Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Resumo

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Resumo

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Introdução

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback^1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro^6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária^9,

Protocolo

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305).

NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por distinguir as características sexuais secundárias, como o tamanho e a forma da barbatana dorsal e anal, conforme descrito em^42,

Resultados

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram.

Discussão

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry