작은 크기의 텔레오스 모델 일본어 메다카(오리지아스 latipes)에서고나데토미및 혈액 샘플링 절차

요약

이 기사는 동물 생리학에서 성 스테로이드의 역할을 조사하기 위해 일본 메다카(Oryzias latipes)를모델로 사용하여 작은 텔레오스트 물고기에서 혈액을 고나데톰화하고 샘플링하는 빠른 프로토콜을 설명합니다.

초록

성 스테로이드, 생식선에 의해 생산, 뇌와 뇌 하 수 체 조직 가소성및 뇌와 뇌 하 수 체에 피드백을 제공 하 여 모든 척추 동물에서 재생의 신경 내 분 비 제어에 필수적인 역할을. Teleost 물고기는 포유동물에 비해 생식 전략의 조직 가소성과 변화의 높은 수준을 가지고 있으며 섹스 스테로이드의 역할과 그들이 행동하는 메커니즘을 조사하는 유용한 모델로 나타납니다. 스테로이드 레벨을 측정 하기 위해 혈액 샘플링함께 gonadectomy를 사용 하 여 섹스 스테로이드 생산의 주요 소스의 제거 는 잘 설립 하 고 더 큰 물고기에서 상당히 실현 하 고 역할 및 섹스 스테로이드의 효과 조사 하는 강력한 기술. 그러나 이러한 기술은 소규모 텔레오스트 모델에서 구현될 때 문제를 제기합니다. 여기에서는 남성과 여성 일본 메다카 모두에서 고나데토미의 단계별 절차를 설명하고 혈액 샘플링을 진행합니다. 이러한 프로토콜은 높은 생존율, 물고기의 수명 및 표현형에 대한 안전, 성 스테로이드 클리어런스의 관점에서 재현성이 높은 메다카에서 매우 실현 가능한 것으로 나타났다. 이 작은 teleost 모델을 사용 하 여의 다른 장점과 결합 된 이러한 절차의 사용은 크게 척추 동물에서 섹스 스테로이드에 의해 제공 된 생식 및 조직 가소성의 신경 내 분 비 제어에 피드백 메커니즘의 이해를 향상 시킬 것 이다.

서문

척추 동물에서, 성 스테로이드, 주로 생식선에 의해 생산 되는, 다양 한 피드백^{메커니즘을}통해 뇌-뇌 뇌-Gonadal (BPG) 축의 규제에 중요 한 역할을^1,2,3,4,5. 또한, 성 스테로이드는 뇌에서 뉴런의 증식 및 활동에 영향을 미치는^6,7,8 및 내분비 세포, gonadotropes를 포함 하 여, 뇌 하 수 체^9,10,따라서 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에서 중요 한 역할을 제공. 포유류에 상대적으로 좋은 지식에도 불구 하 고, 성 스테로이드에 의해 중재 BPG 축 조절의 메커니즘은 비 포유류 종에서 이해 되 고에서 멀리, 진화 보존 원리의 가난한 이해로 이어지는^11. 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에 섹스 스테로이드의 역할을 문서화 하는 연구의 여전히 제한 된 수가 있다, 따라서 다양 한 척추 동물 종에 섹스 스테로이드의 역할 및 효과의 추가 조사에 대 한 필요성을 제기.

척추동물 중, 텔레오스트는 스트레스 반응^12,13,성장^14,15,영양 생리학^16,17 및 재생^2를포함하여 수많은 생물학적 및 생리학적 질문을 해결하는 강력한 모델 동물이되었다. 텔레오스트, 있는 섹스 스테로이드는 주로 에스트라디올에 의해 표현된다 (E2) 여성과 11 케토 테스토스테론 (11-KT)^{남성에서 18,19,}종에 걸쳐 재생의 일반적인 원리를 조사하기위한 신뢰할 수있는 실험 모델이었다. 텔레오스트는 시상 하 부-뇌 하 수 체 연결에 있는 고유성을 보여줍니다^20,21 및 뚜렷한 염소도트로프 세포^(22),이는 때때로 규제 메커니즘의 해명에 대 한 편리. 또한, 실험실과 현장 실험 모두에 그들의 편의성으로 인해, teleosts는 다른 유기체에 비해 많은 장점을 제공합니다. 그들은^23,24를구입하고 유지하는 것이 상대적으로 저렴합니다. 특히, 제브라피쉬(Daniorerio)와일본 메다카(Oryziaslatipes)와같은 작은 텔레오스트 모델은 매우 높은 fecundity와 상대적으로 짧은 수명 주기가 있는 종으로 유전자 기능 및 질병^{메커니즘(23)의}신속한 분석을 가능하게 하며, 따라서 많은 잘 발달된 프로토콜과 유전적 질병을 고려하여 생물학적 및 생리학적 문제의 과다를 해결하는 데 더 큰 이점을^{제공한다.}

수많은 연구에서, 혈액샘플링 기술과 함께 생식선(gonadectomy)을 제거하는 것은 포유류^26,27,28,조류²⁹ 및 양서류^30에서척추동물 생식 생리학에 미치는 영향을 포함하여 많은 생리적 질문을 조사하는 방법으로 사용되어 왔다. 생식 생리학에 대한 생식 세포절제술 효과는 타목시펜과 클로미펜과 같은 성 스테로이드 길항제에 의해 대안적으로 모방될 수 있지만, 약물의 효과는^{양성효과(31,32)로}인해 일관성이 없는 것으로 보인다. 성 스테로이드 길항제에 만성 노출 난 소 확대로 이어질 수 있습니다^33,34,건강에 해로운 표현형으로 인해 장기 목적을 위한 그것의 효과의 관찰을 비활성화할 수 있습니다. 또한, 특정 성 스테로이드의 특정 효과를 보증하기 위해, 성 스테로이드 길항제 치료 후 복구 실험을 수행하는 것은 불가능하다. 그 앞서 언급 한 포인트와 함께, 섹스 스테로이드 길항제 사용의 다른 트레이드 오프 광범위 하 게 검토 되었습니다^31,32. 따라서, gonadectomy 여전히 섹스 스테로이드의 역할을 조사 하는 강력한 기술로 오늘 나타납니다.

고나데절과 혈액 샘플링 기술은 상대적으로 더 큰 종에서 수행하기 쉽지만, 유럽 농어(디센트라쿠스 라브릭스)^35,블루 헤드 wrasse(탈라소마 비파시아툼)^36,도그피쉬(실리오리누스 캐니쿨라)³⁷ 및 메기(헤테롭네스 화석 과 클라리아스 목욕 라쿠스)^38,39,그들은 작은 물고기에 적용 할 때 도전을 제기한다. 예를 들어, 물고기 마취 전달 시스템 (FADS)^40의 사용은 덜 실현 가능하고 작은 물고기에 대한 과도한 물리적 손상경향이있는 것으로 보인다. 또한, 일반적으로 더 큰 물고기^(40)에 사용되는 gonadectomy 절차는 과도한 손상을 피하기 위해 높은 정밀도를 필요로하는 작은 물고기에 적합하지 않습니다. 마지막으로, 혈액 샘플링은 혈관에 대한 제한된 접근과 그 동물에 있는 혈액의 소량 때문에 도전적입니다. 따라서, 작은 텔레오스트에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링의 모든 단계를 보여주는 명확한 프로토콜은 중요합니다.

이 프로토콜은 동아시아가 원산지인 작은 민물고기인 일본 메다카에서 혈액 샘플링을 거쳐 고나데스토미의 단계별 절차를 보여줍니다. 일본 메다카는 서열게놈, 여러 분자 및 유전적 도구^25개,이차성 특성 또는 생식선 이전에 성적 차이에 대한 조사를 허용하는 유전적 성결정 시스템이^41로잘 개발된다. 흥미롭게도, 일본 메다카는 다른 많은 텔레오스트 종에 반하는 융합 된 조나^(42)를가지고 있습니다. 이 두 가지 기술을 결합한 이 두 가지 기술은 총 8분밖에 걸리지 않으며^{혈관(43)의}라벨링, 뇌하수체^섹션(44) 및 뇌뉴런(45)의 패치 클램프, 1차 세포^{배양(46)을}포함하는 이 종에 대해 이미 존재하는 비디오 프로토콜 목록을 완성할 것이다. 이러한 기술은 연구 커뮤니티가 미래에 뇌와 뇌 하 수 체 가소성뿐만 아니라 피드백 메커니즘에서 섹스 스테로이드의 역할을 조사하고 더 잘 이해할 수 있게 해 줄 것입니다.

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프로토콜

모든 실험과 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학의 실험 동물 복지에 대한 권고에 따라 수행되었습니다. 고나데토미를 사용한 실험은 노르웨이 식품 안전 당국(FOTS ID 24305)에 의해 승인되었습니다.

참고: 실험은 성인 남성과 여성(생후 6~7개월, 체중 0.35g, 길이 2.7cm)을 사용하여 수행하였다. 상기 성은^42,47에기재된 바와 같이 등쪽 및 항문 지느러미의 크기 및 모양과 같은 이차성 특성을 구별함으로써 결정되었다.

1. 기기 및 솔루션 준비

1. 마취 주식 솔루션 (0.6 % 트리카인)을 준비합니다.
   1. 10x 인산염 완충식살린(PBS)의 100mL에서 트리카인(MS-222)을 0.6g 희석한다.
   2. 트리카인 스톡 용액 1mL을 여러 1.5mL 플라스틱 튜브에 분배하고 사용할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
2. 수족관 용수 2L에 NaCl 18g을 추가하여 회수수(0.9% NaCl 솔루션)를 준비합니다. 사용 전까지 실온에 용액을 보관하십시오.
3. 날카로운 점을 얻기 위해 대각선으로 면도기를 파괴하여 절개 도구를 준비(도 1A).
4. 혈액 항응고제 용액(0.05 U/μL 의 나트륨 헤파린)을 1x PBS의 500 μL로 나트륨 헤파린 25 μL을 희석하여 준비합니다. 사용 전까지 항응고제 용액을 4°C에 저장합니다.
5. 제조업체의 지시에 따라 바늘풀러(도 1B)로유리 모세관을 당겨 90mm 길이의 유리 모세관에서 2개의 유리 바늘을 준비한다.
   참고: 유리 바늘의 외경은 1mm이고 내부 직경은 0.6 mm입니다.
6. 뚜껑을 절단하여 1.5mL 플라스틱 튜브 뚜껑을 준비하고 바늘 외부직경(도 1C)에맞는 구멍을 만듭니다. 구멍을 만들기 위해 9mm 유리 모세관의 한쪽 끝을 가열하고 뚜껑을 통해 가열 된 유리 모세관을 찌르십시오. 또는 바늘을 사용하여 구멍의 직경이 9mm 유리 모세관에 맞을 때까지 뚜껑을 찌르게하십시오.

2. 고나데토미 시술

1. 수족관 수의 30mL에 트리카인 재고(0.6%)의 튜브 1개(0.6%)를 희석하여 마취용액의 0.02%를 준비한다.
2. 1.3 단계에서 설명된 초미세 및 2개의 미세한 집게(비교적 넓은 팁이 있는 분수), 작은 가위, 나일론 실 및 면도기 등 해부 도구를 준비합니다.
3. 물고기를 30-60초 동안 0.02% 마취용액에 넣어 생선을 마취합니다.
   참고: 마취 의 지속 시간은 물고기의 크기와 무게에 따라 달라 지며 적응해야합니다. 물고기가 완전히 마취되도록 하기 위해 물고기 몸은 집게를 사용하여 부드럽게 꼬집을 수 있습니다. 물고기가 반응하지 않으면 고나데스토미를 시작할 수 있습니다.
4. 마취 용액에서 물고기를 꺼내 어처 현미경으로 물 밖으로 물고기를 측면에 수평으로 놓습니다.
5. 암컷의 오바리절제술(OVX)
   1. 난수성 계란(암컷 몸 바깥에 매달려 있는 계란)을 제거하고 절개부위(도 2A)에서비늘을 긁어낸 경우.
   2. 면도날을 사용하여 골반과 항문 지느러미(그림2A)사이에 갈비뼈 사이에 약 2-2.5mm 길이의 절개를 부드럽게 만듭니다. 그런 다음 넓은 팁으로 미세 한 포셉을 사용하여 난소를 조금씩 꺼내면서 생선 복부를 부드럽게 꼬집습니다.
   3. 미세 포셉을 사용하여 난소의 끝을 잘라 내분(도 2B)을제쳐 놓습니다.
      참고 : 가능하면 난소 주머니를 부러 뜨리지 않도록주의하십시오. 난소 낭이 깨진 경우, 심지어 비 배란 계란을 떠나지 않고 가능한 한 완전히 모든 gonad 흔적을 제거합니다.
6. 남성의 낙초 절제술
   1. 항문 위의갈비뼈(그림 2A)를부드럽게 절개하고 미세한 집게를 사용하여 절개를 천천히 엽니다.
   2. 미세 한 집게를 사용하여 부드럽게 고환을 잡고 천천히 고환을 꺼냅니다. 그 후, 고환의 끝을 완전히 제거하기 위해 고환의 끝을 잘라(도 2B). 남성 치열 절제술의 경우, 모든 제제는 절개 부위까지 여성에서 유사합니다. 고환을 잡을 때, 때때로 고환을 닮은 지방이 얻어집니다. 그러나 지방을 복원한 후 고환을 다시 찾아볼 수있다(도 2B).
      참고: 남성과 여성 모두, 사망률로 이어질 수 있는 과도 한 손상을 방지 하기 위해 복부에 절개 크기를 최소화 하는 것이 중요 하다. 때때로 내장은 또한 곤드와 함께 절개를 통해 나타날 수 있습니다, 그래서 그들은 제대로 닫기 전에 절개 내부에 반환 되어 있는지 확인. 난소와 메다카 복부의 고환 위치에 대한 사전 지식이 필수적입니다.
7. 남성과 여성에서 유사하게 절개를 봉합(그림 3).
   1. 절개 부위 옆에 나일론 실을 놓고 초미세 포셉을 사용하여 내체 캐비티를 통해 절개 오른쪽으로부터 피부를 찌르고 미세한 집게로 실을 채운다(도3;1-2).
   2. 실을 꺼내기 위해 외부 바디 캐비티를 통해 절개 왼쪽에서 피부를 찌르십시오 (도 3;3-4).
   3. 절개 개구부를 닫고 두 개의 매듭을 만들고 과도한 스레드를 잘라냅니다(그림 3; 4-6).
      참고: 봉합사는 적절히 단단해야 하며, 물고기의 나머지 실은 봉합사의 느슨해지는 것을 막을 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 마취에서 봉합까지의 전체 절차는 일반적으로 최대 6 분이 걸립니다. 시간이 길어지면 필멸의 삶이 될 수 있습니다.
   4. 물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다.
      참고: 고나절제생선은 보통 회복수에서 1-2시간 후에 정상적인 행동을 보여줍니다. 따라서 실험 목적에 따라 이 시간 간격 이후에 물고기를 샘플링할 수 있습니다.

3. 혈액 샘플링 절차

1. 유리 바늘, 실리콘 모세관, 구멍이있는 플라스틱 튜브, 빈 1.5 mL 플라스틱 튜브, 소형 심립분리기 및 테이프 : 도구를 준비합니다.
2. 2.1단계에서 설명된 바와 같이 0.02% 마취용액을 사용하여 물고기를 마취시키고, 물고기를 수직위치(도 4A)에해부 현미경아래에 놓는다. 소달 펑크 정맥의 시각화를 용이하게하기 위해 밝은 표면에 물고기를 놓습니다.
3. 실리콘 모세관(도4B)에유리 바늘을 부착하여 혈액 서랍을 설치합니다. 넓은 팁 집게로 바늘의 끝을 깨고 흡입 및 불면 항 응고용으로 바늘 내부를 코팅하십시오.
   참고: 흡입 시 혈액의 직접적인 접촉을 피하기 위해 최소 50cm 길이의 빨판과 실리콘 모세관을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 바늘 끝의 개구부가 충분히 커서 혈액을 그릴 수 있는지 확인하십시오.
4. 바늘을 물고기의 페더클 영역쪽으로 직접, caudal peduncle 정맥을 목표로(도 5A)바늘의 총 부피가 채워질 때까지 적어도 4 분의 1까지 입을 사용하여 혈액을 그립니다(도 5B).
   참고 : 물고기 몸에서 바늘을 제거하기 전에 흡입을 중지하는 것이 중요합니다.
5. 바늘을 풀어 바늘의 날카로운 면의 근접에 테이프 조각을 넣어. 수거 튜브에 구멍이 있는 뚜껑을 놓고 바늘을 외부에 바늘 끝으로 구멍을 통해 튜브 내부에 놓습니다(도5C).
6. 물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다.
   참고: 동일한 물고기에서 두 번째 혈액 샘플링을 수행하려면 첫 번째 혈액 샘플링 후 1 주일 후에 혈액을 샘플링하십시오.
7. 채취한 혈액을 1-2초 동안 실온에서 1,000xg로 스핀다운하여 튜브의 혈액을 채취합니다.
8. 다운스트림 응용 프로그램으로 직접 진행하거나 사용전까지 -20°C에 혈액을 저장하십시오.
   참고: 전체 혈액에서 섹스 스테로이드 추출에 대 한 이전 연구를 참조^48.

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결과

이 프로토콜은 작은 크기의 모델 텔레오스트, 일본 메다카에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링을 수행하기위한 모든 단계를 설명합니다. 암컷의 오방 절제술(OVX) 후 물고기의 생존율은 100%(물고기 10마리 중 10개)이며, 수컷의 94%(물고기 18마리 중 17마리)는 난초 절제술 후 살아남았다. 한편, 혈액 샘플링 절차가 수행 된 후, 모든 (38 물고기) 물고기가 살아남았다.

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토론

이전 문헌에서 보고 된 바와 같이, gonadectomy 및 혈액 샘플링 은 BPG 축의 조절에 섹스 스테로이드의 역할과 관련된 질문을 조사하기 위해 오랫동안 다른 모델 종에서 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술은 더 큰 동물에게만 가능할 것으로 보입니다. 일반적으로 사용되는 텔레오스트 모델인 일본 메다카의 작은 크기를 고려하여, 이 종에 대해 가능한 고나데토미및 혈액 샘플링을 위한 상세한 프로?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry