Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Resumo

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Resumo

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Introdução

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback^1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro^6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária^9,10, e assim servem papéis cruciais na plasticidade cerebral e pituitária. Apesar do conhecimento relativamente bom em mamíferos, o mecanismo de regulação do eixo BPG mediado por esteroides sexuais está longe de ser compreendido em espécies não-mamíferas, levando à má compreensão dos princípios evolutivos conservados¹¹. Ainda há um número limitado de estudos documentando o papel dos esteroides sexuais na plasticidade cerebral e pituitária, aumentando assim a necessidade de investigações adicionais sobre o papel e os efeitos dos esteroides sexuais em diversas espécies de vertebrados.

Entre os vertebrados, as teleostas tornaram-se animais modelo poderosos no enfrentamento de inúmeras questões biológicas e fisiológicas, incluindo resposta ao estresse^12,13, crescimento^14,15, fisiologia nutricional^16,17 e reprodução². Teleosts, nos quais os esteroides sexuais são representados principalmente por estradiol (E2) em fêmeas e 11-cetosetosterona (11-KT) em machos^18,19, têm sido modelos experimentais confiáveis para investigar o princípio geral da reprodução entre espécies. As teleóstas mostram singularidade em sua conexão hipotalâmica-pituitária^20,21 e distintas células gonadotrope²², que às vezes são convenientes para a elucidação de mecanismos regulatórios. Além disso, devido à sua comodidade tanto para experimentos de laboratório quanto de campo, os teleosts oferecem muitas vantagens em comparação com outros organismos. Eles são relativamente baratos para comprar e manter^23,24. Em particular, pequenos modelos de teleost como o zebrafish (Danio rerio) e o medaka japonês (Oryzias latipes), são espécies com fecundidade muito alta e um ciclo de vida relativamente curto, permitindo a análise rápida da função genética e mecanismos de doença²³, proporcionando assim vantagens ainda maiores no enfrentamento de uma infinidade de questões biológicas e fisiológicas, considerando os inúmeros protocolos bem desenvolvidos e kit de ferramentas genéticas disponíveis para essas espécies²⁵.

Em inúmeros estudos, a remoção de gônadas (gonadectomia) juntamente com técnicas de amostragem de sangue têm sido utilizadas como método para investigar muitas questões fisiológicas, incluindo seu impacto na fisiologia reprodutiva de vertebrados nos mamíferos^26,27,28, aves²⁹ e anfíbios³⁰. Embora o efeito gonadectomia na fisiologia reprodutiva possa ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuais, como tamoxifen e clomifeno, o efeito das drogas parece ser inconsistente devido aos efeitos bimodais^31,32. A exposição crônica a um antagonista de esteroides sexuais pode levar ao alargamento ovariano^33,34, que pode desativar a observação de seus efeitos para fins de longo prazo devido a um fenótipo não saudável. Além disso, é impossível realizar um experimento de recuperação após o tratamento antagonista de esteroides sexuais, para justificar o efeito específico de certos esteroides sexuais. Junto com esses pontos acima mencionados, outras trocas de uso de antagonistas de esteroides sexuais foram amplamente revisadas^31,32. Portanto, a gonadectomia ainda aparece hoje como uma técnica poderosa para investigar o papel dos esteroides sexuais.

Enquanto as técnicas de gonadectomia e amostragem de sangue são relativamente fáceis de executar em espécies maiores, como o robalo europeu (Dicentrarchus labrax)³⁵, o tálamo azul(Thalassoma bifasciatum)³⁶, o dogfish(Scyliorhinus canicula)³⁷ e o bagre(Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)^38,39, eles levantam desafios quando aplicados em peixes pequenos como medaka. Por exemplo, o uso do Fish Anesthesia Delivery System (FADS)⁴⁰ é menos viável e parece ser propenso a danos físicos excessivos para peixes pequenos. Além disso, um procedimento de gonadectomia que é comumente usado para peixes maiores⁴⁰ não é adequado para peixes pequenos que requer alta precisão para evitar danos excessivos. Finalmente, a amostragem de sangue é desafiadora devido ao acesso limitado aos vasos sanguíneos e à pequena quantidade de sangue nesses animais. Portanto, um protocolo claro demonstrando cada passo de gonadectomia e amostragem de sangue em um pequeno teleost é importante.

Este protocolo demonstra os procedimentos passo a passo da gonadectomia seguidos pela amostragem de sangue em medaka japonesa, um pequeno peixe de água doce nativo do leste da Ásia. Medaka japonesa tem um genoma sequenciado, várias ferramentas moleculares e genéticas disponíveis²⁵, e um sistema de determinação genética de sexo que permite a investigação de diferenças sexuais antes que características sexuais secundárias ou gônadas sejam bem desenvolvidas⁴¹. Curiosamente, medaka japonesa possui gônadas fundidas contrárias a muitas outras espécies de teleost⁴². Essas duas técnicas combinadas levam apenas 8 minutos no total e completarão a lista de protocolos de vídeo já existentes para esta espécie que incluía rotulagem de vasos sanguíneos^43,grampo de remendo nas seções pituitárias⁴⁴ e neurônios cerebrais⁴⁵, e cultura celular primária⁴⁶. Essas técnicas permitirão que a comunidade de pesquisa investigue e entenda melhor os papéis dos esteroides sexuais em mecanismos de feedback, bem como na plasticidade cerebral e pituitária no futuro.

Protocolo

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305).

NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por distinguir as características sexuais secundárias, como o tamanho e a forma da barbatana dorsal e anal, conforme descrito em^42,47.

1. Preparação de instrumentos e soluções

1. Prepare a solução de estoque anestésico (0,6% Tricaine).
   1. Diluir 0,6 g de Tricaine (MS-222) em 100 mL de 10x Phosphate Buffer Saline (PBS).
   2. Distribua 1 mL da solução de estoque tricaine em vários tubos plásticos de 1,5 mL e armazene a -20 °C até usar.
2. Prepare a água de recuperação (solução nacl de 0,9%) adicionando 18 g de NaCl em 2 L de água de aquário. Armazene a solução em temperatura ambiente até o uso.
3. Prepare as ferramentas de incisão quebrando uma navalha na diagonal para obter um ponto afiado(Figura 1A).
4. Prepare a solução anticogulante sanguínea (0,05 U/μL de heparina de sódio) diluindo 25 μL de heparina de sódio em 500 μL de 1x PBS. Armazene a solução anticopante a 4 °C até usar.
5. Prepare duas agulhas de vidro de um capilar de vidro de 90 mm de comprimento puxando um capilar de vidro com um puxador de agulha(Figura 1B) seguindo as instruções do fabricante.
   NOTA: O diâmetro externo da agulha de vidro é de 1 mm, enquanto o diâmetro interno é de 0,6 mm.
6. Prepare uma tampa de tubo plástico de 1,5 mL cortando a tampa e faça um orifício que se encaixe com o diâmetro externo da agulha(Figura 1C). Para fazer o orifício, aqueça uma extremidade do capilar de vidro de 9 mm e esfaqueie o capilar de vidro aquecido através da tampa. Alternativamente, use uma agulha para furar a tampa até que o diâmetro do orifício se encaixe com o capilar de vidro de 9 mm.

2. Procedimento de gonadectomia

1. Prepare 0,02% da solução anestésico diluindo um tubo de estoque tricaine (0,6%) em 30 mL de água do aquário.
2. Prepare ferramentas de dissecção, incluindo um ultra-fino e dois fórceps finos (um com ponta relativamente larga), tesoura pequena, fio de nylon e navalha como descrito na etapa 1.3.
3. Anestesiar o peixe colocando-o na solução anestésico de 0,02% por 30-60 segundos.
   NOTA: A duração da anestesia depende do tamanho e peso do peixe e deve ser adaptada. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, o corpo do peixe pode ser perfeitamente beliscado usando fórceps. Se o peixe não reagir, a gonadectomia pode ser iniciada.
4. Retire o peixe da solução anestésico e coloque o peixe horizontalmente de lado, fora d'água sob um microscópio de dissecção.
5. Ovaectomia (OVX) em fêmeas
   1. Remova os ovos ovipositados (ovos pendurados fora do corpo feminino) se houver e raspe as escamas na área de incisão(Figura 2A).
   2. Faça delicadamente uma incisão de cerca de 2-2,5 mm de comprimento entre as costelas, entre as aletas pélvicas e anais(Figura 2A),utilizando a lâmina de barbear. Em seguida, belisque suavemente o abdômen do peixe enquanto tira os ovários pouco a pouco usando fórceps finos com ponta larga.
   3. Corte a extremidade dos ovários usando fórceps finos e coloque os ovários de lado(Figura 2B).
      NOTA: Tome cuidado para não quebrar o saco ovariano, se possível. Se o saco ovariano estiver quebrado, remova qualquer traço de gônada o mais completamente possível sem deixar nenhum óvulo não ovulado.
6. Orquídea em machos
   1. Faça suavemente uma incisão entre as costelas acima do ânus(Figura 2A),e abra a incisão lentamente usando fórceps finos.
   2. Pegue suavemente os testículos usando os fórceps finos e lentamente retire os testículos. Depois, corte a extremidade dos testículos para remover completamente os testículos(Figura 2B). Para orquídeas machos, todas as preparações são semelhantes às das fêmeas até a parte da incisão. Ao pegar os testículos, às vezes a gordura que se assemelha aos testículos é obtida. No entanto, após a restauração da gordura, é possível tentar encontrar os testículos novamente(Figura 2B).
      NOTA: Tanto para homens quanto para fêmeas, é importante minimizar o tamanho da incisão no abdômen para evitar danos excessivos que possam levar à mortalidade. Às vezes, os intestinos também podem aparecer através da incisão junto com as gônadas, por isso certifique-se de que elas sejam devidamente devolvidas dentro da incisão antes do fechamento. O conhecimento prévio sobre ovários e localização de testículos no abdômen medaka é essencial.
7. Sutura a incisão da mesma forma em machos e fêmeas(Figura 3).
   1. Coloque a linha de nylon ao lado da área de incisão e esfaqueie a pele do lado direito da incisão através da cavidade interna do corpo usando fórceps ultrafinas para levar o fio com fórceps finos(Figura 3; 1-2).
   2. Apunhale a pele do lado esquerdo da incisão através da cavidade externa do corpo para tirar a rosca ( Figura 3; 3-4).
   3. Feche a abertura da incisão e faça dois nós e corte a rosca excessiva(Figura 3; 4-6).
      NOTA: A sutura deve estar adequadamente apertada, e o restante do fio do peixe deve ser longo o suficiente para evitar o afrouxamento da sutura. Todo o procedimento desde anestesia até a sutura geralmente leva até 6 minutos. Tempo mais longo pode levar à mortalidade.
   4. Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário.
      NOTA: Peixes gonadectomizados geralmente apresentam comportamento normal após 1-2 horas na água de recuperação. Portanto, dependendo do propósito do experimento, pode-se provar o peixe após esse intervalo de tempo.

3. Procedimento de amostragem de sangue

1. Prepare as ferramentas: uma agulha de vidro, um capilar de silicone, um tubo de plástico com um orifício, um tubo plástico vazio de 1,5 mL, uma minicentrifuagem e fita.
2. Anestesiar o peixe utilizando solução anestésico de 0,02%, conforme descrito na etapa 2.1 e colocar o peixe sob um microscópio de dissecção em posição vertical(Figura 4A). Coloque o peixe em uma superfície brilhante para facilitar a visualização da veia de punção caudal.
3. Instale a gaveta de sangue anexando uma agulha de vidro ao capilar de silicone(Figura 4B). Quebre a ponta da agulha com adoçam de ponta larga e cubra o interior da agulha com solução anticogulante por sucção e sopro.
   NOTA: Recomenda-se o uso de um e um capilar de silicone com pelo menos 50 cm de comprimento para medidas de segurança para evitar qualquer contato direto do sangue ao sucumbir. Além disso, certifique-se de que a abertura da ponta da agulha é suficientemente grande para permitir o desenho do sangue.
4. Direcione a agulha em direção à área do pedículo do peixe, aponte para a veia peduncle caudal(Figura 5A) e tire o sangue usando a boca até pelo menos um quarto o volume total da agulha é preenchido(Figura 5B).
   NOTA: É importante parar de aspirar antes de remover a agulha do corpo do peixe.
5. Solte a agulha e coloque um pedaço de fita na proximidade do lado afiado da agulha. Coloque a tampa com um orifício em um tubo de coleta e coloque a agulha dentro do tubo através do orifício com a ponta da agulha por fora(Figura 5C).
6. Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário.
   NOTA: Para realizar uma segunda amostragem de sangue do mesmo peixe, prove o sangue uma semana após a primeira amostragem de sangue.
7. Gire o sangue coletado por 1-2 segundos com 1.000 x g à temperatura ambiente para coletar o sangue no tubo.
8. Proceda diretamente para aplicações a jusante ou armazene o sangue a -20 °C até o uso.
   NOTA: Consulte o estudo anterior para extração de esteroides sexuais de todo o sangue⁴⁸.

Resultados

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram.

Discussão

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		-	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry