stechen Sie die Haut von der linken Seite des Schnitts durch die äußere Körperhöhle, um den Faden herauszunehmen ( Abbildung 3; 3-4).
    3. Schließen Sie die Schnittöffnung und machen Sie zwei Knoten und schneiden Sie den überschüssigen Faden (Abbildung 3; 4-6).
      HINWEIS: Die Naht muss ausreichend dicht sein, und der verbleibende Faden am Fisch muss lang genug sein, um eine Lockerung der Naht zu verhindern. Der gesamte Vorgang von der Anästhesie bis zum Nähen dauert in der Regel bis zu 6 Minuten. Längere Zeit kann zur Sterblichkeit führen.
    4. Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten.
      HINWEIS: Gonadectomisierte Fische zeigen normalerweise nach 1-2 Stunden im Erholungswasser ein normales Verhalten. Daher kann man je nach Versuchszweck den Fisch nach diesem Zeitintervall beproben.

3. Blutentnahmeverfahren

  1. Bereiten Sie die Werkzeuge vor: eine Glasnadel, eine Silikonkapillare, ein Kunststoffröhrchen mit einem Loch, ein leeres 1,5-ml-Kunststoffrohr, eine Minizentrifuge und Klebeband.
  2. Betäuben Sie den Fisch mit einer 0,02%igen Anästhesielösung wie in Schritt 2.1 beschrieben und legen Sie den Fisch unter ein Dissektionsmikroskop in vertikaler Position (Abbildung 4A). Legen Sie den Fisch auf eine helle Oberfläche, um die Visualisierung der kaudalen Punktionsvene zu erleichtern.
  3. Installieren Sie das Blutentnahmeband, indem Sie eine Glasnadel an der Silikonkapillare befestigen (Abbildung 4B). Brechen Sie die Nadelspitze mit einer breiten Spitzenzette und beschichten Sie die Innenseite der Nadel mit gerinnungshemmender Lösung durch Absaugen und Blasen.
    HINWEIS: Die Verwendung eines Saugers und einer Silikonkapillare mit einer Länge von mindestens 50 cm wird für Sicherheitsmaßnahmen empfohlen, um einen direkten Kontakt des Blutes beim Absaugen zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Öffnung der Nadelspitze ausreichend groß ist, um das Blut zu ziehen.
  4. Richten Sie die Nadel auf den Stielbereich des Fisches, zielen Sie auf die Schwanzstielvene (Abbildung 5A) und ziehen Sie das Blut mit dem Mund, bis mindestens ein Viertel des Gesamtvolumens der Nadel gefüllt ist (Abbildung 5B).
    HINWEIS: Es ist wichtig, das Absaugen zu stoppen, bevor Sie die Nadel aus dem Fischkörper entfernen.
  5. Lassen Sie die Nadel los und legen Sie ein Stück Klebeband in die Nähe der scharfen Seite der Nadel. Setzen Sie den Deckel mit einem Loch auf ein Auffangrohr und stecken Sie die Nadel in das Rohr durch das Loch mit der Nadelspitze an der Außenseite (Abbildung 5C).
  6. Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten.
    HINWEIS: Um eine zweite Blutentnahme von demselben Fisch durchzuführen, entnehmen Sie das Blut eine Woche nach der ersten Blutentnahme.
  7. Flash Spin das gesammelte Blut für 1-2 Sekunden mit 1.000 x g bei Raumtemperatur, um das Blut in der Röhre zu sammeln.
  8. Fahren Sie direkt mit den nachgeschalteten Anwendungen fort oder lagern Sie das Blut bis zur Verwendung bei -20 °C.
    HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die vorherige Studie für die Extraktion von Sexualsteroiden aus dem Vollblut48.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Durchführung von Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Modellteletost, dem japanischen Medaka. Die Überlebensrate der Fische nach Ovariektomie (OVX) bei Weibchen beträgt 100% (10 von 10 Fischen), während 94% (17 von 18 Fischen) der Männchen nach orchidektomie überlebten. In der Zwischenzeit, nachdem die Blutentnahme durchgeführt wurde, überlebten alle (38 Fische) Fische.

Diskussion

Wie in früheren Literaturliteratur berichtet, werden Gonadektomie und Blutentnahme seit langem in anderen Modellarten verwendet, um Fragen im Zusammenhang mit der Rolle von Sexualsteroiden bei der Regulierung der BPG-Achse zu untersuchen. Diese Techniken scheinen jedoch nur für größere Tiere geeignet zu sein. In Anbetracht der geringen Größe des häufig verwendeten Teleostmodells, der japanischen Medaka, bieten wir ein detailliertes Protokoll für Gonadektomie und Blutentnahme, das für diese Spezies machbar ist.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Frau Lourdes Carreon G Tan für ihre Unterstützung bei der Fischzucht. Diese Arbeit wurde von NMBU, Grants-in-Aid der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummer 18H04881 und 18K19323) und Zuschüssen für Grundlagenforschungsprojekte von der Sumitomo Foundation an S.K.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass capilaryGD1Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium saltH4784-1GSigma-aldrich
Needle pullerP97Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon threadN45VLPolyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tubeT9661Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade-Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillarya16090800ux0403Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
TricaineWXBC9102VAldrich chemistry

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