Localização, Dissecção e Análise do Gânglio Murine Stellate

Resumo

Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.

Resumo

O sistema nervoso autônomo é um driver substancial de eletrofisiologia cardíaca. Especialmente o papel de seu ramo simpático é uma questão de investigação em curso na fisiopatologia das arritmias ventriculares (VA). Os neurônios da gânglios estelares (SG)   – estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática –   são um componente importante da infraestrutura simpática. O SG é um alvo reconhecido para o tratamento via denervação cardíaca em pacientes com terapia-refratário va. Embora a remodelagem neuronal e a ativação gliana no SG tenham sido descritas em pacientes com VA, os processos celulares e moleculares subjacentes que potencialmente precedem o início da arritmia são apenas insuficientemente compreendidos e devem ser elucidados para melhorar a modulação autônoma. Modelos de mouse nos permitem estudar remodelagem neuronal simpática, mas a identificação do Murine SG é um desafio para o investigador inexperiente. Assim, faltam estudos biológicos celulares e moleculares aprofundados da SG murina para muitas doenças cardíacas comuns. Aqui, descrevemos um repertório básico para dissecar e estudar o SG em camundongos adultos para análises no nível de RNA (isolamento de RNA para análises de expressão genética, hibridização in situ), nível de proteína (coloração de montagem total imunofluorescente) e nível celular (morfologia básica, medição do tamanho da célula). Apresentamos soluções potenciais para superar desafios na técnica de preparação e como melhorar a coloração através da sacieciação da autofluorescência. Isso permite a visualização de neurônios, bem como células gliais através de marcadores estabelecidos, a fim de determinar processos de composição celular e remodelação. Os métodos aqui apresentados permitem caracterizar o SG para obter mais informações sobre disfunção autônoma em camundongos propensos ao VA e podem ser complementados por técnicas adicionais que investigam componentes neuronais e gliais do sistema nervoso autônomo no coração.

Introdução

O sistema nervoso autônomo cardíaco é um equilíbrio fortemente regulado de componentes simpáticos, parassimpáticos e sensoriais que permite ao coração se adaptar às mudanças ambientais com a resposta fisiológica adequada^1,2. Distúrbios nesse equilíbrio, por exemplo, um aumento da atividade solidária, foram estabelecidos como um driver-chave para o início, bem como a manutenção de arritmias ventriculares (VA)^3,4. Portanto, a modulação autônoma, alcançada através da redução farmacológica da atividade simpática com beta-bloqueadores, tem sido uma pedra an....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Estado de Hamburgo (ORG870, 959) e pela Agência Estadual de Proteção à Natureza, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor (LANUV, 07/11) e conforme o Guia nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório (2011). Foram realizados estudos utilizando camundongos do sexo masculino e feminino (10-24 semanas) C57BL/6 (número de estoque 000664, Jackson Laboratories) e camundongos homozigos (db/db) ou heterozigous (db/het; controle) para a mutação espontânea do diabetes (Lepr^db; BKS. Cg-Dock7^m+/+ Leprdb /J, número de ações 000642, Jackson Laboratories). Os....

Resultados

A Figura 1 visualiza como identificar e dissecar o SG. A Figura 1A mostra um desenho esquemático do local, enquanto a Figura 1B apresenta a visão no tórax após a remoção do pacote coração-pulmão. Os músculos longus colli esquerdo e direito medial do SG e da caixa torácica são marcos importantes para a orientação. A dissecação é realizada ao longo das linhas pontilhadas entre os músculos e a primeira costela. O SG e.......

Discussão

A compreensão dos processos celulares e moleculares em neurônios e células gliais do sistema nervoso simpático que precedem o início do VA é de alto interesse, pois a parada cardíaca súbita continua sendo a causa de morte mais comum em todo o mundo⁵. Portanto, no manuscrito atual, fornecemos um repertório básico de métodos para identificar o Murine SG – elemento murino dentro dessa rede – e realizar análises subsequentes sobre RNA, proteína e nível celular.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	TPP	92097	RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mm	R. Langenbrinck	03-0060	Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.	Serva	11924.03	Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B2261	Whole mount staining
Chicken anti neurofilament	EMD Millipore	AB5539	Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	D8418	Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	AP194SA6	Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568	Thermo Fisher Scientific	A11057	Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Whole mount staining
Drying block 37-100 mm	Whatman (Sigma Aldrich)	WHA10310992	Whole mount staining
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009	Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)	Th.Geyer	2212.5000	Whole mount staining
Eukitt mounting medium	AppliChem	253681.0008	Whole mount staining
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPI	Southern Biotech	0100-20	Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferase	EMD Millipore	AP144P	Whole mount staining
H2O2 30% (w/w)	Merck, KGA, Darmstadt, Germany	H1009	Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml	Rotexmedica	PZN: 3862340	Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kit	Life technologies	4368813	RNA isolation
Isoflurane (Forene)	Abbott Laboratories	2594.00.00	Preparation SG
Mayer's hemalum solution	Merck	1.09249.0500	Whole mount staining
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller	Marienfeld	0101040	Whole mount staining
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	RNA isolation
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C	RNA isolation
Opal 570 Reagent Pack	Akoya Bioscience	FP1488001KT	RNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free	Alfa Aesar	43368	Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm	Th.Geyer	7691202	Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tablets	Gibco	18912-014	Whole mount staining
Pinzette Dumont SS Forceps	FineScienceTools	11203-25	Preparation SG
QIAzol Lysis Reagent	Qiagen	79306	RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylase	EMD Millipore	AB152	Whole mount staining
RNAlater	Merck	R0901-100ML	RNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2	biotechne (ACD)	323100	RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2	biotechne (ACD)	431738-C2	RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3	biotechne (ACD)	423391	RNAscope
Stainless steel beads 7 mm	Qiagen	69990	RNA isolation
Sudan black B	Roth	0292.2	Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)	Thermo Fisher Scientific	4331182	Gene expression analysis
TaqMan mastermix	Applied biosystems	4370074	Gene Expression analysis
Tissue Lyser II	Qiagen	85300	RNA isolation
Triton X-100 10% solution	Sigma-Aldrich	93443-100ml	Whole mount staining
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML	RNAscope
Wacom bamboo pen	Wacom	CTL-460/K	Cell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2	Sigma-Aldrich	WHA10311647	Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W21404	RNAscope