Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שינויים פתופיזיולוגיים במערכת העצבים האוטונומית הלבבית, במיוחד בענף הסימפטי שלה, תורמים לתחזוקה ולתחזוקה של הפרעות קצב חדריות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד לאפיין גרעינים כוכביים מורין כדי לשפר את ההבנה של התהליכים המולקולריים והתאים הבסיסיים.

Abstract

מערכת העצבים האוטונומית היא מניע משמעותי של אלקטרופיזיולוגיה לבבית. במיוחד תפקידו של הענף האוהד שלה הוא עניין מתמשך של חקירה בפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב חדריות (VA). נוירונים בגרעינים הכוכביים (SG)   – מבנים דו-צדדיים בצורת כוכב של השרשרת הסימפתטית –   הם מרכיב חשוב בתשתית הסימפתטית. SG הם יעד מוכר לטיפול באמצעות denervation לב אוהד בחולים עם VA עקשן טיפול. בעוד שיפוץ עצבי והפעלה גליה ב SG תוארו בחולים עם VA, התהליכים התאיים והמולקולריים הבסיסיים שעלולים להקדים את תחילת הפרעות קצב אינם מובנים מספיק ויש לברוח כדי לשפר את אפנון האוטונומי. מודלים של עכבר מאפשרים לנו לחקור שיפוץ עצבי אוהד, אבל זיהוי של SG מורין מאתגר עבור החוקר חסר הניסיון. לכן, מחקרים ביולוגיים תאיים ומולקולריים מעמיקים של ס"ג מורין חסרים למחלות לב נפוצות רבות. כאן, אנו מתארים רפרטואר בסיסי לניתוח ולמידה של ה- SG בעכברים בוגרים עבור ניתוחים ברמת ה- RNA (בידוד RNA עבור ניתוחי ביטוי גנים, בהכלאה במקום), רמת חלבון (כתמי הר שלם אימונופלואורסצנטיים) ורמת התא (מורפולוגיה בסיסית, מדידת גודל תאים). אנו מציגים פתרונות פוטנציאליים להתגבר על אתגרים בטכניקת ההכנה, וכיצד לשפר את הכתמים באמצעות מרווה של autofluorescence. זה מאפשר הדמיה של נוירונים, כמו גם תאי גליה באמצעות סמנים הוקמה על מנת לקבוע את הרכב התא ותהליכי שיפוץ. השיטות המוצגות כאן מאפשרות לאפיין את ה- SG כדי לקבל מידע נוסף על תפקוד אוטונומי בעכברים הנוטים ל- VA וניתן להשלים טכניקות נוספות החוקרות רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים האוטונומית בלב.

Introduction

מערכת העצבים האוטונומית הלבית היא שיווי משקל מוסדר היטב של רכיבים סימפטיים, פרזימפתטיים וסנסיריים המאפשרים ללב להסתגל לשינויים סביבתיים עם התגובה הפיזיולוגית המתאימה1,2. הפרעות בשיווי משקל זה, למשל, עלייה בפעילות אוהדת, הוקמו כנהג מפתח לתערוכה, כמו גם תחזוקה של הפרעות קצב חדריות (VA)3,4. לכן, אפנון אוטונומי, שהושג באמצעות הפחתה פרמקולוגית של פעילות אוהדת עם חוסמי בטא, היה אבן פינה בטיפול בחולים עם VA במשךעשרות שנים 5,6. אבל למרות התערבויות פרמקולוגיות וצנתר מבוסס, מספר רלוונטי של חולים עדיין סובל VA7חוזר .

קלט סימפטי ללב מתווך בעיקר באמצעות גופי תאים עצביים בגרעיני הכוכבים (SG), מבנים בצורת כוכב דו-צדדי של השרשרת הסימפתטית, המעבירים מידע באמצעות עצבים תוך-אתאורקטיים רבים מגזע המוח ללב8,9,10. עצב נבט מן SG לאחר פציעה קשורה VA ומוות לבבי פתאומי11,12, המדגיש את SG כיעד אפנון אוטונומי13,14. הפחתת קלט אוהד ללב ניתן להשיג באופן זמני באמצעות הזרקה עורית של הרדמה מקומית או לצמיתות על ידי הסרה חלקית של SG באמצעות בית החזה בסיוע וידאו15,16. denervation אוהד לב מציג אפשרות עבור חולים עם VA עקשן טיפול עם תוצאות מבטיחות14,16,17. למדנו מ SG המוסבר של חולים אלה כי שיפוץ עצבי ונוירוכימי, נוירו-דלקת והפעלה גליאלית הם סימני היכר של שיפוץ אוהד שעלול לתרום או להחמיר תפקוד אוטונומי18,19. ובכל זאת, התהליכים התאיים והמולקולריים הבסיסיים בתאי העצב האלה נשארים מעורפלים עד כה, למשל, תפקיד הטרנס-דיפרנטיציה העצבית לפנוטיפ כולינרגי20,21. מחקרים ניסיוניים מציגים גישות חדשניות לטיפול VA, למשל, הפחתת פעילות עצבית אוהדת באמצעות אופטוגנטיקה22, אבל אפיון מעמיק של SG עדיין חסר פתולוגיות לב רבות ללכת ביד עם VA. מודלים עכבר לחקות פתולוגיות אלה לאפשר ללמוד שיפוץ עצבי כי פוטנציאל לפני תחילת הפרעות קצב12,23. אלה יכולים להסתיים על ידי ניתוחים מורפולוגיים ותפקודיים נוספים לאפיון אוטונומי של הלב ומערכת העצבים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מספקים רפרטואר בסיסי של שיטות המאפשר לנתח ולאפיין את SG מורין כדי לשפר את ההבנה של VA.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש במדינת המבורג (ORG870, 959) והסוכנות הממלכתית נורדריין-ווסטפליאן לטבע, סביבה והגנת הצרכן (LANUV, 07/11) ומתאימים למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011). מחקרים בוצעו באמצעות גברים ונשים (בגילאי 10-24 שבועות) עכברי C57BL/6 (מספר מלאי 000664, מעבדות ג'קסון) ועכברים הומוזיגוס (db/db) או הטרוזיגוס (db/het; שליטה) עבור המוטציה הספונטנית של הסוכרת (Leprdb; בי.סי.אקס. Cg-Dock7m +/+ Leprdb /J, מספר מלאי 000642, מעבדות ג'קסון). המחברים השתמשו בפרוטוקולים בהישג יד ללא וריאציות לעכברים בגילאי עד 60 שבועות.

1. מיקום וריצוי של גרעיני כוכבית מורין

הערה: למרות תיאורים וציורים זמינים בעיקר במינים גדולים יותר, כמה פרסומים תיארו בעבר את המיקום של SG בחולדות24 ועכברים25 באמצעות שיטות אנטומיות וקווי כתב פלואורסצנטיים, בהתאמה.

  1. הכן 50 מ"ל של קרח קר (3-4 °C) הפרין (20 יחידות / מ"ל, ראה טבלה של חומרים) תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). בצעו ניתוח של ה- SG בטמפרטורת החדר (RT).
  2. עכבר מרדים עמוק על ידי שאיפה של 3%-5% איזופלוראן על פי ההנחיות המוסדיות והמקומיות. לאמת הרדמה נאותה על ידי אובדן רפלקס גמילה דוושה. לערוף את ראשם של עכברים או לבצע פריקת צוואר הרחם.
    הערה: נקע צוואר הרחם שגוי יכול לגרום לשבירה של עמוד השדרה ונזק של כלי בית החזה המובילים לדימום אשר מעכב את ההכנה או ניתוק של שרשרת הסימפתטית, כך SG אינם במצב הנכון שלהם. לכן, זה קריטי יש כוח אדם מנוסה לבצע נקע צוואר הרחם או לערוף בעלי חיים בנשימה עמוקה.
  3. לרסס את העור עם אתנול ולפתוח את בית החזה עם שני חתכים לאורך הקווים הציריים הזרועים באמצעות מספריים מאיו ומלקחיים דפוס צר. חותכים את הסרעפת ומסירים את החלק הקדמי של בית החזה.
  4. הסר את חבילת הלב-ריאה על ידי אחיזת אבי העורקים ואת הוועד ממש מעל הסרעפת באמצעות מלקחיים בלונדון חיתוך כל כלי ורקמות חיבור קרוב לעמוד השדרה למטה עם מספריים פזילה.
  5. לשטוף את בית החזה ביסודיות עם PBS הפריניזציה באמצעות פיפטה חד פעמית פלסטיק עד כל עקבות הדם מוסרים.
  6. מניחים את פלג הגוף התחתון תחת משקפת להכנת סטריאומיקוסקופ ומבטיחים תאורה טובה בבית החזה עם מקורות אור חיצוניים.
  7. אתר את הצלע הראשונה ואת שרירי הקולי הארוכים.
    הערה: ה- SG ממוקמים דו-צדדית, במקביל לעמוד השדרה בענף שבין הצלע הראשונה לעמוד השדרה, בחריץ לרוחב לשרירי הקולי הארוכים24. הצד השטוח של ה- SG ממוקם בסמוך לשרירי הקולי הארוכים. בהתאם להכנה, חלקים של שרשרת הסימפתטית עשויים כבר להיות גלויים כמו סיבים לבנים, עקיפים במקביל לעמוד השדרה. אלה יכולים להיות נעוצים יחד לס"ג.
  8. השתמש בעדינות בקצה המלקחיים של דומונט #5/45 כדי לחשוף את רקמת החיבור לרוחב לשריר הקולי הארוך.
  9. סובבו את המלקחיים ב-180° והשתמשו בצד השטוח כדי לאחוז בס"ג ולמשוך אותו החוצה בלחץ מינימלי.
  10. חזור על הפעולה עם ס"ג השני.
  11. מניחים את שני SG בצלחת (קוטר 6 ס"מ) מלא PBS קר ולבדוק עם ההגדלה המתאימה. במידת הצורך, להסיר כלי עודף, רקמת שומן, ועצבים גדולים יותר.
    הערה: גרעינים אוטונומיים מוקפים כמוסת רקמת חיבור המורכב סיבי קולגן פיברובלסטים26,27. החן חמיץ של כמוסות אלה נראה להשתנות בין מינים, סוג אחר שלגרעינים 26 וגיל28. הסר כמה שיותר רקמת חיבור ככל האפשר באמצעות דומונט #5/45 מלקחיים, ואם יש צורך, מספריים קפיציים.
  12. בהתאם למטרת הניסוי, המשך בסעיף 2, 3 או 5 של פרוטוקול זה.

2. פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה של הר שלם

הערה: פרוטוקול זה מותאם מכתמי הרכבה שלם4,29. בצע שלבי דגירה עבור כל ס"ג בבאר אחת של צלחת 96-well והשתמש ב-100 μL (לפתרונות המכילים נוגדנים) ל-200 μL (לכל הפתרונות האחרים) של הפתרון כדי להבטיח כיסוי מלא. בדוק באופן קבוע את הכיסוי וטבילה נכונה של SG עם משקפת. הסר נוזלים באופן ידני עם 200 μL pipette עם טיפ נוסף 10 μL על גבי קצה 200 μL. זה ימנע שאיפה של SG בקצה פיפטה. השתמש בפתרונות טריים ונוזלים סטריליים כדי למנוע צמיחה חיידקית.

  1. תקן SG עבור היסתולוגיה עבור 2 שעות ב RT ב 4% ללא מתנול paraformaldehyde (PFA)/PBS.
  2. תהליך SG מהר ככל האפשר, אבל הם יכולים להיות מאוחסנים במשך 2-4 שבועות ב 4-6 °C ב PBS עם 0.02% (w /v) נתרן אזיד בשלב זה.
  3. הכן פתרון מלאי שחור סודאן (1% סודאן שחור w / v ב 100% אתנול) להפחתת autofluorescence ושיפור של יחס איתות לרקע30. ממיסים במשך 2-3 שעות על מערבב מגנטי ב RT.
    הערה: השתמש בפתרון המלאי למשך 6-8 שבועות לכל היותר, בטל מוקדם יותר כאשר מופיע מטען.
  4. הכן פתרון עבודה שחור סודאני על ידי centrifuging פתרון המלאי במשך 30 דקות במלוא המהירות (13,000 x g)כדי להסיר פסולת ודילול המניה ב 70% אתנול לריכוז סופי של 0.25% סודאן שחור.
  5. לטפל SG עם אקונומיקה של דנט כדי לשפר את פרמביליזציה נוגדן31. הכינו טרי את האקונומיקה של דנט על ידי ערבוב מתנול (MeOH), תמיסת מי חמצן 30% (w/w) ב- H2O ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) ביחס של 4:1:1. הוסף 200 μL לכל SG ומניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך שעה אחד ב RT.
  6. בצע סדרת MeOH יורדת להתייבשות על ידי דגירה במשך 10 דקות כל אחת על שייקר מסלולית: 100% MeOH, 75% MeOH / PBS, 50% MeOH / PBS, 25% MeOH / PBS.
  7. בצע פרמזביליזציה על ידי דגירה SG פעמיים במשך 60 דקות כל אחד PBS / 1% טריטון-X-100 ב RT.
  8. הסר פתרון permeabilization מן SG ולהוסיף פתרון עבודה שחור סודאן. דגירה במשך 2 שעות ב RT על שייקר מסלולית.
  9. בינתיים, להכין פתרון חסימה על ידי הוספת 5% קולטן כיתה סרום סרום אלבומין (BSA) ו 0.1% Triton-X-100 ב PBS כלי 15 מ"ל ולתת לו להתמוסס על שייקר רולר במשך כ 5-10 דקות. דקאנט דרך מסנן נייר קפלים מראש כדי להסיר פסולת.
  10. הסר סודאן שחור בזהירות רבה על ידי הטיית הצלחת בזהירות pipeing מהצד הזקוף.
    הערה: לא ניתן לראות את ה- SG בסודאן שחור. השתמש במקור אור חזק ועבוד לאט. מצעד זה ואילך, ס"ג מוכתמים בשחור ומשפרים את הנראות. אם רקמת חיבור נוספת נראית סביב ס"ג בשלב זה, הסר אותה באמצעות מלקחיים #5/45 דומונט ומספריים קפיציים.
  11. הוסף 200 μL של PBS / 0.1% Triton-X-100 (PBS-T) ולשטוף במשך 5 דקות ב RT על שייקר מסלולית.
  12. הסר PBS-T על ידי שאיפתו עם פיפטה ולחזור על 2 פעמים.
  13. הסר PBS; להוסיף 200 μL של פתרון חסימה ודגורה ב 4 °C (50 °F) לילה על שייקר מסלולית.
  14. למחרת, להכין פתרונות על ידי הוספת נוגדנים עיקריים בפתרון החסימה. התאם ריכוזי נוגדנים מפרוטוקולים שנקבעו.
    הערה: כלול SG אחד כבקרה נוגדנים ללא נוגדן ראשוני (דגירה עם נוגדן antigen-preabsorbed או IgG, אם זמין, או בלוק חוצץ).
  15. בצע דגירה נוגדן ראשוני עבור 36-48 שעות ב 4 °C (6 °F) על שייקר מסלולית. למדידות גודל התא והכתמת נוירונים אוהדים, השתמש בנוגדנים נגד טירוצין הידרוקסילאז (ראה טבלת חומרים להמלצות נוגדנים).
    הערה: מניחים את הצלחת 96-well בתא רטוב (למשל, קופסת פלסטיק מרופדת במגבות נייר רטובות DDH2O) כדי למנוע אידוי בשלב זה.
  16. הסר פתרון נוגדנים בזהירות ולהוסיף 200 μL של PBS-T. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 30 דקות.
  17. הסר PBS-T ולחזור על שלב הכביסה 5 פעמים נוספות.
  18. הכן את פתרון עבודת הנוגדנים המשני על ידי צנטריפוגה של נוגדנים משניים בעלי תווית פלואורסצנטית של Alexa למשך דקה אחת במהירות מלאה (13,000 x גרם) לפני השימוש. לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים על פי הנוגדנים העיקריים 1:500 בתמיסת החסימה ולהוסיף ל- SG. הוסף 1 מיקרוגרם / מ"ל של bisbenzimide H33342 trihydrochloride (הכתמת Hoechst) אם מכתים גרעיניים הוא הרצוי. דגירה במשך 12-24 שעות ב 4 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  19. הסר את פתרון הנוגדנים בזהירות ולהוסיף 200 μL של PBS-T. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 30 דקות.
  20. הסר PBS-T ולחזור על שלב הכביסה 5 פעמים נוספות. בשלב האחרון, השתמש PBS ללא טריטון.
  21. להטבעה, יש למרוח 50-100 מיקרו-לן של מדיום הרכבה פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים)על מגלשת זכוכית ולהניח מתחת למשקפת הכנה. השתמש Dumont #5/45 מלקחיים כדי לאסוף SG מן הצלחת 96-well ולהסיר נוזל עודף על ידי טבילת קצה אחד על נייר מסנן (למשל, כרית ייבוש Whatman) ומניחים אותו על הטיפה.
  22. השתמש במלקחי #5/45 של דומונט כדי לתקן מיקום עם ההגדלה המתאימה.
  23. מניחים בעדינות כיסוי זכוכית (20 מ"מ על 20 מ"מ) ליד ה- SG ויורדים לאט.
    הערה: שימוש מדי מדיום הרכבה יגרום תנועה של SG או הסתבכות של עצבים. במקרה כזה, הסר במהירות את כיסויי השער וחזור על שלבים 2.9-2.21.
  24. תן לשקופיות להתייבש בחושך בלילה ב RT. אחסון של הדגימה המוכתמת אפשרי לפחות 4-6 שבועות ב 4 °C (4 °F).

3. הר שלם בהכלאה במקום

הערה: הרה מלאה במקום-הכלאה של SG מותאם מן האיבר של קורטי32 ואת פלואורסצנטיות RNA מסחרי בפרוטוקול situ (ראה טבלה של חומרים). להשיג בדיקות עבור הגנים של עניין ומאגרים ופתרונות מהספק. כל שלבי הדגירה מבוצעים ב- RT, אם לא צוין אחרת. השתמש PBS סטרילי. אם מעוניינים להכתים מספר ס"ג בבאר אחת, השתמש לפחות 150 μL של חוצצים ופתרונות.

  1. בצע ניתוח של SG כמתואר בשלבים 1.1-1.13.
  2. קיבוע SG עבור 1 שעה ב 200 μL של 4% ללא MeOH PFA / PBS בבאר אחת של צלחת 96 טוב להציב על שייקר מסלולית.
  3. לשטוף את ס"ג שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחת ב 0.1% Tween-20/PBS על שייקר מסלולית.
  4. ייבשו את SG בסדרת MeOH/PBS על ידי הדגירה הבאה ב-50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS ו-100% MeOH למשך 10 דקות כל אחד על שייקר מסלולי.
  5. חנות SG ב -20 °C (50 °F) ב 100% MeOH לילה.
  6. למחרת, מראש לחמם את החממה ל 40 °C (50 °F). בדוק את הטמפרטורה עם מדחום.
  7. Rehydrate SG בסדרת MeOH /PBS הפוכה (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) למשך 10 דקות כל אחד.
  8. לשטוף SG שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב PBS.
  9. בינתיים, להתחיל מראש לחמם את הבדיקות על ידי דגירה ב 40 °C (50 °F) במשך 10 דקות, ואחריו קירור במשך 10 דקות.
  10. דגירה SG ב 200 μL של פרוטאז III במשך 15 דקות.
  11. אופציונלי: בצע טיפול שחור בסודאן כדי להרוות את ההפלה האוטומטית לפי סעיפים 2.3, 2.4 ו-2.8 של פרוטוקול זה אם מתוכנן הכתמת אימונופלואורסצנטיות עוקבת.
  12. לשטוף SG ב 200 μL של 0.1% Tween-20 / PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד על שייקר מסלולית.
  13. אופציונלי: אם יש צורך בהכתמת שיתוף פעולה עם מספר בדיקות, לדלל ערוץ-2 (50x) ואת ערוץ-3 בדיקה (50x) בגשושית ערוץ-1 (1x).
  14. לכסות SG עם 100 μL של בדיקה עבור הגן של עניין ודגרה לילה ב 40 °C (50 °F) עם תסיסה קלה. מניחים את הצלחת 96-באר בתא רטוב ב 40 °C (40 °F) עבור כל מדרגות הדגירה.
    הערה: כלול ס"ג אחד כשליטה שלילית, באמצעות בדיקה נגד גן חיידקי (למשל, דיהידרו-דיפיליקלינט רדוקטאז, Dapb) כדי לבדוק כריכה לא ספציפית של ריאגנטים להגברה בשלבים מאוחרים יותר.
  15. לשטוף SG במאגר כביסה מסופק 3x במשך 15 דקות כל אחד על שייקר מסלולית.
  16. אמפר 1-3, HRP-C1 וחוסם HRP ל-RT. אם יש צורך בהכתמה משותפת עם גשושית ערוץ 2 ו/או ערוץ-2, יש צורך בחימום מראש של HRP-C2 ו-HRP-C3.
  17. לתקן מחדש את SG במשך 10 דקות ב RT ב 4% PFA / PBS על שייקר מסלולית.
  18. לשטוף SG ב 200 μL של חוצץ כביסה מסופק 3x במשך 5 דקות כל אחד על שייקר מסלולית ב RT.
  19. להגברה, דגירה SG עם 100 μL של Amp1 במשך 35 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  20. הסר בזהירות כל נוזל לשטוף SG ב 200 μL של חוצץ כביסה מסופק 3x במשך 5 דקות כל אחד ב RT על שייקר מסלולית.
  21. דגירה SG עם 100 μL של Amp2 במשך 35 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  22. חזור על שלב 3.18.
  23. דגירה SG עם 100 μL של Amp3 במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  24. חזור על שלב 3.18.
  25. דגירה SG עם 100 μL של מסופק Multiplex FL v2 HRP-C1 במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  26. חזור על שלב 3.18.
  27. הכן נוגדן משני מצומד אופל 1:1,000 ב 200 μL של מסופק TSA-חוצץ ודגרת SG במשך 35 דקות ב 40 °C (50 °F) על שייקר מסלולית. להגן מפני אור במהלך הדגירה ומשלב זה ואילך.
  28. חזור על שלב 3.18.
  29. דגירה SG ב 100 μL של חוסם HRP RRP R2 Multiplex FL מסופק במשך 15 דקות ב 40 °C (70 °F) על שייקר מסלולית.
  30. חזור על שלב 3.18.
  31. אופציונלי: להכתמת שיתוף פעולה עם בדיקה ערוץ-2, חזור על שלבים 3.25-3.30 עם HRP-C2 של Multiplex FL v2 שסופק.
  32. אופציונלי: להכתמת שיתוף פעולה עם בדיקה ערוץ-3, חזור על שלבים 3.25-3.30 עם HRP-C3 של Multiplex FL v2 שסופק.
  33. במקרה של כתמים חיסוניים הבאים, בצע שלבים 2.13-2.25 של פרוטוקול זה.
  34. דגירה ב 1% BSA / PBS במשך 30 דקות על שייקר מסלולית.
  35. דגירה SG במשך 30 דקות ב 1 מיקרוגרם / מ"ל של bisbenzimide H33342 trihydrochloride (הכתמת Hoechst) ב 1% BSA / PBS אם מכתים גרעיניים רצויים ו / או להוסיף אלכסה זוג חיטה נבט אגלוטינין (WGA, 1:500) על שייקר מסלולית.
  36. חזור על שלב 3.18.
  37. הטמע כמתואר בשלבים 2.19-2.22.

4. הדמיה ניתח של גרעיני כוכבית מורין

  1. בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית של SG מוטבע במתקן ההדמיה המקומי.
  2. אם נדרשות מדידות גודל תא, התמונה SG מוכתמת עבור טירוצין הידרוקסילאז (ראה טבלת חומרים ) בהגדלה שלפי 200 וצילום תמונות אקראיות של 4-6 מכל ס"ג.
  3. ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ33 כדי להעריך את גודל התא (למשל, עם טבלת עט, ראה טבלת חומרים). השתמש בבחירת יד חופשית, הקף כל תא ולחץ על ניתוח | מדוד כדי להשיג אזור תא. היזהר לכלול רק תאים שלמים, גלויים לחלוטין הממוקמים היטב בתוך SG.
  4. בשיטה זו, בצע מדידה של כ-100 תאים לכל ס"ג.
  5. יש חוקר עיוור לבצע שלבים 4.2-4.3 אם אתה רוצה להשוות ס"ג מעכברים שונים. השתמש בהתפלגות תדירות בתוכנה סטטיסטית כדי להציג באופן חזותי הבדלי גודל בין קבוצות34.

5. ניתוחים מולקולריים של גרעיני כוכבית מורין

הערה: כלול פקדים בהתאם לעיצוב הניסיוני שלך. זה יכול להיות SG עם גנוטיפים שונים רקע מחלות ו / או גרעינים אוטונומיים אחרים, כגון גנגליון צוואר הרחם העליון אוהד (הממוקם באזור הצוואר, ראה תיאור מפורט זיגלר ואח'35) או גרעינים parasympathetic (כגון גרעינים תוך לב, ראה יונגן ואח'.

  1. הכן צינור 2 מ"ל עם 500 μL של פנול / guanidine thiocyanate פתרון (למשל, Qiazol) לכל חיה ויש לי חנקן נוזלי מוכן לציפוי זעזועים או לשקול פתרונות מסחריים להגנה על RNA (אופציונלי, ראה טבלת חומרים)36. עבוד במהירות לבידוד RNA.
  2. בצע ניתוח של SG כמתואר בשלבים 1.1-1.13.
  3. מיד לטבול את שני SG ישירות בצינור אחד עם פנול / guanidine thiocyanate פתרון וצינור כפור הלם בחנקן נוזלי.
  4. יש לאחסן ב-80 °C (70 °F) עד לעיבוד נוסף.
  5. עבור תמוגה רקמה, לתת צינורות עם SG להפשיר עד פנול / guanidine thiocyanate פתרון הוא נזיל ולהוסיף שני חרוזים נירוסטה 7 מ"מ. מצננים את חלקי המתכת של הומוגניזר רקמות (טחנת כדור או מיקסר, למשל, רקמה ליסר II) על קרח יבש וצנטריפוגה ב 4 °C (50 °F).
  6. צינורות צנטריפוגות ב 500 x גרם במשך 1 דקות ב 4 °C (70 °F), כך SG נמצאים בתחתית הצינור.
  7. שים צינורות לתוך חלקי המתכת של ליזר רקמה וליזה במשך 1 דקות ב 20 הרץ.
  8. חזור על שלבים 5.6 ו 5.7 עד 5 פעמים עד שאין ניתן לזהות רקמה שלמה.
  9. מעבירים את הנוזל לצינור 1.5 מ"ל טרי.
  10. בצע בידוד RNA עם ערכת בידוד RNA מבוססת טורים (למשל, ערכת מיני miRNeasy) בהתאם להוראות היצרן.
  11. יש צורך ב-RNA ב-20 מיקרו-אל של מים נטולי RNase ומדוד ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר.
    הערה: כדי לא לכלול זיהום של RNA מטוהר עם DNA גנומי, אנו מציעים לבצע תגובת שרשרת פולימראז עם פריימרים גנומיים ו 1 μL של RNA כתבנית, במקום פחות בקרת תמלול הפוכה. זה יחסוך כמות משמעותית של RNA. אם RNA מזוהם, השתמש בפריימרים גבול אקסון-intron או פריימרים לאגף intron עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית הבאה.
  12. השתמש 250 ng SG RNA כדי לבצע סינתזה cDNA ולהשתמש בפרוטוקולים הוקמה. כאן, ערכת תמלול הפוך cDNA בקיבולת גבוהה שימשה בהתאם להוראות היצרן.
  13. לדלל לריכוז סופי של 2.5 ng/μL של cDNA ולבצע תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת עם הבדיקות המתאימות על פי הפרוטוקולים שנקבעו. כאן, TaqMan Assay (ראה טבלת חומרים)בוצע באמצעות 10 ng cDNA לכל תגובה.
    הערה: בצע שליטה ללא תבנית עבור כל גן כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות.
  14. נרמל ביטוי גנים של גן העניין שלך על גן שמירה על הבית (למשל, Cdkn1b) כדי להשוות ביטוי גנים יחסי בין קבוצות שונות של SG.

תוצאות

איור 1 מדמיין כיצד לזהות ולנתח את ה-SG. איור 1A מציג ציור סכמטי של המיקום, ואילו איור 1B מציג את הנוף לבית החזה לאחר הסרת חבילת הלב-ריאה. שרירי הקולי הארוכים השמאליים והימניים מתווכים מהס"ג וכלוב הצלעות הם ציוני דרך חשובים להתמצאות. הניתוח מתבצע ?...

Discussion

ההבנה של תהליכים תאיים ומולקולריים בתאי עצב ותאי גליה של מערכת העצבים הסימפתטית שקדמו לתהתפרצות VA היא עניין רב, כמו דום לב פתאומי נשאר הגורם הנפוץ ביותר למוות ברחבי העולם5. לכן, בכתב היד הנוכחי, אנו מספקים רפרטואר בסיסי של שיטות לזיהוי ה- Murine SG – אלמנט מורין בתוך רשת זו – ולבצע ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות להארטוויג ויבולדט על הסיוע הטכני המצוין שלו, ולמתקן הדמיית המיקרוסקופיה בבריטניה (Umif) של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף על אספקת מיקרוסקופים ותמיכה. מחקר זה מומן על ידי DZHK (המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם) [FKZ 81Z4710141].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

References

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272 (2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963 (2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918 (2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674 (2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved