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Alterações fisiopatológicas no sistema nervoso autônomo cardíaco, especialmente em seu ramo simpático, contribuem para o surgimento e manutenção de arritmias ventriculares. No presente protocolo, mostramos como caracterizar gânglios estelares murinos para melhorar a compreensão dos processos moleculares e celulares subjacentes.
O sistema nervoso autônomo é um driver substancial de eletrofisiologia cardíaca. Especialmente o papel de seu ramo simpático é uma questão de investigação em curso na fisiopatologia das arritmias ventriculares (VA). Os neurônios da gânglios estelares (SG) – estruturas bilaterais em forma de estrela da cadeia simpática – são um componente importante da infraestrutura simpática. O SG é um alvo reconhecido para o tratamento via denervação cardíaca em pacientes com terapia-refratário va. Embora a remodelagem neuronal e a ativação gliana no SG tenham sido descritas em pacientes com VA, os processos celulares e moleculares subjacentes que potencialmente precedem o início da arritmia são apenas insuficientemente compreendidos e devem ser elucidados para melhorar a modulação autônoma. Modelos de mouse nos permitem estudar remodelagem neuronal simpática, mas a identificação do Murine SG é um desafio para o investigador inexperiente. Assim, faltam estudos biológicos celulares e moleculares aprofundados da SG murina para muitas doenças cardíacas comuns. Aqui, descrevemos um repertório básico para dissecar e estudar o SG em camundongos adultos para análises no nível de RNA (isolamento de RNA para análises de expressão genética, hibridização in situ), nível de proteína (coloração de montagem total imunofluorescente) e nível celular (morfologia básica, medição do tamanho da célula). Apresentamos soluções potenciais para superar desafios na técnica de preparação e como melhorar a coloração através da sacieciação da autofluorescência. Isso permite a visualização de neurônios, bem como células gliais através de marcadores estabelecidos, a fim de determinar processos de composição celular e remodelação. Os métodos aqui apresentados permitem caracterizar o SG para obter mais informações sobre disfunção autônoma em camundongos propensos ao VA e podem ser complementados por técnicas adicionais que investigam componentes neuronais e gliais do sistema nervoso autônomo no coração.
O sistema nervoso autônomo cardíaco é um equilíbrio fortemente regulado de componentes simpáticos, parassimpáticos e sensoriais que permite ao coração se adaptar às mudanças ambientais com a resposta fisiológica adequada1,2. Distúrbios nesse equilíbrio, por exemplo, um aumento da atividade solidária, foram estabelecidos como um driver-chave para o início, bem como a manutenção de arritmias ventriculares (VA)3,4. Portanto, a modulação autônoma, alcançada através da redução farmacológica da atividade simpática com beta-bloqueadores, tem sido uma pedra an....
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Estado de Hamburgo (ORG870, 959) e pela Agência Estadual de Proteção à Natureza, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor (LANUV, 07/11) e conforme o Guia nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório (2011). Foram realizados estudos utilizando camundongos do sexo masculino e feminino (10-24 semanas) C57BL/6 (número de estoque 000664, Jackson Laboratories) e camundongos homozigos (db/db) ou heterozigous (db/het; controle) para a mutação espontânea do diabetes (Leprdb; BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, número de ações 000642, Jackson Laboratories). Os....
A Figura 1 visualiza como identificar e dissecar o SG. A Figura 1A mostra um desenho esquemático do local, enquanto a Figura 1B apresenta a visão no tórax após a remoção do pacote coração-pulmão. Os músculos longus colli esquerdo e direito medial do SG e da caixa torácica são marcos importantes para a orientação. A dissecação é realizada ao longo das linhas pontilhadas entre os músculos e a primeira costela. O SG e.......
A compreensão dos processos celulares e moleculares em neurônios e células gliais do sistema nervoso simpático que precedem o início do VA é de alto interesse, pois a parada cardíaca súbita continua sendo a causa de morte mais comum em todo o mundo5. Portanto, no manuscrito atual, fornecemos um repertório básico de métodos para identificar o Murine SG – elemento murino dentro dessa rede – e realizar análises subsequentes sobre RNA, proteína e nível celular.
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores gostariam de agradecer a Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica, e o UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) do University Medical Center Hamburg-Eppendorf por fornecer microscópios e suporte. Esta pesquisa foi financiada pelo DZHK (Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
Microscope cover glasses 20x20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
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