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요약

심장 자율 신경계의 병리학적 변화, 특히 교감 지점에서 심실 부정맥의 발병 및 유지 보수에 기여합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 근본적인 분자 및 세포 프로세스의 이해를 향상시키기 위하여 murine stellate ganglia를 특성화하는 방법을 보여줍니다.

초록

자율 신경계는 심장 전기 생리학의 실질적인 동인입니다. 특히 그 공감 분기의 역할은 심실 부정맥 (VA)의 병리 생리학에 있는 조사의 지속적인 문제입니다. 동정 사슬의 양측 별 모양 구조인 스텔레이트 신경리아(SG)의   뉴런은   공감 인프라의 중요한 구성 요소입니다. SG는 치료 내화 VA를 가진 환자에 있는 심장 교감 기질을 통해 처리를 위한 인정된 표적입니다. SG의 신경 리모델링 및 신경교 활성화는 VA 환자에서 설명되었지만, 잠재적으로 부정맥의 발병에 앞서 있는 근본적인 세포 및 분자 과정은 충분히 이해되지 않으며 자율 변조를 개선하기 위해 해명되어야 합니다. 마우스 모델은 우리가 공감 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다, 하지만 murine SG의 식별은 경험이 없는 조사자에게 도전이다. 따라서, 뮤린 SG의 심층 세포 및 분자 생물학적 연구는 많은 일반적인 심장 질환에 대한 부족하다. 여기서, RNA 수준(유전자 발현 분석을 위한 RNA 절연, 현장에서 혼성화), 단백질 수준(면역형성 전체 마운트 염색), 및 세포 수준(기본 형태학, 세포 크기 측정)에서 분석을 위해 성인 마우스에서 SG를 해부하고 연구하기 위한 기본 레퍼토리를 설명합니다. 우리는 준비 기술의 문제를 극복하기 위한 잠재적인 해결책과 자동 불발성 담금질을 통해 염색을 개선하는 방법을 제시합니다. 이를 통해 세포 조성 및 리모델링 과정을 결정하기 위해 확립된 마커를 통해 뉴런뿐만 아니라 신경교 세포의 시각화를 가능하게 한다. 여기에 제시된 방법은 SG가 VA에 걸리기 쉬운 마우스에 있는 자율 장애에 대한 추가 정보를 얻기 위하여 허용하고 심혼에 있는 자율 신경계의 신경 및 신경교 성분을 조사하는 추가 기술에 의해 보완될 수 있습니다.

서문

심장 자율 신경계는 심장이 적절한 생리적 반응1,2로환경 변화에 적응할 수 있도록 교감, 부교감 및 감각 성분의 엄격하게 조절된 평형이다. 이러한 평형의 교란은 예를 들어, 교감 활동의 증가, 발병의 핵심 동인으로서 확립된 뿐만 아니라 심실 부정맥(VA)3,4의유지보수로 확립되었다. 따라서, 베타 차단제와의 교감 활동의 약리학적 감소를 통해 달성된 자율 변조는 수십 년 동안 VA를 가진 환자의 치료에 초석이 되어왔다5,6. 그러나 약리학 및 카테터 기반 내정간섭에도 불구하고, 환자의 관련 수는 아직도 재발성 VA7때문에 손해를 입습니다.

심장에 대한 공감 입력은 주로 스텔레이트 신경리아(SG)의 신경 세포 체를 통해 중재되며, 교감 사슬의 양자 별 모양 구조는 뇌간에서 심장8,9,10까지수많은 내트라토라시크 신경을 통해 정보를 전달한다. 부상 후 SG로부터 발아하는 신경은 VA및 갑작스런심장사멸(11,12)과관련이 있으며, SG를 자율변조의 대상으로강조한다(13,14). 심장에 대한 공감 입력의 감소는 비디오 보조 흉부검사(15,16)를통해 SG를 부분적으로 제거함으로써 국소 마취제의 경피 주입또는 영구적으로 영구적으로 얻을 수 있다. 심장 동정 성 서성 검사는 유망한 결과 와 치료 불응성 VA 환자에 대한 옵션을 제공합니다14,16,17. 우리는 신경 및 신경 화학적 리모델링, 신경 염증 및 신경교 활성화가 자율 기능 장애18,19에기여하거나 악화 시킬 수있는 공감 리모델링의 특징이라는 이러한 환자의 이식 SG에서 배웠습니다. 여전히, 이러한 뉴런의 기본 세포 및 분자 과정은 현재까지 모호하게 남아, 예를 들어, 해저 현상형으로 뉴런 전이의 역할20,21. 실험 연구는 VA를 치료하는 새로운 접근 방식을 제시, 예를 들어, 광유전학을 통해 교감 신경 활동의 감소(22)하지만 SG의 심층 특성은 여전히 VA와 함께 가는 많은 심장 병리학에서 부족. 이러한 병리를 모방 마우스 모델은 잠재적으로 부정맥의 발병 앞에 신경 리모델링을 연구 할 수 있습니다12,23. 이들은 심혼과 신경계의 자율 특성화를 위한 추가 형태학 및 기능적인 분석에 의해 완료될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 우리는 VA의 이해를 향상시키기 위해 뮤린 SG를 해부하고 특성화 할 수있는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 함부르크 주의 동물 관리 및 사용위원회 (ORG870, 959)와 자연, 환경 및 소비자 보호를위한 노스 라인 - 웨스트 팔리안 국가 기관 (LANUV, 07/11)에 의해 승인되었으며 국립 보건 원 (2011)에 준수합니다. 연구 결과는 당뇨병 자발적인 돌연변이를 위한 남성과 여성 (10-24주) C57BL/6 마우스(주식 번호 000664, 잭슨 연구소) 및 마우스 호모지구우스(db/db) 또는 이종화구우스(db/het; 대조군)를 사용하여수행하였다. BKS. Cg-Dock7m+/+ Leprdb /J, 주식 번호 000642, 잭슨 연구소). 저자는 60 주까지 나이 든 마우스를 위한 변이 없이 손에 프로토콜을 이용했습니다.

1. 뮤린 스텔레이트 간리아의 위치 및 해부

참고: 설명과 도면이 대부분 더 큰 종에서 사용할 수 있더라도, 몇몇 간행물은 이전에 해부학 적인 방법 및 형광 기자 라인을 사용하여 쥐24 및 마우스25에 있는 SG의 위치를 기술했습니다, 각각.

  1. 50mL의 얼음-감기(3-4°C)를 준비(20단위/mL, 재료표참조) 인산완충식식(PBS). 실온(RT)에서 SG의 해부를 수행합니다.
  2. 기관 및 지역 지침에 따라 3%-5%의 이소플루란을 흡입하여 마우스를 심층 마취합니다. 페달 철수 반사의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 쥐를 참수하거나 자궁 경부 탈구를 수행합니다.
    참고: 잘못된 자궁 경부 탈구는 척추의 파손과 흉부 혈관의 손상으로 인해 교감 사슬의 준비 또는 단절을 방해하는 출혈로 이어질 수 있으므로 SG가 올바른 위치에 있지 않습니다. 따라서, 경험이 풍부한 인력이 자궁 경부 탈구를 수행하거나 깊은 퇴적에 동물을 참수하는 것이 중요합니다.
  3. 에탄올로 피부를 살포하고 마요 가위와 좁은 패턴 집게를 사용하여 전방 보조 선을 따라 두 개의 절개로 흉부를 엽니다. 다이어프램을 자르고 흉곽의 전면을 제거합니다.
  4. 런던 집게를 사용하여 대오르막과 베나 카바를 다이어프램 바로 위에 쥐고 모든 혈관과 스트라비스무스 가위와 함께 아래 척추에 가까운 결합 조직을 절단하여 심장 폐 패키지를 제거하십시오.
  5. 모든 혈액 흔적이 제거될 때까지 플라스틱 일회용 파이펫을 사용하여 분리된 PBS로 흉부를 철저히 세척합니다.
  6. 몸통을 스테레오현미경 준비 쌍안경 아래에 놓고 외부 광원으로 흉부에 좋은 조명을 유지합니다.
  7. 첫 번째 갈비뼈와 긴 콜리 근육을 찾습니다.
    참고: SG는 첫 번째 갈비뼈와 척추 사이의 가지의 척추와 평행하게, 롱러스 콜리근육(24)에대한 홈 측면으로 위치한다. SG의 평평한 면은 긴 콜리 근육에 인접해 있습니다. 준비에 따라, 공감 체인의 일부는 이미 척추에 평행 흰색, 경사 섬유로 볼 수 있습니다. SG를 따라 추적할 수 있습니다.
  8. Dumont #5/45 집게의 끝을 부드럽게 사용하여 결합 조직 측면을 긴 콜리 근육에 노출시십시오.
  9. 집게를 180° 돌면 평평한 면을 사용하여 SG를 잡고 최소한의 압력으로 꺼냅니다.
  10. 두 번째 SG로 반복합니다.
  11. 차가운 PBS로 채워진 접시 (직경 6cm)에 두 SG를 놓고 적절한 배율로 검사하십시오. 필요한 경우, 과잉 혈관을 제거, 지방 조직, 그리고 더 큰 신경.
    참고: 자율 신경질은 콜라겐 섬유와 섬유아세포26,27로구성된 결합 조직 캡슐에 둘러싸여 있습니다. 이 캡슐의 투과성은 종,26 및28세의 다른 종류마다 다른 것으로 보입니다. Dumont #5/45 집게를 사용하여 가능한 한 많은 결합 조직을 제거하고 필요한 경우 스프링 가위를 제거하십시오.
  12. 실험의 목표에 따라 이 프로토콜의 섹션 2, 3 또는 5를 진행합니다.

2. 전체 마운트 면역 작용 화학 프로토콜

참고 :이 프로토콜은 심장 전체 마운트 염색4,29에서조정됩니다. 모든 단일 SG에 대한 배큐베이션 단계를 96웰 플레이트의 한 웰에서 수행하고 100 μL(항체 함유 용용용)에서 200 μL(다른 모든 솔루션의 경우)을 사용하여 완전한 커버리지를 보장합니다. 쌍안경으로 SG의 적용 범위를 정기적으로 확인하고 정확한 침수를 확인하십시오. 200 μL 팁 위에 10 μL 팁이 추가된 200 μL 파이펫으로 액체를 수동으로 제거합니다. 이렇게 하면 파이펫 팁에서 SG의 포부를 방지할 수 있습니다. 갓 준비된 솔루션과 멸균 액체를 사용하여 세균 성장을 방지하십시오.

  1. 4% 메탄올 프리 파라포름데히드(PFA)/PBS에서 RT에서 2시간 동안 히스토로지에 대한 SG를 수정합니다.
  2. 가능한 한 빨리 SG를 처리하지만, 이 시점에서 0.02 %(w /v) 나트륨 아지드와 PBS에서 4-6 °C에서 2-4 주 동안 저장할 수 있습니다.
  3. 자율불광 감소 및 신호 대비 배경 비율30개선을 위한 수단 블랙 스톡 솔루션(1% 수단 블랙 w/v 100% 에탄올)을 준비한다. RT의 자기 교반기에서 2-3 시간 동안 녹입니다.
    참고: 스톡 솔루션을 최대 6-8주 동안 사용하고 퇴적이 나타나면 일찍 폐기하십시오.
  4. 수단 블랙 작업 솔루션을 최고 속도(13,000 x g)로30분 간 원심분리하여 이물질을 제거하고 70% 에탄올로 재고를 희석하여 수단 블랙의 최종 농도0.25%를 준비합니다.
  5. 항체투과성(31)을개선하기 위해 덴트의 표백제로 SG를 치료한다. 4:1:1의 비율로 H2O및 디메틸 설산화물(DMSO)에 메탄올(MeOH), 과산화수소 용액 30%(w/w)를 혼합하여 덴트의 표백제를 신선하게 준비합니다. SG당 200 μL을 추가하고 RT에서 1시간 동안 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.
  6. 궤도 셰이커에서 각각 10분 동안 배양하여 재수화를 위한 내림차순 MeOH 시리즈를 수행합니다: 100% MeOH, 75% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS, 25% MeOH/PBS.
  7. RT에서 PBS/1% Triton-X-100에서 각각 60분 동안 SG를 두 번 배양하여 투과성화를 수행합니다.
  8. SG에서 투과화 솔루션을 제거하고 수단 블랙 작업 솔루션을 추가합니다. 궤도 셰이커에 RT에서 2 시간 동안 배양.
  9. 한편, PBS에서 5% 수용체 급 소 세럼 알부민(BSA)과 0.1% 트리톤-X-100을 PBS에 첨가하여 블로킹 용액을 준비하고 약 5-10분 동안 롤러 셰이커에 용해하게 한다. 이물질을 제거하기 위해 미리 플리츠 된 종이 필터를 통해 decant.
  10. 플레이트를 기울이고 조심스럽게 수직면에서 파이프를 통해 수단 블랙을 매우 신중하게 제거하십시오.
    참고 : 수단 블랙의 SG를 볼 수 없습니다. 강한 광원을 사용하고 천천히 작동합니다. 이 단계에서 SG는 검은색으로 염색되어 가시성을 향상시킵니다. 이 시점에서 SG 를 둘러싼 추가 결합 조직이 보이는 경우, Dumont #5/45 포셉및 스프링 가위를 사용하여 제거하십시오.
  11. PBS/0.1% 트리톤-X-100(PBS-T)의 200 μL을 추가하고 궤도 셰이커에서 RT에서 5분 간 세척합니다.
  12. 파이펫으로 흡입하여 PBS-T를 제거하고 2 번 반복하십시오.
  13. PBS 제거; 블로킹 용액200μL을 추가하고 궤도 셰이커에서 하룻밤 사이에 4°C에서 배양합니다.
  14. 다음 날 차단 용액에 1 차 항체를 추가하여 용액을 준비하십시오. 확립된 프로토콜에서 항체 농도를 조정합니다.
    참고: 1차 항체 가 없는 항체 제어로 SG 1개를 포함합니다(항원 전흡수 항체 또는 IgG로 배양, 사용 가능한 경우 또는 버퍼 차단).
  15. 궤도 셰이커에서 4°C에서 36-48h의 1차 항체 배양을 수행한다. 세포 크기 측정 및 공감 뉴런의 염색에 대 한 티로신 하이드록실라제에 대 한 항체를 사용 하 여 (항체 권장 사항에 대 한 재료의 표 참조).
    참고: 96웰 플레이트를 젖은 챔버(예: ddH2O-젖은 종이 타월로 늘어선 플라스틱 상자)에 놓아 이 시점에서 증발을 방지합니다.
  16. 항체 용액을 신중하게 제거하고 PBS-T의 200 μL을 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 30분 간 놓습니다.
  17. PBS-T를 제거하고 세척 단계를 5회 추가로 반복합니다.
  18. 사용 전에 전속력(13,000 x g)에서1분 동안 형광 알렉사 표지이 부착된 이차 항체를 원심분리하여 이차 항체 작동 용액을 준비한다. 1차 항체에 따라 적절한 이차 항체를 희석하여 차단용액에 1:500을 넣고 SG에 추가합니다. 궤도 셰이커에 4 °C에서 12-24 h에 대한 배양.
  19. 항체 용액을 신중하게 제거하고 PBS-T의 200 μL을 추가합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 30분 간 놓습니다.
  20. PBS-T를 제거하고 세척 단계를 5회 추가로 반복합니다. 마지막 단계는 트리톤없이 PBS를 사용합니다.
  21. 포함의 경우, 유리 슬라이드에 형광 장착 매체 (재료 표 참조)의50-100 μL을 확산하고 준비 쌍안경 아래에 배치합니다. Dumont #5/45 집게를 사용하여 96웰 플레이트에서 SG를 선택하고 필터 용지(예: Whatman 건조 패드)에 한쪽 끝을 찍어 여분의 액체를 제거하여 드롭에 놓습니다.
  22. Dumont #5/45 포셉을 사용하여 적절한 배율로 위치를 수정합니다.
  23. SG 옆에 유리 커버슬립(20mm x 20mm)을 부드럽게 놓고 천천히 내려갑니다.
    참고: 장착 매체를 너무 많이 사용하면 SG의 움직임이 나 신경이 엉킴합니다. 이 경우 커버슬립을 신속하게 제거하고 2.9-2.21 단계를 반복합니다.
  24. RT에서 밤새 어둠 속에서 슬라이드를 건조하게 하십시오. 스테인드 시편의 저장은 4 °C에서 적어도 4-6 주 동안 가능하다.

3. 시투 혼성화의 전체 마운트

참고: SG의 시상 혼성화에서 전산은코티(32)의 오르간과 시투 프로토콜의 상용 RNA 형광으로부터 적응된다(재료표참조). 공급업체로부터 관심 및 완충제 및 솔루션 유전자에 대한 프로브를 가져옵니다. 모든 잠복기 단계는 달리 언급되지 않은 경우 RT에서 수행됩니다. 멸균 PBS를 사용합니다. 여러 SG를 하나의 우물에 염색하는 데 관심이 있으시면 최소 150μL의 버퍼와 솔루션을 사용하십시오.

  1. 1.1-1.13 단계에 설명된 대로 SG의 해부를 수행한다.
  2. 궤도 셰이커에 놓인 96웰 플레이트의 한 웰에 4% MeOH 가 없는 PFA/PBS의 200 μL에서 1h에 SG를 고정합니다.
  3. 궤도 셰이커에서 0.1% Tween-20/PBS로 30분 동안 SG를 세 번 세척합니다.
  4. MeOH/PBS 시리즈에서 50% MeOH/PBS, 70% MeOH/PBS, 궤도 셰이커에서 각각 10분 동안 100% MeOH를 배양하여 SG를 탈수합니다.
  5. 하룻밤 사이에 -20 °C에 SG를 저장하십시오.
  6. 다음 날 인큐베이터를 40°C로 미리 데워보시고 있습니다. 온도계로 온도를 확인합니다.
  7. 역MeOH/PBS 시리즈(100% MeOH, 70% MeOH/PBS, 50% MeOH/PBS)로 SG를 10분 간 재수화합니다.
  8. PBS에서 각각 5 분 동안 SG를 세 번 씻으시면 됩니다.
  9. 그 동안, 10 분 동안 40 °C에서 배양하여 프로브를 미리 따뜻하게 시작하고 10 분 동안 냉각하십시오.
  10. 프로테제III 200μL에서 SG를 15분 동안 배양합니다.
  11. 선택 사항: 후속 면역 형광 얼룩이 계획된 경우 이 프로토콜의 섹션 2.3, 2.4 및 2.8항에 따라 자가 형광을 담금질하기 위해 수단 블랙 트리트먼트를 수행합니다.
  12. 200 μL에서 0.1% Tween-20/PBS 3x에서 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 SG를 세척합니다.
  13. 선택 사항: 여러 프로브와 공동 염색이 필요한 경우 채널-1 프로브(1x)에서 Channel-2(50x) 및 채널-3 프로브(50x)를 희석시하십시오.
  14. 관심 유전자에 대한 프로브의 100 μL로 SG를 커버하고 약간의 동요와 함께 40 °C에서 하룻밤 배양. 모든 인큐베이션 단계에 대해 젖은 챔버에 96웰 플레이트를 40°C로 놓습니다.
    참고: 세균 유전자에 대한 프로브(예를 들어, 디하이드로 디피콜리나테 환원효소, Dapb)에대한 프로브를 사용하여 나중에 증폭 시약의 비특이적 결합을 검사하는 부정적인 대조군으로 SG 1개를 포함시한다.
  15. 공급된 세척 버퍼에서 SG를 궤도 셰이커에서 각각 15분 동안 3배 세척합니다.
  16. RT에 미리 웜 Amp1-3, HRP-C1 및 HRP 차단기. 채널-2 및/또는 채널-2 프로브와 공동 염색이 필요한 경우 사전 웜 HRP-C2 및 HRP-C3.
  17. 궤도 셰이커에서 4% PFA/PBS에서 RT에서 10분 동안 SG를 다시 수정합니다.
  18. RT의 궤도 셰이커에서 각각 5분 동안 3배씩 공급된 세척 버퍼의 200μL에서 SG를 세척합니다.
  19. 증폭을 위해, 궤도 셰이커에 40 °C에서 35 분 동안 Amp1의 100 μLSG를 인큐베이션.
  20. 액체를 조심스럽게 제거하고 200 μL의 공급 된 세척 버퍼 3x에서 궤도 셰이커에서 RT에서 각각 3 배세척합니다.
  21. 궤도 셰이커에서 40°C에서 35분 동안 Amp2의 100 μL을 가진 SG를 배양합니다.
  22. 3.18 단계를 반복합니다.
  23. 궤도 셰이커에서 40°C에서 20분 동안 Amp3의 100 μL을 가진 SG를 배양합니다.
  24. 3.18 단계를 반복합니다.
  25. 100 μL의 공급 멀티플렉스 FL v2 HRP-C1의 인큐베이션 SG는 궤도 셰이커에서 40°C에서 20분 동안 공급된다.
  26. 3.18 단계를 반복합니다.
  27. 오팔-컨쥬게이드 이차 항체 1:1,000을 200μL에 공급된 TSA 버퍼로 준비하고 궤도 셰이커에서 40°C에서 35분 동안 SG를 배양한다. 인큐베이션 중및 이 단계에서 빛으로부터 보호하십시오.
  28. 3.18 단계를 반복합니다.
  29. 100 μL의 인큐베이트 SG는 궤도 셰이커에서 40°C에서 15분 동안 공급된 멀티플렉스 FL v2 HRP 차단제의 100μL에 공급된다.
  30. 3.18 단계를 반복합니다.
  31. 선택 사항: 채널-2 프로브와 공동 염색하기 위해 제공된 멀티플렉스 FL v2 HRP-C2와 함께 3.25-3.30 단계를 반복합니다.
  32. 선택 사항: 채널-3 프로브와 공동 염색하기 위해 제공된 멀티플렉스 FL v2 HRP-C3와 함께 3.25-3.30 단계를 반복합니다.
  33. 후속 면역 형광 염색의 경우,이 프로토콜의 단계 2.13-2.25을 수행합니다.
  34. 궤도 셰이커에서 30분 동안 1% BSA/PBS에서 배양합니다.
  35. 인큐베이션 SG는 비스벤지미드 H33342 트리하이드로염화물1μg/mL에서 30분 동안 1% BSA/PBS에서 핵 염색이 원하고/또는 알렉사 커플밀 세균 아글루틴(WGA, 1:500)을 추가한다.
  36. 3.18 단계를 반복합니다.
  37. 2.19-2.22 단계에 설명된 대로 포함.

4. 뮤린 스텔레이트 신경리아의 이미징 및 분석

  1. 지역 이미징 시설에서 임베디드 SG의 공초점 현미경 검사를 수행합니다.
  2. 셀 크기 측정이 필요한 경우, 이미지 SG는 티로신 하이드록실라제(재료 표참조)를 200배율로 염색하고 모든 SG에서 4-6개의 무작위 이미지를 취합니다.
  3. ImageJ33 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하여 셀 크기를 추정합니다(예: 펜 테이블이 있는 경우 재료 표참조). 무료 손 선택을사용 하 여 각 셀을 원하 고 분석 | 세포 영역을 얻기 위해 측정합니다. SG 내에 잘 위치한 그대로 완전히 보이는 셀만 포함하십시오.
  4. 이 방법을 사용하여 SG당 약 100개의 셀을 측정합니다.
  5. 다른 마우스에서 SG를 비교하려는 경우 맹목적인 조사자가 4.2-4.3 단계를 수행하도록 하십시오. 통계 소프트웨어에서 주파수 분포를 사용하여 그룹34간의 크기 차이를 시각화합니다.

5. 뮤린 스텔레이트 간리아의 분자 분석

참고: 실험 설계에 따라 컨트롤을 포함합니다. 이것은 상이한 유전형 및 질병 배경 및/또는 교감 우수한 자궁 경부 신경절과 같은 다른 자율 적 신경교를 가진 SG일 수 있었습니다 (목 부위에 위치, Ziegler 외35에서상세한 설명을 참조) 또는 부교감 신경리아 (예: 심장 내 신경리아, Jungen etal.4참조).

  1. 동물당 500 μL의 페놀/구니딘 티오야네이트 용액(예를 들어, Qiazol)을 갖춘 2mL 튜브를 준비하고 충격-프로스팅을 위한 액체 질소를 준비하거나 RNA 보호를 위한 상업적 용액을 고려한다(선택 사항, 재료표참조)36. RNA 격리를 위해 신속하게 작동합니다.
  2. 1.1-1.13 단계에 설명된 대로 SG의 해부를 수행한다.
  3. 페놀/구니딘 티오시야네이트 용액과 충격-서리 튜브를 액체 질소에 즉시 한 튜브에 직접 담급다.
  4. 추가 처리될 때까지 -80°C에 보관하십시오.
  5. 조직 용해의 경우, 페놀 /구니딘 티오세네이트 용액이 액화 될 때까지 SG 해동튜브를 하고 두 개의 7mm 스테인레스 스틸 구슬을 추가하십시오. 4°C에서 드라이 아이스와 원심분리기에 조직 균질화제(예: 티슈 리서 II)의 금속 부분을 식히십시오.
  6. 심분리기 튜브는 500 x g에서 4 °C에서 1 분 동안 1 분 동안 SG가 튜브의 바닥에 있도록합니다.
  7. 튜브를 티슈 리서의 금속 부분에 넣고 20Hz에서 1분 동안 용해하십시오.
  8. 손상되지 않은 조직이 검출될 때까지 5.6 및 5.7 단계를 최대 5배까지 반복합니다.
  9. 액체를 신선한 1.5mL 튜브로 옮기십시오.
  10. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA 절연 키트(예: miRNeasy mini kit)로 RNA 절연을 수행합니다.
  11. RNase가 없는 물의 20 μL에서 엘ute RNA와 분광광계를 사용하여 농도를 측정합니다.
    참고: 게놈 DNA를 가진 정제된 RNA의 오염을 제외하기 위하여는, 우리는 유전체 프라이머를 가진 폴리머라제 연쇄 반응 및 1μL의 RNA를 템플릿으로, 대신 역 전사 대조를 빼고 제안합니다. 이것은 상당한 양의 RNA를 절약 할 것입니다. RNA가 오염되면, 후속 정량 적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응에 대한 엑손 인트론 경계 프라이머 또는 인트론 측면 프라이머를 사용합니다.
  12. 250 ng SG RNA를 사용하여 cDNA 합성을 수행하고 확립된 프로토콜을 사용합니다. 여기서, 대용량 cDNA 역전사 키트는 제조업체의 지시에 따라 사용되었다.
  13. cDNA의 2.5 ng/μL의 최종 농도로 희석하고 확립된 프로토콜에 따라 적절한 프로브를 사용하여 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다. 여기서, TaqMan 분석(재료의 표참조) 반응당 10 ng cDNA를 사용하여 수행하였다.
    참고: 모든 유전자에 대해 잘못된 양성 결과를 제외하기 위한 템플릿 없음 제어를 수행합니다.
  14. SG의 다른 그룹 간의 상대적인 유전자 발현을 비교하기 위해 집 유지 유전자(예를 들어, Cdkn1b)에대한 관심 유전자의 유전자 발현을 정규화합니다.

결과

도 1은 SG를 식별하고 해부하는 방법을 시각화합니다. 도 1A는 위치의 회로도 도면을 나타내고, 도 1B는 심장 폐 패키지를 제거한 후 흉부로 뷰를 제시한다. SG와 늑골 케이지의 왼쪽 및 오른쪽 긴 콜리 근육은 방향에 중요한 랜드마크입니다. 해부는 근육과 첫 번째 갈비뼈 사이의 점선을 따라 수행됩니다. SG와 공감 체인은 흰색

토론

VA의 개시에 선행된 교감 신경계의 신경세포 및 분자 프로세스에 있는 세포 및 분자 프로세스의 이해는, 급격한 심장 정지가 전 세계적으로 죽음의 일반적인 원인 남아 있기 때문에, 높은 관심사입니다5. 따라서, 현재 원고에서, 우리는 뮤린 SG를 식별하는 방법의 기본 레퍼토리를 제공합니다 - 이 네트워크 내의 뮤린 원소 - RNA에 후속 분석을 수행, 단백질, 및 세포 수준.

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 그의 우수한 기술 지원에 대한 하트 위비히 Wieboldt 감사하고 싶습니다, 그리고 현미경및 지원을 제공하는 대학 의료 센터 함부르크 - Eppendorf의 UKE 현미경 이미징 시설 (Umif). 이 연구는 DZHK에 의해 투자되었다 (심장 혈관 연구를위한 독일 센터) [FKZ 81Z4710141].

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

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