Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (Oryzias latipes)

Résumé

L’article décrit un protocole rapide pour gondécatomiser et prélassez le sang du petit poisson téléostéen, en utilisant le medaka japonais(Oryzias latipes)comme modèle, pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels dans la physiologie animale.

Résumé

Les stéroïdes sexuels, produits par les gonfles, jouent un rôle essentiel dans la plasticité du cerveau et des tissus hypophysaires et dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez tous les vertébrés en fournissant une rétroaction au cerveau et à l’hypophyse. Les poissons téléostéens possèdent un degré plus élevé de plasticité tissulaire et de variation dans les stratégies de reproduction que les mammifères et semblent être des modèles utiles pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels et les mécanismes par lesquels ils agissent. L’élimination de la principale source de production de stéroïdes sexuels à l’aide de la gonadectomie avec un prélèvement sanguin pour mesurer les niveaux de stéroïdes a été bien établie et assez réalisable chez les gros poissons et est une technique puissante pour étudier le rôle et les effets des stéroïdes sexuels. Cependant, ces techniques soulèvent des défis lorsqu’elles sont mises en œuvre dans des modèles de téléostéen de petite taille. Ici, nous décrivons les procédures étape par étape de la gonadectomie chez les hommes et les femmes medaka japonais suivies d’un prélèvement sanguin. Ces protocoles se sont révélés hautement réalisables dans le medaka, ce qui indique un taux de survie élevé, la sécurité pour la durée de vie et le phénotype du poisson, et la reproductibilité en termes de clairance des stéroïdes sexuels. L’utilisation de ces procédures combinée aux autres avantages de l’utilisation de ce petit modèle de téléostéen améliorera considérablement la compréhension des mécanismes de rétroaction dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et de la plasticité tissulaire fournis par les stéroïdes sexuels chez les vertébrés.

Introduction

Chez les vertébrés, les stéroïdes sexuels, qui sont principalement produits par les gonds, jouent un rôle important dans la régulation de l’axe cerveau-hypophyse-gonadique (BPG) à travers divers mécanismes de rétroaction^1,2,3,4,5. En outre, les stéroïdes sexuels affectent la prolifération et l’activité des neurones dans le cerveau^6,7,8 et les cellules endocriniennes, y compris les gonadotrophes, dans l’hypophyse^9,10, et jouent ainsi un rôle crucial dans la plasticité cérébrale et hypophysaire. Malgré des connaissances relativement bonnes chez les mammifères, le mécanisme de régulation de l’axe BPG médié par les stéroïdes sexuels est loin d’être compris chez les espèces non mammifères, ce qui conduit à une mauvaise compréhension des principes évolutifs conservés¹¹. Il existe encore un nombre limité d’études documentant le rôle des stéroïdes sexuels sur la plasticité cérébrale et hypophysaire, ce qui soulève la nécessité d’études plus approfondies sur le rôle et les effets des stéroïdes sexuels sur diverses espèces de vertébrés.

Chez les vertébrés, les téléostéens sont devenus de puissants animaux modèles en abordant de nombreuses questions biologiques et physiologiques, notamment la réponse au stress^12,13,la croissance^14,15,la physiologie nutritionnelle^16,17 et la reproduction^2. Les téléostéens, dans lesquels les stéroïdes sexuels sont principalement représentés par l’œstradiol (E2) chez les femelles et la 11-cétotestostérone (11-KT) chez les mâles^18,19, sont depuis longtemps des modèles expérimentaux fiables pour étudier le principe général de la reproduction entre les espèces. Les téléostéens montrent un caractère unique dans leur connexion hypothalamo-hypophysaire^20,21 et leurs cellules gonadotrophes distinctes^22,qui sont parfois pratiques pour l’élucidation des mécanismes de régulation. De plus, en raison de leur aptitude aux expériences en laboratoire et sur le terrain, les téléostéens offrent de nombreux avantages par rapport à d’autres organismes. Ils sont relativement peu coûteux à l’achat et à^{l’entretien23},²⁴. En particulier, les petits modèles de téléostéens tels que le poisson-zèbre (Danio rerio) et le medaka japonais (Oryzias latipes), sont des espèces à très forte fécondité et à cycle de vie relativement court permettant une analyse rapide de la fonction des gènes et des mécanismes pathologiques²³, offrant ainsi des avantages encore plus grands pour répondre à une pléthore de questions biologiques et physiologiques, compte tenu des nombreux protocoles bien développés et de la boîte à outils génétique disponible pour ces espèces²⁵.

Dans de nombreuses études, l’élimination des gonacées (gonadectomie) ainsi que les techniques de prélèvement sanguin ont été utilisées comme méthode pour étudier de nombreuses questions physiologiques, y compris son impact sur la physiologie de la reproduction des vertébrés chez les mammifères^26,27,28,les oiseaux²⁹ et les amphibiens³⁰. Bien que l’effet de la gondectomie sur la physiologie de la reproduction puisse être imité alternativement par les antagonistes des stéroïdes sexuels, tels que le tamoxifène et le clomifène, l’effet des médicaments semble être incohérent en raison des effets bimodinaux^31,32. L’exposition chronique à un antagoniste des stéroïdes sexuels peut entraîner une hypertrophie ovarienne^33,34, ce qui peut désactiver l’observation de ses effets à long terme en raison d’un phénotype malsain. En outre, il est impossible d’effectuer une expérience de récupération après un traitement antagoniste des stéroïdes sexuels, pour justifier l’effet spécifique de certains stéroïdes sexuels. En plus de ces points susmentionnés, d’autres compromis de l’utilisation d’antagonistes de stéroïdes sexuels ont été largement examinés^31,32. Par conséquent, la gonadectomie apparaît encore aujourd’hui comme une technique puissante pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels.

Alors que les techniques de gonadectomie et de prélèvement sanguin sont relativement faciles à réaliser chez les espèces plus grandes, telles que le bar européen (Dicentrarchus labrax)³⁵, le labre à tête bleue (Thalassoma bifasciatum)³⁶, l’aiguillat commun (Scyliorhinus canicula)³⁷ et le poisson-chat (Heteropneustes fossilis et Clarias bathracus)^38,39, ils soulèvent des défis lorsqu’ils sont appliqués dans de petits poissons comme medaka. Par exemple, l’utilisation du système d’administration d’anesthésie pour poissons (FADS)⁴⁰ est moins réalisable et semble sujette à des dommages physiques excessifs pour les petits poissons. En outre, une procédure de gonadectomie couramment utilisée pour les gros poissons⁴⁰ ne convient pas aux petits poissons qui nécessitent une grande précision pour éviter des dommages excessifs. Enfin, le prélèvement sanguin est difficile en raison de l’accès limité aux vaisseaux sanguins et de la petite quantité de sang chez ces animaux. Par conséquent, un protocole clair démontrant chaque étape de la gonadectomie et du prélèvement sanguin dans un petit téléostéen est important.

Ce protocole démontre les procédures étape par étape de la gonadectomie suivie d’un prélèvement sanguin dans le medaka japonais, un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie de l’Est. Les medaka japonais ont un génome séquencé, plusieurs outils moléculaires et génétiques disponibles^25,et un système de détermination génétique du sexe permettant d’enquêter sur les différences sexuelles avant que les caractéristiques sexuelles secondaires ou les gonas ne soient bien développées^41. Fait intéressant, les medaka japonais possèdent des gonnes fusionnées contrairement à de nombreuses autres espèces de téléostéens^42. Ces deux techniques combinées ne prennent que 8 minutes au total et compléteront la liste des protocoles vidéo déjà existants pour cette espèce qui comprenait le labeling des vaisseaux sanguins^43,le patch-clamp sur les sections hypophysaires⁴⁴ et les neurones cérébraux^45,et la culture cellulaire primaire^46. Ces techniques permettront à la communauté de recherche d’étudier et de mieux comprendre les rôles des stéroïdes sexuels dans les mécanismes de rétroaction ainsi que la plasticité cérébrale et hypophysaire à l’avenir.

Protocole

Toutes les expérimentations et manipulations d’animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être des animaux d’expérimentation à l’Université norvégienne des sciences de la vie. Les expériences utilisant la gonadectomie ont été approuvées par l’Autorité norvégienne de sécurité des aliments (FOTS ID 24305).

NOTE: Les expériences ont été réalisées en utilisant des hommes et des femmes adultes (âgés de 6 à 7 mois, poids d’environ 0,35 g, longueur d’environ 2,7 cm) medaka japonais. Le sexe a été déterminé en distinguant les caractéristiques sexuelles secondaires, telles que la taille et la forme de la nageoire dorsale et anale, comme décrit dans^42,47.

1. Préparation des instruments et des solutions

1. Préparer une solution d’anesthésique (Tricaine à 0,6 %).
   1. Diluer 0,6 g de tricaïne (MS-222) dans 100 mL de solution saline tampon phosphate (PBS).
   2. Répartir 1 mL de la solution d’origine Tricaine dans plusieurs tubes en plastique de 1,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparer l’eau de récupération (solution de NaCl à 0,9 %) en ajoutant 18 g de NaCl dans 2 L d’eau d’aquarium. Conserver la solution à température ambiante jusqu’à utilisation.
3. Préparez les outils d’incision en cassant un rasoir en diagonale pour obtenir un point pointu (Figure 1A).
4. Préparer une solution anticoagulante sanguine (0,05 U/μL d’héparine de sodium) en diluant 25 μL d’héparine de sodium en 500 μL de 1x PBS. Conserver la solution anticoagulante à 4 °C jusqu’à utilisation.
5. Préparer deux aiguilles en verre à partir d’un capillaire en verre de 90 mm de long en tirant un capillaire en verre à l’éventreur (Figure 1B) en suivant les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Le diamètre extérieur de l’aiguille en verre est de 1 mm, tandis que le diamètre intérieur est de 0,6 mm.
6. Préparez un couvercle de tube en plastique de 1,5 mL en coupant le couvercle et faites un trou qui s’adapte au diamètre extérieur de l’aiguille (Figure 1C). Pour faire le trou, chauffez une extrémité du capillaire en verre de 9 mm et poignardez le capillaire en verre chauffé à travers le couvercle. Alternativement, utilisez une aiguille pour poignarder à travers le couvercle jusqu’à ce que le diamètre du trou s’adapte au capillaire en verre de 9 mm.

2. Procédure de gonadectomie

1. Préparer 0,02% de solution anesthésique en diluant un tube de bouillon de Tricaine (0,6%) dans 30 mL d’eau d’aquarium.
2. Préparez des outils de dissection comprenant une pince ultra-fine et deux pinces fines (une avec une pointe relativement large), de petits ciseaux, du fil de nylon et un rasoir comme décrit à l’étape 1.3.
3. Anesthésiez le poisson en le mettant dans la solution anesthésique à 0,02% pendant 30 à 60 secondes.
   REMARQUE: La durée de l’anesthésie dépend de la taille et du poids du poisson et doit être adaptée. Pour s’assurer que le poisson est complètement anesthéséché, le corps du poisson peut être pincé doucement à l’aide d’une pince. Si le poisson ne réagit pas, la gonadectomie peut être commencée.
4. Sortez le poisson de la solution anesthésique et placez-le horizontalement sur le côté, hors de l’eau sous un microscope à dissection.
5. Ovariectomie (OVX) chez les femmes
   1. Retirez les œufs ovposités (œufs suspendus à l’extérieur du corps de la femelle) le cas échéant et grattez les écailles dans la zone d’incision (Figure 2A).
   2. Faites doucement une incision d’environ 2 à 2,5 mm de long entre les côtes, entre les nageoires pelvienne et anale (Figure 2A), à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, pincez doucement l’abdomen du poisson tout en sortant les ovaires petit à petit à l’aide d’une pince fine à pointe large.
   3. Coupez l’extrémité des ovaires à l’aide de pinces fines et placez les ovaires de côté (Figure 2B).
      REMARQUE: Veillez à ne pas casser le sac ovarien si possible. Si le sac ovarien est brisé, enlevez toute trace de gonace aussi complètement que possible sans laisser d’ovules non ovulés.
6. Orchidectomie chez les hommes
   1. Faites doucement une incision entre les côtes au-dessus de l’anus (Figure 2A) et ouvrez l’incision lentement à l’aide d’une pince fine.
   2. Attrapez doucement les testicules à l’aide de la pince fine et retirez lentement les testicules. Ensuite, coupez l’extrémité des testicules pour enlever complètement les testicules (Figure 2B). Pour l’orchidectomie masculine, toutes les préparations sont similaires à chez les femelles jusqu’à la partie incision. Lors de la prise des testicules, on obtient parfois la graisse ressemblant aux testicules. Cependant, après avoir restauré la graisse, il est possible d’essayer de retrouver les testicules (Figure 2B).
      REMARQUE: Pour les hommes et les femmes, il est important de minimiser la taille de l’incision dans l’abdomen pour éviter des dommages excessifs pouvant entraîner la mortalité. Parfois, les intestins peuvent également apparaître à travers l’incision avec les gonailles, alors assurez-vous qu’ils sont correctement renvoyés à l’intérieur de l’incision avant la fermeture. Une connaissance préalable de l’emplacement des ovaires et des testicules dans l’abdomen medaka est essentielle.
7. Suturez l’incision de la même manière chez les hommes et les femmes (Figure 3).
   1. Placez le fil de nylon à côté de la zone d’incision et poignardez la peau du côté droit de l’incision à travers la cavité interne du corps à l’aide d’une pince ultra-fine pour prendre le fil avec une pince fine (Figure 3; 1-2).
   2. Poignardez la peau du côté gauche de l’incision à travers la cavité externe du corps pour retirer le fil ( Figure 3; 3-4).
   3. Fermez l’ouverture de l’incision et faites deux nœuds et coupez le fil excessif (Figure 3; 4-6).
      REMARQUE: La suture doit être suffisamment serrée et le fil restant sur le poisson doit être assez long pour empêcher le desserrage de la suture. L’ensemble de la procédure, de l’anesthésie à la suture, prend généralement jusqu’à 6 minutes. Un temps plus long peut conduire à la mortalité.
   4. Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium.
      REMARQUE: Les poissons gonadétomisés présentent généralement un comportement normal après 1-2 heures dans l’eau de récupération. Par conséquent, selon le but de l’expérience, on peut échantillonner le poisson après cet intervalle de temps.

3. Procédure de prélèvement sanguin

1. Préparez les outils : une aiguille en verre, un capillaire en silicone, un tube en plastique avec un trou, un tube en plastique vide de 1,5 mL, une minicentrifugeuse et du ruban adhésif.
2. Anesthésier le poisson à l’aide d’une solution anesthésique à 0,02 % décrite à l’étape 2.1 et placer le poisson sous un microscope à dissection en position verticale (Figure 4A). Placez le poisson sur une surface brillante pour faciliter la visualisation de la veine de ponction caudale.
3. Installez le tiroir à sang en attachant une aiguille en verre au capillaire en silicone(Figure 4B). Casser la pointe de l’aiguille avec une pince à pointe large et recouvrir l’intérieur de l’aiguille d’une solution anticoagulante par aspiration et soufflage.
   REMARQUE: L’utilisation d’une ventouse et d’un capillaire en silicone d’au moins 50 cm de longueur est recommandée pour les mesures de sécurité afin d’éviter tout contact direct avec le sang lors de l’aspiration. De plus, assurez-vous que l’ouverture de la pointe de l’aiguille est suffisamment grande pour permettre de tirer le sang.
4. Dirigez l’aiguille vers la zone du pédoncule du poisson, visez la veine du pédoncule caudal (Figure 5A) et prélevez le sang par la bouche jusqu’à ce qu’au moins un quart du volume total de l’aiguille soit rempli (Figure 5B).
   REMARQUE: Il est important d’arrêter d’aspirer avant de retirer l’aiguille du corps du poisson.
5. Relâchez l’aiguille et placez un morceau de ruban adhésif à proximité du côté pointu de l’aiguille. Placez le couvercle avec un trou sur un tube de collecte et placez l’aiguille à l’intérieur du tube à travers le trou avec la pointe de l’aiguille à l’extérieur (Figure 5C).
6. Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium.
   REMARQUE: Pour effectuer un deuxième prélèvement sanguin sur le même poisson, échantillonnez le sang une semaine après le premier prélèvement sanguin.
7. Flash faire tourner le sang recueilli pendant 1-2 secondes avec 1 000 x g à température ambiante pour recueillir le sang dans le tube.
8. Passez directement aux applications en aval ou stockez le sang à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
   REMARQUE: Se référer à l’étude précédente pour l’extraction de stéroïdes sexuels à partir du sang^{total 48}.

Résultats

Ce protocole décrit chaque étape pour effectuer une gonadectomie et un prélèvement sanguin dans un téléostéen modèle de petite taille, le medaka japonais. Le taux de survie du poisson après ovariectomie (OVX) chez les femelles est de 100% (10 poissons sur 10) tandis que 94% (17 sur 18 poissons) des mâles ont survécu après une orchidectomie. Pendant ce temps, après la procédure de prélèvement sanguin, tous les poissons (38 poissons) ont survécu.

Discussion

Comme indiqué dans la littérature précédente, la gonadectomie et le prélèvement sanguin ont longtemps été utilisés chez d’autres espèces modèles pour étudier les questions liées au rôle des stéroïdes sexuels dans la régulation de l’axe BPG. Cependant, ces techniques ne semblent se prêter qu’aux animaux plus gros. Compte tenu de la petite taille du modèle de téléostéoscé couramment utilisé, le medaka japonais, nous fournissons un protocole détaillé pour la gonadectomie et le prélèvement s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry