小さいテレオストモデル日本メダカにおけるゴナデクトミーと血液サンプリング手順 (オリジアス ラティプ )

要約

この記事では、動物生理学における性ステロイドの役割を調べるため、小型テレオスト魚から血液を血液に血液をサンプル化するクイックプロトコルについて説明し、日本のメダカ(Oryzias latipes)をモデルとして使用する。

要約

性ステロイド, 生殖腺によって生成, 脳と下垂体組織の可塑性と脳と下垂体にフィードバックを提供することにより、すべての脊椎動物の生殖の神経内分泌制御に不可欠な役割を果たしています。.テレオストの魚は、哺乳類と比較して生殖戦略の組織可塑性と変動の高い程度を持っており、性ステロイドの役割とそれらが作用するメカニズムを調査するのに有用なモデルであるように見える。ステロイドのレベルを測定する血液サンプリングと一緒にゴナデクトミーを使用してセックスステロイド生産の主なソースの除去は、確立されており、大きな魚でかなり実現可能であり、性ステロイドの役割と効果を調査するための強力な技術です..しかし、これらの手法は、小型テレオストモデルで実装する場合の課題を引き起こします。ここでは、男性と女性の両方の日本式メダカにおけるゴナデクトミーのステップバイステップの手順と、血液サンプリングについて述べています。これらのプロトコルは、高い生存率、魚の寿命および表現型の安全性、およびセックスステロイドクリアランスの点で再現性によって示されるメダカにおいて非常に実現可能であることが示されている。これらの手順をこの小さなテレオストモデルを使用する他の利点と組み合わせることで、脊椎動物のセックスステロイドによって提供される生殖および組織可塑性の神経内分泌制御におけるフィードバック機構の理解が大幅に向上する。

概要

脊椎動物において、主に生殖腺によって産生される性ステロイドは、様々なフィードバック機構^{1、2、3、4、5}を介して脳下垂体-性腺(BPG)軸の調節において重要な役割^を果たす。さらに、性ステロイドは脳内のニューロンの増殖と活動に影響を与える^6,7,8およびゴナドロープを含む内分泌細胞, 下垂体^9,10,したがって、脳および下垂体の可塑性において重要な役割を果たす.哺乳類における比較的良い知識にもかかわらず、性ステロイドによって媒介されるBPG軸調節のメカニズムは、非哺乳類種において理解されるどころか、進化的保存原理¹¹の理解が不十分に至る。脳と下垂体の可塑性に対する性ステロイドの役割を文書化する研究はまだ限られています, したがって、多様な脊椎動物種に対するセックスステロイドの役割と効果のさらなる調査の必要性を高めます.

脊椎動物の中でも、テレオストは、ストレス応答^12、13、成長14、15、栄養生理学^16、17および再生²を含む多数の生物学的および生理学的な質問に対処する上で強力なモデル動物となっている。テレオスト, セックスステロイドは、主にエストラジオール (E2) 女性と 11-ケトテストステロン (11-KT) 男性で^18,19,長い間、種間の再生の一般的な原則を調査するための信頼性の高い実験モデルとなっています。テレオストは視床下部下垂体の接続^{20、21および}別個のゴナドロープ細胞²²に固有性を示し、調節機構の解明に便利な場合もある。さらに、実験室および現場実験の両方に対する彼らのアノニアビリティのために、テレオストは他の生物と比較して多くの利点を提供する。彼らは^{購入し、23、24}を維持するために比較的安価です。特に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)や日本のメダカ(Oryzias latipes)などの小型テレオストモデルは、非常に高い胎児性と比較的短いライフサイクルを有する種であり、遺伝子機能と疾患機構の迅速な分析を可能にする²³の、したがって、これらの多くのよく発達したプロトコルおよび生理学的な質問に対処する上でさらに大きな利点を提供^する。

多くの研究において、血液採取技術とともに生殖腺(ゴナ16分法)の除去は、哺乳類^{26、27、28、}鳥²⁹および両生類^における脊椎動物生殖生理学におけるその影響を含む多くの生理学的な問題を調査する方法として用いられてきた。生殖生理学に対するゴナ16次切開効果は、タモキシフェンやクロミフェンなどの性ステロイド拮抗薬によって代替的に模倣することができるが、薬物の効果は、バイモーダル効果^31、32のために矛盾しているように見える。セックスステロイド拮抗薬への慢性暴露は、卵巣の拡大につながる可能性があります^33,34, 不健康な表現型のために長期的な目的のためのその効果の観察を無効にする可能性があります..さらに,セックスステロイドアンタゴニスト治療後の回復実験を行うことは不可能であり,特定の性ステロイドの特定の効果を保証する。これらの前述の点と共に、セックスステロイド拮抗薬使用の他のトレードオフは広範囲にレビューされています^31,32.したがって, ゴナ十二分法はまだセックスステロイドの役割を調査するための強力な技術として今日表示されます。.

ゴナ16次切毛と血液サンプリング技術は、より大きな種では比較的簡単に行うことができますが、 ヨーロッパのシーバス(ディセントラーチ・ラブラクス^)35、ブルーヘッド・ラッセ(タラソマ・ビファシアタム^)36、ドッグフィッシュ(シリオリヌス・カニクル^)37)、ナマズ(ヘテロプノウステス化石とクラリアス・バトラカス)など、小さな魚にmedkaとして適用すると課題を提起します。例えば,魚類麻酔デリバリーシステム(FADS)40の使用は実現可能性が低く、小魚に対して過度の物理的損傷を受けやすいようです。さらに、大きな魚⁴⁰に一般的に使用されるゴナデクトミーの手順は、過度の損傷を避けるために高精度を必要とする小さな魚には適していません。最後に、血液採取は、血管へのアクセスが限られており、それらの動物の血液量が少ないため、困難です。したがって、小さなテレオストにおけるゴナ16次除術と血液サンプリングのあらゆるステップを示す明確なプロトコルが重要である。

このプロトコルは、東アジア原産の小さな淡水魚である日本のメダカでの血液サンプリングに続いて、ゴナデクトミーのステップバイステップの手順を示しています。日本のメダカは、配列ゲノム、いくつかの分子および遺伝的ツールを利用できる^25、および二次性徴または生殖腺が十分^{に発達する}前に性的差異の調査を可能にする遺伝的性決定システムを有する。興味深いことに、日本のメダカは、他の多くのテレオスト種⁴²に反して融合性腺を持っています。これらの2つの技術を組み合わせると合計で8分しかかからず、血管⁴³の標識、下垂体セクション⁴⁴ および脳神経細胞⁴⁵のパッチクランプ、および一次細胞培養⁴⁶を含むこの種のために既に存在するビデオプロトコルのリストを完成させる。これらの技術は調査し、よりよく、将来的に脳と下垂体の可塑性と同様、フィードバックメカニズムでセックスステロイドの役割を調査し、理解する研究コミュニティを可能にします。.

プロトコル

すべての実験と動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学の実験動物福祉に関する勧告に従って行われました。ゴナデケーションを用いた実験は、ノルウェー食品安全局(FOTS ID 24305)によって承認されました。

※実験は、成人男性と女性(生後6~7ヶ月、体重ca.0.35g、長さ2.7cm)を用いて行いました。性別は^、42,47に記載されているように背部と肛門ひれの大きさや形などの二次性徴を区別することによって決定した。

1. 機器およびソリューションの準備

1. 麻酔ストック溶液(0.6%トリケーヌ)を準備します。
   1. 100 mL の 100 mL のトリケーヌ (MS-222) の 0.6 g を 10x リン酸緩衝塩水 (PBS) で希釈します。
   2. トリケーヌストック溶液1 mLを複数の1.5mLプラスチックチューブに分配し、使用するまで-20 °Cで保管します。
2. 水槽水の2 LにNaClの18 gを加えることによって回収水(0.9%NaCl溶液)を準備します。使用するまで室温で溶液を保管してください。
3. 鋭い点を得るために斜めにカミソリを破って切開ツールを準備します(図1A)。
4. 25 μLのヘパリンを1x PBSの500 μLに希釈して、血液抗凝固液溶液(0.05 U/μLのヘパリンナトリウム)を調製します。使用するまで4°Cで抗凝固液を保管してください。
5. 長さ90mmのガラスキャピラリーから、針の引き手でガラスの毛細管を引っ張って2本のガラス針を準備します(図1B)。メーカーの指示に従ってください。
   注:ガラス針の外径は1mm、内径は0.6mmです。
6. 蓋を切って1.5mLのプラスチックチューブ蓋を用意し、針の外径に合った穴を作ります(図1C)。穴を作るために、9 mm ガラスキャピラリーの一方の端を加熱し、蓋を通して加熱されたガラスの毛細管を刺します。あるいは、穴の直径が9mmガラスキャピラリーに収まるまで、針を使用して蓋を通します。

2. ゴナデケーションの手順

1. 水槽水の30 mLにトリケーヌストック(0.6%)の1チューブを希釈することにより、麻酔液の0.02%を調製します。
2. ステップ1.3で説明したように、1つの超微細および2つの細かい鉗子(1つは比較的広い先端を持つもの)、小さいはさみ、ナイロン糸およびカミソリを含む解剖用具を準備する。
3. 30-60秒間0.02%麻酔液に入れて魚を麻酔します。
   注:麻酔の持続時間は、魚の大きさと重量に依存し、適応する必要があります。魚が完全に麻酔されていることを確認するために、魚の体は鉗子を使用して穏やかにつまむことができます。魚が反応しない場合は、ゴナデカトミーを開始することができます。
4. 麻酔液から魚を取り出し、魚を横に水平に置き、解剖顕微鏡の下で水を出します。
5. 女性の卵巣切り下切れ(OVX)
   1. 卵(女性の体の外にぶら下がっている卵)があれば取り除き、切開部の鱗を削り取る(図2A)。
   2. かみそり刃を使用して、骨盤と肛門フィン(図2A)の間の長さ約2〜2.5mmの長さを穏やかに切開します。その後、細かい鉗子を使って少しずつ卵巣を取り出しながら、魚の腹部を優しくつまみます。
   3. 細かい鉗子を使って卵巣の端を切り取り、卵巣を脇に置く(図2B)。
      注:可能であれば、卵巣嚢を壊さないことに注意してください。卵巣嚢が壊れている場合は、非排卵卵卵を残すことなく、可能な限り完全に生殖腺の痕跡を取り除きます。
6. 男性の蘭十次体
   1. アヌスの上の肋骨の間を静かに切開し(図2A)、細かい鉗子を使ってゆっくりと切開を切開する。
   2. 細かい鉗子を使って精巣をそっとつかみ、ゆっくりと精巣を取り出します。その後、精巣の終わりを切って精巣を完全に取り除きます(図2B)。男性の蘭十二次切開術の場合、すべての製剤は、切開部まで女性に似ています。精巣をつかむと、精巣に似た脂肪が得られることもある。しかし、脂肪を復元した後、再度精巣を見つけようとすることが可能です(図2B)。
      注:男性と女性の両方にとって、死亡率につながる過度の損傷を防ぐために、腹部の切開サイズを最小限に抑えることが重要です。時には、腸はまた、生殖腺と一緒に切開を通して現れることがありますので、閉鎖前に切開の中で適切に戻されていることを確認してください。卵巣と精巣の位置に関する事前の知識は、メダカ腹部に不可欠です。
7. 男性と女性でも同様に切開を縫合する(図3)。
   1. ナイロン糸を切開領域の横に置き、細かい鉗子で糸を取り込むために超微細な鉗子を使用して内体腔を通して切開の右側から皮膚を刺す(図3;1-2)。
   2. 切開の左側から外側の体腔を通して皮膚を刺して糸を取り出す(図3;3-4)。
   3. 切開口を閉じ、2つの結び目を作り、過度の糸を切ります(図3;4-6)。
      注:縫合糸は十分にタイトでなければならず、魚の残りの糸は縫合糸の緩み防止に十分な長さでなければなりません。麻酔から縫合までの手順全体は、一般的に最大6分かかります。長い時間は、死亡率につながる可能性があります。
   4. 魚を回収水に入れ、少なくとも24時間放置してから、水槽システムに移します。
      注:ゴナデクトマイズ化された魚は、通常、回復水の1〜2時間後に正常な行動を示します。したがって、実験目的に応じて、この時間間隔の後に魚をサンプリングすることができる。

3. 血液採取手順

1. 工具を準備する:ガラス針、シリコーンキャピラリー、穴付きのプラスチックチューブ、空の1.5 mLプラスチックチューブ、ミニセントリフュージとテープ。
2. ステップ2.1で説明したように0.02%の麻酔液を使用して魚を麻酔し、魚を垂直位置の解剖顕微鏡の下に置く(図4A)。尾栓穿刺静脈の可視化を容易にするために、明るい表面に魚を置きます。
3. シリコンキャピラリーにガラスの針を取り付けて、血液引き出しを取り付けます(図4B)。広い先端鉗子で針の先端を破り、吸引と吹き付けによって抗凝固液溶液で針の内側をコーティングします。
   注:吸盤と少なくとも50 cmの長さのシリコーンキャピラリーの使用は、吸引時に血液の直接接触を避けるために安全対策のために推奨されます。また、針先の開口が血液を引き出すのに十分な大きさであることを確認してください。
4. 針を魚のペダンクルク領域に向け、尾大ペダンク静脈(図5A)を目指し、針の総体積が少なくとも4分の1になるまで口を使って血液を引き出す(図5B)。
   注:魚の体から針を取り外す前に吸引を停止することが重要です。
5. 針を放し、針の鋭い側の近くにテープを置きます。蓋に穴を開けて、針を外側の針先に入れて穴に通します(図5C)。
6. 魚を回収水に入れ、少なくとも24時間放置してから、水槽システムに移します。
   注:同じ魚から2回目の血液サンプリングを行う場合は、最初の血液サンプリングの1週間後に血液をサンプリングします。
7. フラッシュは、チューブ内の血液を収集するために室温で1,000 x gで1〜2秒間収集した血液をスピンダウンします。
8. 下流の用途に直接進むか、使用するまで-20 °Cで血液を保存します。
   注:全血⁴⁸からの性ステロイド抽出のための以前の研究を参照してください。

結果

このプロトコルは、小さなサイズのモデルテレオスト、日本のメダカでゴナ12次と血液サンプリングを行うためのすべてのステップを記述します。女性の卵巣切り抜き(OVX)後の魚の生存率は100%(10匹中10匹)、オスの94%(18匹中17匹)が11次切り出し後に生存した。一方、血液採取手順が行われた後、すべての(38匹の魚)魚が生き残った。

ディスカッション

前の文献で報告されているように, ゴナ16>と血液サンプリングは、BPG 軸の調節における性ステロイドの役割に関連する質問を調査するために、他のモデル種で長い間使用されています。.しかし、これらの技術は、より大きな動物に対してのみ適しているようです。一般的に使用されるテレオストモデルの小さなサイズを考慮して、我々は、この種のために実現可能であるゴナデクトミーと血...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry