JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kardiyak otonom sinir sistemindeki patofizyolojik değişiklikler, özellikle sempatik branşında, ventriküler aritmilerin başlamasına ve korunmasına katkıda bulunur. Mevcut protokolde, alttaki moleküler ve hücresel süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için murine stellat gangliyonunun nasıl karakterize edilir olduğunu gösteriyoruz.

Özet

Otonom sinir sistemi, kardiyak elektrofizyolojinin önemli bir sürücüsüdür. Özellikle sempatik dalının rolü, ventriküler aritmilerin (VA) patofizyolojisinde devam eden bir araştırma konusudur. Sempatik zincirin çift taraflı yıldız şeklindeki yapıları olan yıldız gangliyonlarındaki (SG)     nöronlar sempatik altyapının önemli bir bileşenidir. SG, tedavi-refrakter VA'lı hastalarda kardiyak sempatik denervasyon yoluyla tedavi için tanınan bir hedeftir. VA'lı hastalarda SG'de nöronal remodeling ve glial aktivasyon tanımlanmış olmakla birlikte, aritmi başlangıcından önce potansiyel olarak altta kalan hücresel ve moleküler süreçler sadece yeterince anlaşılmamıştır ve otonom modülasyonu iyileştirmek için aydınlatılmalıdır. Fare modelleri sempatik nöronal yeniden şekillendirmeyi incelememize izin verir, ancak murine SG'nin tanımlanması deneyimsiz araştırmacı için zordur. Bu nedenle, murine SG'nin derinlemesine hücresel ve moleküler biyolojik çalışmaları birçok yaygın kardiyak hastalık için eksiktir. Burada, yetişkin farelerde SG'nin RNA düzeyinde analizler (gen ekspresyon analizleri için RNA izolasyonu, yerinde hibridizasyon), protein seviyesi (immünofluoresan bütün montaj lekelenmesi) ve hücresel düzeyde (temel morfoloji, hücre büyüklüğü ölçümü) incelenmesi ve incelenmesi için temel bir repertuar açıklıyoruz. Hazırlık tekniğindeki zorlukların üstesinden gelmek için potansiyel çözümler sunuyoruz ve otofluoresansların söndürülerek boyamanın nasıl iyileştirileceği. Bu, hücre kompozisyonunu ve yeniden şekillendirme süreçlerini belirlemek için nöronların yanı sıra glial hücrelerin yerleşik belirteçler aracılığıyla görselleştirilmesine izin verir. Burada sunulan yöntemler, SG'nin VA'ya eğilimli farelerde otonomik disfonksiyon hakkında daha fazla bilgi edinmesine izin verir ve kalpteki otonom sinir sisteminin nöronal ve glial bileşenlerini araştıran ek tekniklerle tamamlanabilir.

Giriş

Kardiyak otonom sinir sistemi, kalbin uygun fizyolojik yanıtla çevresel değişikliklere uyum sağlamasını sağlayan sempatik, parasempatik ve duyusal bileşenlerin sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir dengesidir1,2. Bu dengedeki bozukluklar, örneğin sempatik aktivitenin artması, başlangıç için önemli bir sürücü olarak ventrikül aritmilerinin (VA) bakımı olarak belirlenmiştir3,4. Bu nedenle, beta-blokerlerle sempatik aktivitenin farmakolojik olarak azaltılması yoluyla elde edilen otonom modülasyon, on yıllardırVA'lıhastaların tedavisinde bir temel taşı olmuştur 5,6. Ancak farmakolojik ve kateter bazlı müdahalelere rağmen, ilgili sayıda hasta hala tekrarlayan VA7'denmuzdariptir.

Kalbe sempatik giriş çoğunlukla, beyin sapından kalbe çok sayıda intratorasik sinir yoluyla bilgi aktaran sempatik zincirin yıldız gangliyonlarındaki (SG) çift taraflı yıldız şeklindeki yapılarındaki nöronal hücre cisimleri aracılığıylaaracılıkeder 8 ,9,10. Yaralanmadan sonra SG'den filizlenen sinir VA ve ani kardiyak ölüm ile ilişkilidir11,12, SG'yi otonom modülasyon için bir hedef olarak vurgulayarak13,14. Kalbe sempatik girişin azaltılması geçici olarak lokal anesteziklerin perkütan enjeksiyonu ile veya video destekli torakoskopi ile SG'nin kısmen çıkarılması ile kalıcı olarak elde edilebilir15,16. Kardiyak sempatik denervasyon, umut verici sonuçlarla tedavi-refrakter VA'lı hastalar için bir seçenek sunar14,16,17. Bu hastaların eksiz SG'lerinden nöronal ve nörokimyasal remodeling, nöro-inflamasyon ve glial aktivasyonun otonomik disfonksiyona katkıda bulunabilecek veya ağırlaştırabilecek sempatik yeniden şekillendirmenin ayırt edici özellikleri olduğunu öğrendik18,19. Yine de, bu nöronlardaki altta yatan hücresel ve moleküler süreçler, örneğin, nöronal transdifferentiasyonun kolinerjik fenotip20,21'erolü gibi bugüne kadar belirsizliğini korumamaktadır. Deneysel çalışmalar VA'yı tedavi etmek için yeni yaklaşımlar sunar, örneğin, optogenetik22yoluyla sempatik sinir aktivitesinin azaltılması , ancak SG'nin derinlemesine karakterizasyonu VA ile birlikte giden birçok kardiyak patolojide hala eksiktir. Bu patolojileri taklit eden fare modelleri, aritmilerin başlangıcından önce potansiyel olarak12,23olan nöronal yeniden şekillendirmeyi incelemeye izin verir. Bunlar, kalbin ve sinir sisteminin otonom karakterizasyonu için daha fazla morfolojik ve fonksiyonel analizlerle tamamlanabilir. Mevcut protokolde, VA'nın anlaşılmasını geliştirmek için murine SG'yi parçalamaya ve karakterize etmeye izin veren temel bir yöntem repertuarı sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler Hamburg Eyaleti Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ORG870, 959) ve Kuzey Ren-Vestfalya Devlet Doğa, Çevre ve Tüketiciyi Koruma Ajansı (LANUV, 07/11) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (2011) uygun. Çalışmalar, diyabet spontan mutasyonu (Leprdb)için erkek ve dişi (10-24 haftalık) C57BL/6 fareler (stok numarası 000664, Jackson Laboratuvarları) ve fareler homozigous (db/db) veya heterozygous (db/het; kontrol) kullanılarak gerçekleştirildi. BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, hisse senedi numarası 000642, Jackson Laboratories). Yazarlar, 60 haftaya kadar olan fareler için varyasyon olmadan eldeki protokolleri kullanmıştır.

1. Murine stellate gangliyonunun yeri ve diseksiyonu

NOT: Açıklamalar ve çizimler çoğunlukla daha büyük türlerde mevcut olsa da, bazı yayınlar daha önce sırasıyla anatomik yöntemler ve floresan muhabir çizgileri kullanarak sıçan24 ve fare25'te SG'nin yerini tanımlamaktadır.

  1. 50 mL buz gibi (3-4 °C) heparinize (20 birim/mL, bkz. Malzeme Tablosu) fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
  2. Kurumsal ve yerel yönergelere göre% 3-% 5 izofluran soluyarak fareyi derinden uyuşturun. Pedal çekme refleksini kaybederek yeterli anesteziyi doğrulayın. Farelerin kafasını kopar veya servikal çıkık gerçekleştirin.
    NOT: Yanlış servikal çıkık omurganın kırılmasına ve sempatik zincirin hazırlanmasını veya kesilmesini engelleyen kanamaya yol açan torasik damarların hasar görmesine neden olabilir, böylece SG doğru konumda değildir. Bu nedenle, deneyimli personelin derin sedasyonda servikal çıkık veya hayvanların kafasının kesilmesini sağlamak önemlidir.
  3. Cilde etanol püskürtün ve mayo makası ve dar desenli ön kılcal çizgiler boyunca iki kesi ile toraksı açın. Diyaframı kesin ve göğüs kafesinin önünü çıkarın.
  4. Londra tokmaklarını kullanarak diyaframın hemen üstündeki aort ve vena kavayı kavrayarak ve Strabismus makası ile aşağıdaki omurgaya yakın tüm damarları ve bağ dokusunu keserek kalp-akciğer paketini çıkarın.
  5. Tüm kan izleri giderilene kadar toraksı plastik tek kullanımlık pipet kullanarak heparinize PBS ile iyice yıkayın.
  6. Gövdeyi stereomikroskop hazırlama dürbünü altına yerleştirin ve dış ışık kaynaklarıyla toraksta iyi aydınlatma sağlayın.
  7. İlk kaburgayı ve longus colli kaslarını bulun.
    NOT: SG, ilk kaburga ile omurga arasındaki daldaki omurgaya paralel olarak, longus colli kaslarına yanal bir olukta iki taraflı olarak bulunur24. SG'nin düz tarafı longus colli kaslarına bitişiktir. Preparata bağlı olarak, sempatik zincirin parçaları omurgaya paralel beyaz, eğik lifler olarak zaten görülebilir. Bunlar SG'ye kadar izlenebilir.
  8. Bağ dokusu lateralini longus colli kasına maruz bırakmak için Dumont #5/45 tokalarının ucunu hafifçe kullanın.
  9. Toparlamaları 180° döndür ve SG'yi kavramak ve minimum basınçla çıkarmak için düz tarafı kullanın.
  10. İkinci SG ile tekrarlayın.
  11. Her iki SG'yi de soğuk PBS ile dolu bir tabağa (6 cm çapında) yerleştirin ve uygun büyütme ile inceleyin. Gerekirse, fazla damarları, yağ dokusunu ve daha büyük sinirleri çıkarın.
    NOT: Otonom gangliyonlar kollajen lifleri ve fibroblastlardan oluşan bir bağ dokusu kapsülü ile çevrilidir26,27. Bu kapsüllerin geçirgenliği türler arasında, farklı gangliyontürü 26 ve yaş28arasında değişiyor gibi görünüyor. Dumont #5/45 #5 ve gerekirse yay makası kullanarak mümkün olduğunca çok bağ dokusunu çıkarın.
  12. Deneyin amacına bağlı olarak, bu protokolün bölüm 2, 3 veya 5'ine geçin.

2. Tüm montaj immünhistokimya protokolü

NOT: Bu protokol kardiyak bütün montaj lekelerinden uyarlanmıştır4,29. Her bir SG için kuluçka adımlarını 96 kuyu plakasının bir kuyusunda gerçekleştirin ve tam kapsama sağlamak için çözeltinin 200 μL'sine (diğer tüm çözümler için) 100 μL (antikor içeren çözeltiler için) kullanın. SG'nin kapsamını ve doğru daldırmasını dürbünle düzenli olarak kontrol edin. Sıvıları 200 μL ucun üzerine ek 10 μL uçlu 200 μL pipetle manuel olarak çıkarın. Bu, pipet ucundaki SG'nin aspirasyonunu önleyecektir. Bakteri üremesini önlemek için yeni hazırlanmış çözeltiler ve steril sıvılar kullanın.

  1. Histoloji için SG'i %4 metanol içermeyen paraformaldehit (PFA)/PBS'de RT'de 2 saat boyunca düzeltin.
  2. SG'yi mümkün olduğunca çabuk işleyin, ancak bu noktada% 0.02 (w / v) sodyum azit ile PBS'de 4-6 ° C'de 2-4 hafta saklanabilirler.
  3. Sudan siyah stok çözeltisini hazırlayın (%100 etanolde%1 Sudan siyah w/v) otofluoresansın azaltılması ve sinyalin arka plan oranına iyileştirilmesi için30. RT'de manyetik karıştırıcıda 2-3 saat çözün.
    NOT: Stok çözeltisini en fazla 6-8 hafta kullanın, sedimasyon göründüğünde daha erken atın.
  4. Enkazı gidermek için stok çözeltisini tam hızda (13.000 x g)30 dakika santrifüjleyarak ve stoku% 70 etanolde% 0.25 Sudan siyahı nihai konsantrasyonuna seyrelterek Sudan siyah çalışma çözümünü hazırlayın.
  5. Antikor permeabilizasyonunu iyileştirmek için SG'yi Dent'in çamaşır suyu ile tedavi edin31. Metanol (MeOH), hidrojen peroksit çözeltisini H2O'da %30 (w/w) ve dimetil sülfit (DMSO) 4:1:1 oranında karıştırarak Dent'in çamaşır suyunu yeni hazırlayın. SG başına 200 μL ekleyin ve plakayı RT'de 1 saat boyunca bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin.
  6. Yörüngesel çalkalayıcıda her biri 10 dakika kuluçkaya yatırarak rehidrasyon için alçalan bir MeOH serisi gerçekleştirin: %100 MeOH, %75 MeOH/PBS, %50 MeOH/PBS, %25 MeOH/PBS.
  7. RT'de PBS/%1 Triton-X-100'de SG'yi her biri 60 dakika boyunca iki kez inkübe ederek permeabilizasyon gerçekleştirin.
  8. SG'den permeabilizasyon çözümünü çıkarın ve Sudan siyah çalışma çözümünü ekleyin. Yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat kuluçkaya yatır.
  9. Bu arada PBS 15 mL'lik bir kapta %5 reseptör sınıfı sığır serum albümini (BSA) ve %0,1 Triton-X-100 ekleyerek bir blokaj çözeltisi hazırlayın ve yaklaşık 5-10 dakika boyunca bir makara çalkalayıcı üzerinde çözünmesini sağlayın. Enkazı kaldırmak için önceden pileli bir kağıt filtreden dekant.
  10. Plakayı yatırarak ve dik taraftan dikkatlice pipetleyarak Sudan siyahını çok dikkatli bir şekilde çıkarın.
    NOT: Sudan'da SG'yi siyah görmek mümkün değildir. Güçlü bir ışık kaynağı kullanın ve yavaşça çalışın. Bu adımdan itibaren, SG siyah lekeli ve görünürlüğü artırır. Bu noktada SG'yi çevreleyen herhangi bir ek bağ dokusu görülürse, Dumont #5/45 arsip ve yay makası kullanarak çıkarın.
  11. 200 μL PBS/%0,1 Triton-X-100 (PBS-T) ekleyin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda RT'de 5 dakika yıkayın.
  12. PBS-T'yi pipetle aspire ederek çıkarın ve 2 kez tekrarlayın.
  13. PBS'yi kaldırın; 200 μL blokaj çözeltisi ekleyin ve yörüngesel bir çalkalayıcıda bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  14. Ertesi gün, blokaj çözeltisinin içine birincil antikorlar ekleyerek çözümler hazırlayın. Antikor konsantrasyonlarını belirlenen protokollerden uyarlar.
    NOT: Birincil antikor olmadan antikor kontrolü olarak bir SG ekleyin (varsa antijen-preabsorbed antikor veya IgG ile inkübe edilmiş veya tamponu bloke edin).
  15. Orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de 36-48 saat boyunca primer antikor inkübasyonu gerçekleştirin. Hücre büyüklüğü ölçümleri ve sempatik nöronların lekelenmesi için tirozin hidroksilaz'a karşı antikor kullanın (antikor önerileri için Malzeme Tablosu'ne bakın).
    NOT: Bu noktada buharlaşmayı önlemek için 96 kuyu plakasını ıslak bir odaya (örneğin, ddH2O-ıslatlanmış kağıt havlularla kaplı plastik kutu) yerleştirin.
  16. Antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 200 μL PBS-T ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  17. PBS-T'yi çıkarın ve yıkama adımını 5 kez daha tekrarlayın.
  18. Floresan Alexa etiketli ikincil antikorları kullanımdan önce tam hızda (13.000 x g) 1 dakika santrifüj ederek ikincil antikor çalışma solüsyonini hazırlayın. Uygun ikincil antikorları blokaj çözeltisinde 1:500 birincil antikorlara göre seyreltin ve SG'ye ekleyin. Nükleer lekelenme isteniyorsa 1 μg/mL bisbenzimide H33342 trihidrochloride (Hoechst boyama) ekleyin. Yörüngesel bir çalkalayıcıda 4 °C'de 12-24 saat kuluçkaya yatır.
  19. Antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 200 μL PBS-T ekleyin. Plakayı 30 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  20. PBS-T'yi çıkarın ve yıkama adımını 5 kez daha tekrarlayın. Son adım için, Triton olmadan PBS kullanın.
  21. Gömmek için, 50-100 μL floresan montaj ortamını (bkz. Malzeme Tablosu)bir cam kaydırağa yayın ve hazırlama dürbünü altına yerleştirin. 96 kuyulu plakadan SG almak ve bir ucını bir filtre kağıdına (örneğin, Whatman kurutma pedi) batırarak fazla sıvıyı çıkarmak için Dumont #5/45 toparlalarını kullanın ve damlaya yerleştirin.
  22. Uygun büyütme ile konumlandırmayı düzeltmek için Dumont #5/45 tozlarını kullanın.
  23. SG'nin yanına hafifçe bir cam kapak kılıfı (20 mm x 20 mm) yerleştirin ve yavaşça alçalın.
    NOT: Çok fazla montaj ortamı kullanmak SG'nin hareketine veya sinirlerin karışmasına neden olur. Bu durumda, kapak kapağını hızla çıkarın ve 2.9-2.21 adımlarını tekrarlayın.
  24. RT'de slaytların bir gecede karanlıkta kurumasına izin verin Lekeli numunenin depolanmasının 4 °C'de en az 4-6 hafta boyunca mümkün olması mümkündür.

3. Tüm montaj yerinde hibridizasyon

NOT: SG'nin tüm montajlı yerinde hibridizasyonu, corti32'nin organından ve ticari RNA floresan in situ protokolünden uyarlanmıştır (bkz. Malzeme Tablosu). Tedarikçiden ilgi genleri ve tamponlar ve çözümler için problar alın. Aksi belirtilmezse, tüm kuluçka adımları RT'de gerçekleştirilir. Steril PBS kullanın. Bir kuyuda birkaç SG'yi boyamak istiyorsanız, en az 150 μL tampon ve çözelti kullanın.

  1. 1.1-1.13 adımlarında açıklandığı gibi SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
  2. SG'nin yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirilmiş 96 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda %4 MeOH içermeyen PFA/PBS'nin 200 μL'sinde 1 saat sabitle.
  3. SG'yi yörüngesel bir çalkalayıcıda %0,1 Ara-20/PBS'de her biri 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. MeOH/PBS serisindeki susuz SG, yörüngesel çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca %50 MeOH/PBS, %70 MeOH/PBS ve %100 MeOH inkübasyon ile.
  5. SG'i bir gecede %100 MeOH'da -20 °C'de saklayın.
  6. Ertesi gün, inkübatörden 40 ° C'ye önceden ısıtın. Sıcaklığı bir termometre ile kontrol edin.
  7. SG'yi ters MeOH/PBS serisinde (%100 MeOH, %70 MeOH/PBS, %50 MeOH/PBS) her biri 10 dakika boyunca yeniden su verin.
  8. PBS'de her biri 5 dakika boyunca SG'yi üç kez yıkayın.
  9. Bu arada, probları 40 °C'de 10 dakika kuluçka ile önceden ısıtmaya ve ardından 10 dakika soğutmaya başlayın.
  10. 15 dakika boyunca 200 μL Proteaz III'te SG'yi kuluçkaya yatırın.
  11. İsteğe bağlı: Sonraki immünoresans lekeleme planlanırsa, bu protokolün 2.3, 2.4 ve 2.8 bölümlerine göre otofluoresansı söndürmek için Sudan siyah tedavisi gerçekleştirin.
  12. SG'yi 200 μL'de % 0,1 Ara-20/PBS 3x'te yörüngesel bir çalkalayıcıda 5 dakika boyunca yıkayın.
  13. İsteğe bağlı: Birkaç probla birlikte boyama isteniyorsa, Kanal-1 probunda (1x) Kanal-2 (50x) ve Kanal-3 problarını (50x) seyreltin.
  14. İlgi genini 100 μL prob ile örtün ve hafif ajitasyonla 40 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. 96 kuyu plakasını tüm kuluçka adımları için 40 °C'de ıslak bir odaya yerleştirin.
    NOT: Daha sonraki adımlarda amplifikasyon reaktiflerinin spesifik olmayan bağlanmasını kontrol etmek için bakteri geni (örneğin dihidro-dipikolinat redüktaz, Dapb)aleyhinde bir prob kullanarak negatif kontrol olarak bir SG ekleyin.
  15. SG'yi orbital çalkalayıcıda her biri 15 dakika boyunca 3x yıkama tamponunda yıkayın.
  16. Önceden ısınan Amp1-3, HRP-C1 ve RT'ye HRP-Blocker. Kanal-2 ve/veya Kanal-2 probu ile birlikte boyama isteniyorsa, önceden ısınır HRP-C2 ve HRP-C3.
  17. Yörüngesel çalkalayıcıda %4 PFA/PBS'de SG'i RT'de 10 dakika boyunca yeniden sabitle.
  18. RT'de yörüngesel çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 200 μL'lik birlikte verilen yıkama tamponunda SG'yi yıkayın.
  19. Amplifikasyon için, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca 100 μL Amp1 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
  20. Herhangi bir sıvıyı dikkatlice çıkarın ve SG'yi 200 μL'de 3x birlikte verilen yıkama tamponunda 5 dakika boyunca RT'de bir yörünge çalkalayıcıda yıkayın.
  21. Yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca 100 μL Amp2 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
  22. 3.18.
  23. Yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 20 dakika boyunca 100 μL Amp3 ile SG'yi kuluçkaya yatırın.
  24. 3.18.
  25. SG'yi 100 μL ile kuluçkaya yatırın Multiplex FL v2 HRP-C1, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 20 dakika boyunca.
  26. 3.18.
  27. Opal konjuge ikincil antikoru 200 μL'de 1:1.000 TSA tamponu hazırlayın ve yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 35 dakika boyunca SG'yi kuluçkaya yayalım. Kuluçka sırasında ışıktan ve bu adımdan koruyun.
  28. 3.18.
  29. SG'yi 100 μL'de kuluçkaya yatırın Multiplex FL v2 HRP-bloker, yörüngesel bir çalkalayıcıda 40 °C'de 15 dakika boyunca.
  30. 3.18.
  31. İsteğe bağlı: Kanal-2 probu ile birlikte boyama için, birlikte verilen Multiplex FL v2 HRP-C2 ile 3.25-3.30 adımlarını yineleyin.
  32. İsteğe bağlı: Kanal-3 probu ile birlikte boyama için, birlikte verilen Multiplex FL v2 HRP-C3 ile 3.25-3.30 adımlarını yineleyin.
  33. Sonraki immünoresan lekeleme durumunda, bu protokolün 2.13-2.25 adımlarını uygulayın.
  34. Yörüngesel çalkalayıcıda 30 dakika boyunca %1 BSA/PBS'de kuluçkaya yatır.
  35. Nükleer lekelenme isteniyorsa, 1 μg/mL bisbenzimide H33342 trihidroklorür (Hoechst boyama) içinde 30 dakika boyunca SG'yi % 1 BSA/PBS'de kuluçkalayın ve/veya yörüngesel bir çalkalayıcıya Alexa-bağlantılı buğday tohumu agglutinin (WGA, 1:500) ekleyin.
  36. 3.18.
  37. 2.19-2.22 adımlarında açıklandığı gibi katıştır.

4. Murine stellat gangliyonlarının görüntülenmesi ve analizleri

  1. Yerel görüntüleme tesisinde gömülü SG'nin konfokal mikroskopisini gerçekleştirin.
  2. Hücre boyutu ölçümleri gerekiyorsa, 200x büyütmede tirozin hidroksilaz için lekeli görüntü SG (bkz. Malzeme Tablosu)ve her SG'den 4-6 rastgele görüntü alın.
  3. Hücre boyutunu tahmin etmek için ImageJ33 yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin (örneğin, kalem tablosuyla bkz. Malzeme Tablosu). Serbest El Seçimi'|kullanın, her hücreyi daire içine alıp Analiz Et'e tıklayın Hücre alanı elde etmek için ölçün. Sadece SG içinde iyi bulunan sağlam, tamamen görünür hücreleri dahil etmeye dikkat edin.
  4. Bu yöntemi kullanarak, SG başına yaklaşık 100 hücrenin ölçümünü gerçekleştirin.
  5. Farklı farelerden SG'yi karşılaştırmak istiyorsanız kör bir araştırmacının 4.2-4.3 adımlarını gerçekleştirmesini isteyin. Gruplar arasındaki boyut farklarını görselleştirmek için istatistiksel yazılımda bir frekans dağılımı kullanın34.

5. Murine stellat gangliyonlarının moleküler analizleri

NOT: Deneysel tasarımınıza bağlı olarak kontrolleri ekleyin. Bu, sempatik üst servikal ganglion (boyun bölgesinde bulunur, Ziegler ve ark.35'teayrıntılı açıklamaya bakın) veya parasempatik gangliyon (intradiyak gangliyon gibi, Jungen vd.4gibi) gibi farklı genotiplere ve hastalık geçmişine ve / veya diğer otonom gangliyonlara sahip SG olabilir.

  1. Hayvan başına 500 μL fenol/guanidin tiyosiyanat çözeltisi (örneğin, Qiazol) içeren 2 mL'lik bir tüp hazırlayın ve şok-buzlanmaya hazır sıvı nitrojene sahip olun veya RNA'nın korunması için ticari çözümleri düşünün (isteğe bağlı, bkz. Malzeme Tablosu)36. RNA yalıtımı için hızlı bir şekilde çalışın.
  2. 1.1-1.13 adımlarında açıklandığı gibi SG'nin diseksiyonu gerçekleştirin.
  3. Her iki SG'yi de fenol/guanidin tiyosiyanat çözeltisi ve sıvı nitrojendeki şok-don tüpü ile hemen tek bir tüpe daldırin.
  4. Bir sonraki işleme kadar -80 °C'de saklayın.
  5. Doku lizisi için, fenol/ guanidin tiyosiyanat çözeltisi sıvılaştırılına kadar SG'li tüplerin çözülmesine izin verin ve iki adet 7 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Doku homojenizatörün metal kısımlarını (top veya mikser değirmeni, örneğin Doku Lyser II) kuru buz ve santrifüj üzerinde 4 °C'de soğutun.
  6. SSG'nin tüpün altında olması için 4 °C'de 1 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj tüpleri.
  7. Doku Lyser ve lyse'nin metal kısımlarına 20 Hz'de 1 dakika tüp koyun.
  8. Sağlam bir doku tespit edilemeyene kadar 5.6 ve 5.7 adımlarını 5 kata kadar tekrarlayın.
  9. Sıvıyı taze bir 1,5 mL tüpe aktarın.
  10. Üreticinin talimatlarına göre sütun tabanlı bir RNA yalıtım kiti (örneğin, miRNeasy mini kit) ile RNA yalıtımı gerçekleştirin.
  11. 20 μL RNaz içermeyen suda Elute RNA ve spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün.
    NOT: Saflaştırılmış RNA'nın genomik DNA ile kirlenmesini dışlamak için, genomik astarlarla bir polimeraz zincir reaksiyonu ve şablon olarak 1 μL RNA gerçekleştirmeyi öneriyoruz, bunun yerine eksi ters transkriptaz kontrolü. Bu, önemli miktarda RNA tasarrufu sağlayacaktır. RNA kirlenmişse, sonraki nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu için ekson-intron sınır astarları veya intron kanat astarları kullanın.
  12. CDNA sentezi gerçekleştirmek ve belirlenmiş protokolleri kullanmak için 250 ng SG RNA kullanın. Burada üreticinin talimatlarına göre yüksek kapasiteli bir cDNA ters transkripsiyon kiti kullanılmıştır.
  13. 2,5 ng/μL cDNA'lık son konsantrasyona seyreltin ve belirlenen protokollere göre uygun problarla nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin. Burada, TaqMan Assay (bkz. Malzeme Tablosu)reaksiyon başına 10 ng cDNA kullanılarak gerçekleştirildi.
    NOT: Yanlış pozitif sonuçları dışlamak için her gen için şablonsuz kontrol gerçekleştirin.
  14. Farklı SG grupları arasındaki bağıl gen ekspresyonunu karşılaştırmak için ilgi geninizin gen ekspresyonunu gen tutan bir evde (örneğin, Cdkn1b)normalleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, SG'nin nasıl tanımılacağını ve inceldiğini görselleştirir. Şekil 1A, konumun şematik bir çizimini gösterirken, Şekil 1B, kalp-akciğer paketinin çıkarılmasından sonra görünümü toraksa sunar. SG ve göğüs kafesinden gelen sol ve sağ longus colli kasları oryantasyon için önemli yerlerdir. Diseksiyon kaslar ve ilk kaburga arasındaki noktalı çizgiler boyunca gerçekleştirilir. SG ve sempatik zin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Va başlangıcından önce sempatik sinir sisteminin nöronlarında ve glial hücrelerinde hücresel ve moleküler süreçlerin anlaşılması, ani kalp durması dünya çapında en yaygın ölüm nedeni olmaya devam ettiği için yüksek ilgi çekicidir5. Bu nedenle, mevcut yazıda, bu ağdaki bir murine elemanı olan murine SG'yi tanımlamak ve RNA, protein ve hücresel düzeyde sonraki analizleri yapmak için temel bir yöntem repertuarı sunuyoruz.

Murine SG'nin bir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar Hartwig Wieboldt'a mükemmel teknik yardımı için ve Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi UKE Mikroskopi Görüntüleme Tesisi'ne (Umif) mikroskop ve destek sağladığı için teşekkür ediyor. Bu araştırma DZHK (Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi) [FKZ 81Z4710141] tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

Referanslar

  1. Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
  2. Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Journal of Physiology. 594 (14), 3955-3962 (2016).
  3. Meng, L., Shivkumar, K., Ajijola, O. Autonomic Regulation and Ventricular Arrhythmias. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 20 (5), (2018).
  4. Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155(2017).
  5. Al-Khatib, S. M., et al. AHA/ACC/HRS Guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), 272(2018).
  6. Yusuf, S., Wittes, J., Friedman, L. Overview of results of randomized clinical trials in heart disease: I. treatments following myocardial infarction. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 260 (14), 2088-2093 (1988).
  7. Sapp, J. L., et al. Ventricular tachycardia ablation versus escalation of antiarrhythmic drugs. New England Journal of Medicine. 375 (2), 111-121 (2016).
  8. Yasunaga, K., Nosaka, S. Cardiac sympathetic nerves in rats: Anatomical and functional features. The Japanese Journal of Physiology. 29 (6), (1979).
  9. Pardini, B. J., Lund, D. D., Schmid, P. G. Organization of the sympathetic postganglionic innervation of the rat heart. Journal of the Autonomic Nervous System. 28 (3), 193-201 (1989).
  10. Meyer, C., Scherschel, K. Ventricular tachycardia in ischemic heart disease: The sympathetic heart and its scars. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 549-551 (2017).
  11. Cao, J. M., et al. Relationship between regional cardiac hyperinnervation and ventricular arrhythmia. Circulation. 101 (16), 1960-1969 (2000).
  12. Ren, C., et al. Nerve sprouting suppresses myocardial Ito and IK1 channels and increases severity to ventricular fibrillation in rat. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 144 (1-2), 22-29 (2008).
  13. Zipes, D. P., et al. Treatment of ventricular arrhythmia by permanent atrial pacemaker and cardiac sympathectomy. Annals of Internal Medicine. 68 (3), 591-597 (1968).
  14. Kusumoto, F. M., et al. Systematic review for the 2017 AHA/ACC/HRS guideline for management of patients with ventricular arrhythmias and the prevention of sudden cardiac death. Circulation. 138 (13), (2018).
  15. Cronin, E. M., et al. 2019 HRS/EHRA/APHRS/LAHRS Expert Consensus Statement on Catheter Ablation of Ventricular Arrhythmias: Executive Summary. Heart Rhythm. , (2019).
  16. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation in patients with refractory ventricular arrhythmias or electrical storm: Intermediate and long-term follow-up. Heart Rhythm. 11 (3), 360-366 (2014).
  17. Vaseghi, M., et al. Cardiac sympathetic denervation for refractory ventricular arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 69 (25), 3070-3080 (2017).
  18. Ajijola, O. A., et al. Inflammation, oxidative stress, and glial cell activation characterize stellate ganglia from humans with electrical storm. JCI insight. 2 (18), 1-11 (2017).
  19. Rizzo, S., et al. T-cell-mediated inflammatory activity in the stellate ganglia of patients with ion-channel disease and severe ventricular arrhythmias. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 224-229 (2014).
  20. Kanazawa, H., et al. Heart failure causes cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130-signaling cytokines in rodents. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 408-421 (2010).
  21. Olivas, A., et al. Myocardial infarction causes transient cholinergic transdifferentiation of cardiac sympathetic nerves via gp130. Journal of Neuroscience. 36 (2), 479-488 (2016).
  22. Yu, L., et al. Optogenetic Modulation of Cardiac Sympathetic Nerve Activity to Prevent Ventricular Arrhythmias. Journal of the American College of Cardiology. 70 (22), 2778-2790 (2017).
  23. Jungen, C., et al. Increased arrhythmia susceptibility in type 2 diabetic mice related to dysregulation of ventricular sympathetic innervation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (6), 1328-1341 (2019).
  24. Hedger, J. H., Webber, R. H. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia in the albino rat (Mus norvegicus albinus). Acta Anatomica. 96 (2), 206-217 (1976).
  25. Furlan, A., et al. Visceral motor neuron diversity delineates a cellular basis for nipple- and pilo-erection muscle control. Nature Neuroscience. 19 (10), 1331-1340 (2016).
  26. Al Khafaji, F. A. H., Anderson, P. N., Mitchell, J., Mayor, D. The permeability of the capsule of autonomic ganglia to horseradish peroxidase. Journal of Anatomy. 137 (4), 675-682 (1983).
  27. Armour, J. A., Murphy, D. A., Yuan, B. X., Macdonald, S., Hopkins, D. A. Gross and microscopic anatomy of the human intrinsic cardiac nervous system. Anatomical Record. 247 (2), 289-298 (1997).
  28. Fedoroff, S., Richardson, A., Johnson, M. I. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. (11051), 71-94 (2003).
  29. Scherschel, K., et al. Cardiac glial cells release neurotrophic S100B upon catheter-based treatment of atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (493), 1-12 (2019).
  30. Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
  31. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
  32. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Bassil, G., et al. Pulmonary vein ganglia are remodeled in the diabetic heart. Journal of the American Heart Association. 7 (23), (2018).
  35. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2018).
  36. Bayles, R. G., et al. Transcriptomic and neurochemical analysis of the stellate ganglia in mice highlights sex differences. Scientific Reports. 8 (1), 8963(2018).
  37. Morales, M. A., et al. Localization of choline acetyltransferase in rat peripheral sympathetic neurons and its coexistence with nitric oxide synthase and neuropeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11819-11823 (1995).
  38. Jimnez, B., Mora-Valladares, E., Zetina, M. E., Morales, M. A. Occurrence, co-occurrence and topographic distribution of choline acetyl transferase, met-enkephalin and neurotensin in the stellate ganglion of the cat. Synapse. 43 (3), 163-174 (2002).
  39. Ruit, K. G., Osborne, P. A., Schmidt, R. E., Johnson, E. M., Snider, W. D. Nerve growth factor regulates sympathetic ganglion cell morphology and survival in the adult mouse. Journal of Neuroscience. 10 (7), 2412-2419 (1990).
  40. Guo, J., et al. Involvement of P2Y 12 receptor of stellate ganglion in diabetic cardiovascular autonomic neuropathy. Purinergic Signalling. 14 (4), 345-357 (2018).
  41. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  42. Hinrichs, S., et al. Precursor proadrenomedullin influences cardiomyocyte survival and local inflammation related to myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (37), 8727-8736 (2018).
  43. Westermann, D., et al. Reduced degradation of the chemokine MCP-3 by matrix metalloproteinase-2 exacerbates myocardial inflammation in experimental viral cardiomyopathy. Circulation. 124 (19), 2082-2093 (2011).
  44. Johnsen, D., Olivas, A., Lang, B., Silver, J., Habecker, B. Disrupting protein tyrosine phosphatase σ does not prevent sympathetic axonal dieback following myocardial infarction. Experimental Neurology. 276, 1-4 (2016).
  45. Manousiouthakis, E., Mendez, M., Garner, M. C., Exertier, P., Makita, T. Venous endothelin guides sympathetic innervation of the developing mouse heart. Nature Communications. 5, 3918(2014).
  46. Wink, J., et al. Human adult cardiac autonomic innervation: Controversies in anatomical knowledge and relevance for cardiac neuromodulation. Autonomic Neuroscience. 227, 102674(2020).
  47. Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry. Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).
  48. Schäfer, M. K. H., Schütz, B., Weihe, E., Eiden, L. E. Target-independent cholinergic differentiation in the rat sympathetic nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4149-4154 (1997).
  49. Chen, Y., et al. Effect of a Stellate Ganglion block on acute lung injury in septic rats. Inflammation. 41 (5), 1601-1609 (2018).
  50. Lipov, E. G., et al. Effects of stellate-ganglion block on hot flushes and night awakenings in survivors of breast cancer: a pilot study. The Lancet Oncology. 9 (6), 523-532 (2008).
  51. Mo, N., Wallis, D. I., Watson, A. Properties of putative cardiac and non-cardiac neurones in the rat stellate ganglion. Journal of the Autonomic Nervous System. 47 (1-2), 7-22 (1994).
  52. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  53. Hanani, M. Satellite glial cells in sympathetic and parasympathetic ganglia: In search of function. Brain Research Reviews. 64 (2), 304-327 (2010).
  54. Larsen, H. E., Lefkimmiatis, K., Paterson, D. J. Sympathetic neurons are a powerful driver of myocyte function in cardiovascular disease. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  55. Hasan, W., et al. Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats. Brain Research. 1124 (1), 142-154 (2006).
  56. Lorentz, C. U., et al. Heterogeneous ventricular sympathetic innervation, altered β-adrenergic receptor expression, and rhythm instability in mice lacking the p75 neurotrophin receptor. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (6), 1652-1660 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 166sempatik sinir sistemiy ld z gangliyonuintra kardiyak otonom sinir sistemiventrik l aritmisin romorfolojielektrofizyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır