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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

I cambiamenti fisiopatologici nel sistema nervoso autonomo cardiaco, specialmente nel suo ramo simpatico, contribuiscono all'insorgenza e al mantenimento delle aritmie ventricolari. Nel presente protocollo, mostriamo come caratterizzare i gangli stellati murini per migliorare la comprensione dei processi molecolari e cellulari sottostanti.

Abstract

Il sistema nervoso autonomo è un importante driver dell'elettrofisiologia cardiaca. Soprattutto il ruolo del suo ramo simpatico è una questione di indagine in corso nella fisiopatologia delle aritmie ventricolari (VA). I neuroni nei gangli stellati (SG)   - strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica -   sono una componente importante dell'infrastruttura simpatica. L'SG è un obiettivo riconosciuto per il trattamento tramite denervazione cardiaca simpatica in pazienti con VA refrattaria-terapia. Mentre il rimodellamento neuronale e l'attivazione gliale nell'SG sono stati descritti nei pazienti con VA, i processi cellulari e molecolari sottostanti che potenzialmente precedono l'insorgenza dell'aritmia non sono solo sufficientemente compresi e devono essere chiariti per migliorare la modulazione autonomica. I modelli di topo ci permettono di studiare il rimodellamento neuronale simpatico, ma l'identificazione dell'SG murino è una sfida per l'investigatore inesperto. Pertanto, mancano studi biologici cellulari e molecolari approfonditi dell'SG murino per molte malattie cardiache comuni. Qui descriviamo un repertorio di base per la dissezione e lo studio dell'SG nei topi adulti per analisi a livello di RNA (isolamento dell'RNA per analisi dell'espressione genica, ibridazione in situ), livello proteico (colorazione immunofluorescente dell'intero supporto) e livello cellulare (morfologia di base, misurazione delle dimensioni delle cellule). Presentiamo potenziali soluzioni per superare le sfide nella tecnica di preparazione e come migliorare la colorazione attraverso la tempra dell'autofluorescenza. Ciò consente la visualizzazione di neuroni e cellule gliali tramite marcatori stabiliti al fine di determinare la composizione cellulare e i processi di rimodellamento. I metodi qui presentati consentono di caratterizzare l'SG per ottenere ulteriori informazioni sulla disfunzione autonoma nei topi inclini all'AV e possono essere integrati da tecniche aggiuntive che studiano i componenti neuronali e gliali del sistema nervoso autonomo nel cuore.

Introduzione

Il sistema nervoso autonomo cardiaco è un equilibrio strettamente regolato di componenti simpatici, parasimpatici e sensoriali che consente al cuore di adattarsi ai cambiamenti ambientali con l'appropriata rispostafisiologica 1,2. Disturbi in questo equilibrio, ad esempio, un aumento dell'attività simpatica, sono stati stabiliti come driver chiave per l'insorgenza e il mantenimento delle aritmie ventricolari (VA)3,4. Pertanto, la modulazione autonoma, ottenuta attraverso la riduzione farmacologica dell'attività simpatica con beta-bloccanti, è stata una pietra miliare nel trattamento dei pazienti con VAper decenni 5,6. Ma nonostante gli interventi farmacologici e cateteri, un numero rilevante di pazienti soffre ancora di VA7 ricorrente.

L'input simpatico al cuore è per lo più mediato attraverso corpi cellulari neuronali nei gangli stellati (SG), strutture bilaterali a forma di stella della catena simpatica, che relè le informazioni attraverso numerosi nervi intratoracici dal tronco encefalicoal cuore 8,9,10. Il nervo che germoglia dall'SG dopo la lesione è associato all'AV e alla morte cardiacaimprovvisa 11,12,sottolineando l'SG come bersaglio per la modulazione autonomica13,14. Una riduzione dell'input simpatico al cuore può essere ottenuta temporaneamente tramite iniezione percutanea di anestetici locali o permanentemente mediante rimozione parziale dell'SG tramite toracoscopia video-assistita15,16. La denervazione cardiaca simpatica presenta un'opzione per i pazienti con VA refrattaria terapeuticacon risultati promettenti 14,16,17. Abbiamo imparato dall'SG estipeato di questi pazienti che il rimodellamento neuronale e neurochimico, la neuro-infiammazione e l'attivazione gliale sono segni distintivi del rimodellamento simpatico che potrebbe contribuire o aggravare la disfunzioneautonomica 18,19. Tuttavia, i processi cellulari e molecolari sottostanti in questi neuroni rimangono oscuri fino ad oggi, ad esempio il ruolo della transdifferenziazione neuronale in un fenotipo colinergico20,21. Studi sperimentali presentano nuovi approcci per trattare l'AV, ad esempio la riduzione dell'attività nervosa simpatica attraverso l'optogenetica22, ma la caratterizzazione approfondita dell'SG è ancora carente in molte patologie cardiache che vanno di pari passo con l'AV. I modelli di topo che imitano queste patologie consentono di studiare il rimodellamento neuronale che potenzialmente precede l'insorgenza delle aritmie12,23. Questi possono essere completati da ulteriori analisi morfologiche e funzionali per la caratterizzazione autonomica del cuore e del sistema nervoso. Nel presente protocollo, forniamo un repertorio di base di metodi che consentono di sezionare e caratterizzare l'SG murino per migliorare la comprensione dell'AV.

Protocollo

Tutte le procedure riguardanti gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dello Stato di Amburgo (ORG870, 959) e dall'Agenzia statale per la protezione della natura, dell'ambiente e dei consumatori del Nord Reno-Westfalia (LANUV, 07/11) e conformi alla Guida degli Istituti nazionali di sanità per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (2011). Gli studi sono stati eseguiti utilizzando topi maschi e femmine (di età compresa tra 10 e 24 settimane) C57BL/6 (numero di serie 000664, Jackson Laboratories) e topi omozigoti (db/db) o eterozigoti (db/het; controllo) per la mutazione spontanea del diabete (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, numero di stock 000642, Jackson Laboratories). Gli autori hanno utilizzato i protocolli a portata di mano senza variazioni per topi di età fino a 60 settimane.

1. Posizione e dissezione dei gangli stellati murini

NOTA: Anche se descrizioni e disegni sono per lo più disponibili in specie più grandi, alcune pubblicazioni hanno precedentemente descritto la posizione dell'SG neiratti 24 e topi 25 utilizzando rispettivamente metodi anatomici e linee fluorescenti di reporter.

  1. Preparare 50 mL di ghiaccio-freddo (3-4 °C) eparinato (20 unità/mL, vedi Tabella dei materiali)salina tamponata con fosfato (PBS). Eseguire la dissezione dell'SG a temperatura ambiente (RT).
  2. Anestetizzare profondamente il topo per inalazione del 3-5% di isoflurane secondo le linee guida istituzionali e locali. Verificare un'anestesia adeguata per perdita del riflesso di prelievo del pedale. Decapitare i topi o eseguire la lussazione cervicale.
    NOTA: Una lussazione cervicale errata può causare rottura della colonna vertebrale e danni dei vasi toracici che portano a sanguinamento che ostacola la preparazione o la rottura della catena simpatica, in modo che SG non sia nella loro posizione corretta. Pertanto, è fondamentale che il personale esperto esegua la lussazione cervicale o decapiti gli animali in sedazione profonda.
  3. Spruzzare la pelle con etanolo e aprire il torace con due incisioni lungo le linee ascellari anteriori usando forbici Mayo e forcette a motivi stretti. Tagliare il diaframma e rimuovere la parte anteriore della gabbia toracica.
  4. Rimuovere il pacchetto cuore-polmone afferrando l'aorta e la vena cava proprio sopra il diaframma usando le forcelle londinesi e tagliando tutti i vasi e il tessuto connettivo vicino alla colonna vertebrale sottostante con le forbici Strabismus.
  5. Lavare accuratamente il torace con PBS eparinizzato utilizzando una pipetta monouso in plastica fino a quando non vengono rimosse tutte le tracce di sangue.
  6. Posizionare il busto sotto il binocolo di preparazione stereomicroscopio e garantire una buona illuminazione nel torace con sorgenti luminose esterne.
  7. Individuare la prima costola e i muscoli longus colli.
    NOTA: L'SG si trova bilateralmente, parallelamente alla colonna vertebrale al ramo tra la prima costola e la colonna vertebrale, in una scanalatura laterale ai muscoli lunghi dei colli24. Il lato piatto dell'SG si trova adiacente ai muscoli longus colli. A seconda della preparazione, parti della catena simpatica potrebbero già essere visibili come fibre bianche e oblique parallele alla colonna vertebrale. Questi possono essere rintracciati lungo l'SG.
  8. Utilizzare delicatamente la punta delle forcep Dumont #5/45 per esporre il tessuto connettivo laterale al muscolo longus colli.
  9. Ruotare le pinze di 180° e utilizzare il lato piatto per afferrare l'SG ed estrarlo con la pressione minima.
  10. Ripetere con il secondo SG.
  11. Posizionare entrambi gli SG in un piatto (diametro 6 cm) riempito con PBS freddo e ispezionare con l'ingrandimento appropriato. Se necessario, rimuovere i vasi in eccesso, il tessuto adiposo e i nervi più grandi.
    NOTA: I gangli autonomici sono circondati da una capsula del tessuto connettivo composta da fibre di collagene efibroblasti 26,27. La permeabilità di queste capsule sembra variare tra le specie, diversi tipi di gangli26 e28 anni. Rimuovere il più possibile il tessuto connettivo utilizzando le forcelle Dumont #5/45 e, se necessario, le forbici a molla.
  12. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, procedere con le sezioni 2, 3 o 5 di questo protocollo.

2. Protocollo immunoistochimica a montaggio intero

NOTA: Questo protocollo è adattato dalle colorazioni cardiache a montaggiointero 4,29. Eseguire fasi di incubazione per ogni singolo SG in un unico pozzo di una piastra da 96 porcili e utilizzare 100 μL (per soluzioni contenenti anticorpi) a 200 μL (per tutte le altre soluzioni) della soluzione per garantire una copertura completa. Controllare regolarmente la copertura e la corretta immersione dell'SG con binocolo. Rimuovere manualmente i liquidi con una pipetta da 200 μL con una punta aggiuntiva di 10 μL sopra la punta di 200 μL. Ciò impedirà l'aspirazione dell'SG nella punta della pipetta. Utilizzare soluzioni preparate al momento e liquidi sterili per prevenire la crescita batterica.

  1. Fissare SG per l'istologia per 2 ore a RT in paraformaldeide (PFA) /PBS priva di metanolo al 4%.
  2. Elaborare SG il più rapidamente possibile, ma a questo punto possono essere conservati per 2-4 settimane a 4-6 °C in PBS con azide di sodio 0,02% (w/v).
  3. Preparare la soluzione di calcio nero Sudan (1% Sudan nero w/v in 100% etanolo) per la riduzione dell'autofluorescenza e il miglioramento del rapporto segnale/sfondo30. Sciogliere per 2-3 ore su un agitatore magnetico a RT.
    NOTA: Utilizzare la soluzione stock per un massimo di 6-8 settimane, scartare prima quando appare la sedimentazione.
  4. Preparare sudan soluzione di lavoro nero centrifugando la soluzione stock per 30 minuti a tutta velocità (13.000 x g)per rimuovere i detriti e diluire lo stock in etanolo al 70% a una concentrazione finale dello 0,25% sudan nero.
  5. Trattare SG con candeggina di Dent per migliorare la permeabilizzazione deglianticorpi 31. Preparare al più fresco la candeggina di Dent mescolando metanolo (MeOH), soluzione di perossido di idrogeno 30% (w/w) in H2O e solfossido di dimetile (DMSO) in un rapporto di 4:1:1. Aggiungere 200 μL per SG e posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 1 h a RT.
  6. Eseguire una serie meoh discendente per la reidratazione incubando per 10 minuti ciascuno su uno shaker orbitale: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
  7. Eseguire la permeabilità incubando SG due volte per 60 minuti ciascuno in PBS/1% Triton-X-100 presso RT.
  8. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione dall'SG e aggiungere la soluzione di lavoro nero Sudan. Incubare per 2 ore a RT su uno shaker orbitale.
  9. Nel frattempo, preparare una soluzione di blocco aggiungendo albumina di siero bovino di grado recettore 5% (BSA) e 0,1% Triton-X-100 in PBS un recipiente da 15 mL e lasciarlo sciogliere su uno shaker a rulli per circa 5-10 minuti. Decantare attraverso un filtro di carta pre-plissettato per rimuovere i detriti.
  10. Rimuovere il sudan nero con molta attenzione inclinando la piastra e tubazionando con cura dal lato verticale.
    NOTA: Non è possibile vedere l'SG in Sudan nero. Utilizzare una forte fonte di luce e lavorare lentamente. Da questo passo in avanti, SG è colorato di nero, migliorando la visibilità. Se a questo punto si vede un tessuto connettivo aggiuntivo che circonda SG, rimuoverlo utilizzando le forcelle Dumont #5/45 e le forbici a molla.
  11. Aggiungere 200 μL di PBS/0,1% Triton-X-100 (PBS-T) e lavare per 5 minuti a RT su uno shaker orbitale.
  12. Rimuovere PBS-T aspirarlo con una pipetta e ripetere 2 volte.
  13. Rimuovere PBS; aggiungere 200 μL di soluzione di blocco e incubare a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale.
  14. Il giorno successivo, preparare le soluzioni aggiungendo anticorpi primari nella soluzione di blocco. Adattare le concentrazioni di anticorpi dai protocolli stabiliti.
    NOTA: Includere un SG come controllo anticorpale senza anticorpo primario (incubato con anticorpo preassorbito di antigene o IgG, se disponibile, o tampone di blocco).
  15. Eseguire l'incubazione primaria degli anticorpi per 36-48 h a 4 °C su uno shaker orbitale. Per le misurazioni delle dimensioni delle cellule e la colorazione dei neuroni simpatici, utilizzare anticorpi contro l'idrossilasi tirosina (vedi Tabella dei materiali per le raccomandazioni anticorpali).
    NOTA: Posizionare la piastra da 96 poggia in una camera bagnata (ad esempio, scatola di plastica rivestita con tovaglioli di carta bagnati ddH2O) per evitare l'evaporazione a questo punto.
  16. Rimuovere attentamente la soluzione anticorpale e aggiungere 200 μL di PBS-T. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 30 minuti.
  17. Rimuovere PBS-T e ripetere il passaggio di lavaggio 5 volte in più.
  18. Preparare la soluzione di lavoro anticorpale secondaria centrifugando gli anticorpi secondari fluorescenti etichettati Alexa per 1 minuto a piena velocità (13.000 x g ) primadell'uso. Diluire gli anticorpi secondari appropriati in base agli anticorpi primari 1:500 nella soluzione di blocco e aggiungere a SG. Aggiungere 1 μg/mL di bisbenzimide H33342 tricloruro (colorazione hoechst) se si desidera la colorazione nucleare. Incubare per 12-24 ore a 4 °C su uno shaker orbitale.
  19. Rimuovere attentamente la soluzione anticorpale e aggiungere 200 μL di PBS-T. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 30 minuti.
  20. Rimuovere PBS-T e ripetere il passaggio di lavaggio 5 volte in più. Per l'ultimo passaggio, utilizzare PBS senza Triton.
  21. Per l'incorporamento, stendere 50-100 μL di mezzo di montaggio fluorescente (vedi Tabella dei materiali)su uno scivolo di vetro e posizionare sotto il binocolo di preparazione. Utilizzare le forcep Dumont #5/45 per prescippare SG dalla piastra da 96 e rimuovere il liquido in eccesso immergere un'estremità su una carta da filtro (ad esempio, il tampone di essiccazione Whatman) e posizionarlo sulla goccia.
  22. Utilizzare i forcep Dumont #5/45 per correggere il posizionamento con l'ingrandimento appropriato.
  23. Posizionare delicatamente un coverslip di vetro (20 mm x 20 mm) accanto all'SG e scendere lentamente.
    NOTA: L'uso di un mezzo di montaggio troppo comporterà il movimento dell'SG o l'aggrovigliamento dei nervi. In tal caso, rimuovere rapidamente il coverslip e ripetere i passaggi 2.9-2.21.
  24. Lasciare asciugare gli scivoli al buio durante la notte a RT. Lo stoccaggio dell'esemplare macchiato è possibile per almeno 4-6 settimane a 4 °C.

3. Ibridazione in situ a montaggio intero

NOTA: L'ibridazione in situ a montaggio intero dell'SG è adattata dall'organo del corti32 e dal protocollo commerciale fluorescenza RNA in situ (vedi Tabella dei materiali). Ottenere sonde per i geni di interesse e tamponi e soluzioni dal fornitore. Tutte le fasi di incubazione vengono eseguite a RT, se non menzionate diversamente. Utilizzare PBS sterile. Se sei interessato a macchiare più SG in un unico pozzo, usa almeno 150 μL di tamponi e soluzioni.

  1. Eseguire la dissezione dell'SG come descritto nei passaggi 1.1-1.13.
  2. Fissare SG per 1 h in 200 μL di PFA/PBS privo di MeOH al 4% in un pozzo di una piastra da 96 po' posizionata su uno shaker orbitale.
  3. Lavare SG tre volte per 30 minuti ciascuno nello 0,1% di Tween-20/PBS su uno shaker orbitale.
  4. Disidratare SG nella serie MeOH/PBS con successiva incubazione in 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS e 100% MeOH per 10 min ciascuno su uno shaker orbitale.
  5. Conservare SG a -20 °C in 100% MeOH durante la notte.
  6. Il giorno dopo, preripidi l'incubatore a 40 °C. Controllare la temperatura con un termometro.
  7. Reidratare SG nella serie MeOH/PBS inversa (100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS) per 10 min ciascuno.
  8. Lavare SG tre volte per 5 minuti ciascuno in PBS.
  9. Nel frattempo, iniziare a preririludere le sonde per incubazione a 40 °C per 10 minuti, seguite da raffreddamento per 10 minuti.
  10. Incubare SG in 200 μL di Proteasi III per 15 min.
  11. Facoltativo: eseguire il trattamento nero Sudan per spegnere l'autofluorescenza secondo le sezioni 2.3, 2.4 e 2.8 di questo protocollo se è prevista una successiva colorazione dell'immunofluorescenza.
  12. Lavare SG in 200 μL dello 0,1% Tween-20/PBS 3x per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.
  13. Facoltativo: se si desidera la co-colorazione con più sonde, diluire la sonda Channel-2 (50x) e Channel-3 (50x) nella sonda Channel-1 (1x).
  14. Coprire SG con 100 μL di sonda per il gene di interesse e incubare durante la notte a 40 °C con leggera agitazione. Posizionare la piastra di 96 po 'in una camera bagnata a 40 °C per tutte le fasi di incubazione.
    NOTA: Includere un SG come controllo negativo, utilizzando una sonda contro un gene batterico (ad esempio, diidro-dipicolinato reduttasi, Dapb) per verificare la presenza di riassiemi di amplificazione non specifici nei passaggi successivi.
  15. Lavare SG nel tampone di lavaggio in dotazione 3 volte per 15 minuti ciascuno su uno shaker orbitale.
  16. Amp1-3 pre-caldo, HRP-C1 e HRP-Blocker a RT. Se si desidera la co-colorazione con la sonda Channel-2 e/o Channel-2, pre-riscaldare HRP-C2 e HRP-C3.
  17. Ri-fissare SG per 10 minuti a RT nel 4% PFA/PBS su uno shaker orbitale.
  18. Lavare SG in 200 μL di tampone di lavaggio in dotazione 3x per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale a RT.
  19. Per l'amplificazione, incubare SG con 100 μL di Amp1 per 35 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
  20. Rimuovere con cura qualsiasi liquido e lavare SG in 200 μL di tampone di lavaggio in dotazione 3x per 5 minuti ciascuno a RT su uno shaker orbitale.
  21. Incubare SG con 100 μL di Amp2 per 35 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
  22. Ripetere il passaggio 3.18.
  23. Incubare SG con 100 μL di Amp3 per 20 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
  24. Ripetere il passaggio 3.18.
  25. Incubare SG con 100 μL di Multiplex FL v2 HRP-C1 in dotazione per 20 min a 40 °C su uno shaker orbitale.
  26. Ripetere il passaggio 3.18.
  27. Preparare l'anticorpo secondario coniugato da Opale 1:1.000 in 200 μL di tampone TSA in dotazione e incubare SG per 35 minuti a 40 °C su uno shaker orbitale. Proteggere dalla luce durante l'incubazione e da questo passaggio.
  28. Ripetere il passaggio 3.18.
  29. Incubare SG in 100 μL di bloccante Multiplex FL v2 HRP in dotazione per 15 minuti a 40 °C su uno shaker orbitale.
  30. Ripetere il passaggio 3.18.
  31. Opzionale: per la co-colorazione con sonda Channel-2, ripetere i passaggi 3.25-3.30 con multiplex FL v2 HRP-C2 in dotazione.
  32. Opzionale: per la co-colorazione con la sonda Channel-3, ripetere i passaggi 3.25-3.30 con multiplex FL v2 HRP-C3 in dotazione.
  33. In caso di successiva colorazione immunofluorescente, eseguire i passaggi 2.13-2.25 di questo protocollo.
  34. Incubare in 1% BSA/PBS per 30 minuti su uno shaker orbitale.
  35. Incubare SG per 30 min in 1 μg/mL di bisbenzimide H33342 tricloruro (colorazione Hoechst) in 1% BSA/PBS se si desidera colorazione nucleare e/o aggiungere l'agglutinina germinale di grano accoppiato alexa (WGA, 1:500) su uno shaker orbitale.
  36. Ripetere il passaggio 3.18.
  37. Incorporare come descritto nei passaggi 2.19-2.22.

4. Imaging e analisi dei gangli stellati murini

  1. Eseguire la microscopia confocale di SG incorporato nella struttura di imaging locale.
  2. Se sono necessarie misurazioni delle dimensioni delle celle, l'immagine SG macchiata per l'idrossilasi tirosina (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento 200x e prendere 4-6 immagini casuali da ogni SG.
  3. Analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ33 per stimare le dimensioni delle celle (ad esempio, con una tabella a penna, vedere Tabella dei materiali). Utilizzare selezione a mano libera, cerchiare ogni cella e fare clic su Analizza | Misurare per ottenere l'area cellulare. Fare attenzione a includere solo celle intatte e completamente visibili che si trovano ben all'interno dell'SG.
  4. Utilizzando questo metodo, eseguire la misurazione di circa 100 celle per SG.
  5. Fare in modo che un investigatore accecato esegua i passaggi 4.2-4.3 se si desidera confrontare SG da topi diversi. Utilizzare una distribuzione di frequenza nel software statistico per visualizzare le differenze di dimensione tra igruppi 34.

5. Analisi molecolari dei gangli stellati murini

NOTA: includi i controlli a seconda del tuo progetto sperimentale. Questo potrebbe essere SG con diversi genotipi e background della malattia e / o altri gangli autonomici, come il simpatico ganglio cervicale superiore (situato nella zona del collo, vedi descrizione dettagliata in Ziegler et al.35) o gangli parasimpatici (come i gangli intracardiaci, vedi Jungen et al.4).

  1. Preparare un tubo da 2 ml con 500 μL di soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina (ad esempio Qiazol) per animale e avere azoto liquido pronto per la glassa d'urto o prendere in considerazione soluzioni commerciali per la protezione dell'RNA (facoltativo, vedi Tabella dei materiali)36. Lavora rapidamente per l'isolamento dell'RNA.
  2. Eseguire la dissezione dell'SG come descritto nei passaggi 1.1-1.13.
  3. Immergere immediatamente sia LG direttamente in un unico tubo con soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina che tubo shock-gelo in azoto liquido.
  4. Conservare a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
  5. Per la lisi tissutale, lasciare che i tubi con SG si scongelino fino a quando la soluzione di tiocianato di fenolo/guanidina non viene liquefatti e aggiungere due perline in acciaio inossidabile da 7 mm. Raffreddare le parti metalliche dell'omogeneizzatore tissutale (mulino a sfera o miscelatore, ad esempio Tissue Lyser II) su ghiaccio secco e centrifuga a 4 °C.
  6. Tubi di centrifuga a 500 x g per 1 min a 4 °C in modo che SG si trova nella parte inferiore del tubo.
  7. Mettere i tubi nelle parti metalliche del Tissue Lyser e liscire per 1 minuto a 20 Hz.
  8. Ripetere i passaggi 5.6 e 5.7 fino a 5 volte fino a quando nessun tessuto intatto è rilevabile.
  9. Trasferire il liquido in un tubo fresco da 1,5 ml.
  10. Eseguire l'isolamento dell'RNA con un kit di isolamento dell'RNA basato su colonna (ad esempio, mini kit miRNeasy) secondo le istruzioni del produttore.
  11. Elute RNA in 20 μL di acqua priva di RNasi e misurare la concentrazione usando uno spettrofotometro.
    NOTA: Per escludere la contaminazione dell'RNA purificato con DNA genomico, proponiamo di eseguire una reazione a catena della polimerasi con primer genomici e 1 μL di RNA come modello, invece meno il controllo della transcriptasi inversa. Ciò farà risparmiare una quantità significativa di RNA. Se l'RNA è contaminato, utilizzare primer al contorno esone-introno o primer di fianco dell'introne per la successiva reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale.
  12. Utilizzare 250 ng SG RNA per eseguire la sintesi cDNA e utilizzare protocolli stabiliti. Qui, è stato utilizzato un kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità secondo le istruzioni del produttore.
  13. Diluire ad una concentrazione finale di 2,5 ng/μL di cDNA ed eseguire una reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale con le sonde appropriate secondo i protocolli stabiliti. Qui, il saggio TaqMan (vedi Tabella dei materiali) è stato eseguito utilizzando 10 ng cDNA per reazione.
    NOTA: eseguire il controllo senza modello per ogni gene per escludere risultati falsi positivi.
  14. Normalizza l'espressione genica del tuo gene di interesse su un gene di mantenimento della casa (ad esempio Cdkn1b)per confrontare l'espressione genica relativa tra diversi gruppi di SG.

Risultati

La figura 1 mostra come identificare e sezionare la figura 1A di SG. I muscoli longus colli sinistro e destro mediano dall'SG e la gabbia toracica sono importanti punti di riferimento per l'orientamento. La dissezione viene eseguita lungo le linee tratteggiate tra i muscoli e la prima costola. L'SG e la catena simpatica diventano visibili come strutture bianche (Figura 1C). La figu...

Discussione

La comprensione dei processi cellulari e molecolari nei neuroni e nelle cellule gliali del sistema nervoso simpatico che precedono l'insorgenza dell'AV è di alto interesse, poiché l'arresto cardiaco improvviso rimane la causa più comune di morte intutto il mondo 5. Pertanto, nel manoscritto attuale, forniamo un repertorio di base di metodi per identificare l'SG murino - un elemento murino all'interno di questa rete - ed eseguire analisi successive a livello di RNA, proteine e cellulare.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Hartwig Wieboldt per la sua eccellente assistenza tecnica e l'UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) dell'University Medical Center Hamburg-Eppendorf per aver fornito microscopi e supporto. Questa ricerca è stata finanziata dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) [FKZ 81Z4710141].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

Riferimenti

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