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要約

心臓自律神経系、特に交感神経の神経系における病態生理学的変化は、心室性不整脈の発症および維持に寄与する。本プロトコルでは、マウスの星状神経節を特徴付け、基礎となる分子および細胞プロセスの理解を深める方法を示す。

要約

自律神経系は心臓電気生理学の実質的な原動力である。特にその交感神経枝の役割は、心室性不整脈(VA)の病態生理学における継続的な調査の問題である。星状神経節(SG)のニューロン   は、交感神経鎖の両側の星形構造であり   、交感神経系の重要な要素です。SGは、治療難治性VA患者における心交感神経変性による治療のための認識された標的である。SGにおける神経細胞リモデリングおよびグリア活性化はVA患者に記載されているが、不整脈の発症に先立つ可能性のある基礎となる細胞および分子プロセスは十分に理解されておらず、自律神経変調を改善するために解明されるべきである。マウスモデルは交感神経リモデリングを研究することができますが、マウスSGの同定は経験の浅い研究者にとって困難です。したがって、マウスSGの詳細な細胞および分子生物学的研究は、多くの一般的な心疾患に欠けている。ここでは、RNAレベル(遺伝子発現解析のためのRNA単離、その際のハイブリダイゼーション)、タンパク質レベル(免疫蛍光全体実装染色)、および細胞レベル(基本的形態、細胞サイズ測定)での分析のために成体マウスのSGを解剖および研究するための基本的なレパートリーについて説明します。調製技術の課題を克服するための潜在的な解決策と、自己蛍光の消光による染色の改善方法を提示します。これにより、細胞組成およびリモデリングプロセスを決定するために、確立されたマーカーを介して神経細胞とグリア細胞を可視化することができます。ここで示す方法は、VAになりやすいマウスの自律神経機能不全に関するさらなる情報を得るためにSGを特徴付けることを可能にし、心臓の自律神経系の神経およびグリア成分を調査する追加の技術によって補完することができる。

概要

心臓自律神経系は、交感神経、副交感神経、感覚成分の緊密に調整された平衡であり、心臓が適切な生理学的応答を有する環境変化に適応することを可能にする1,2。この平衡における障害は、例えば、交感神経活動の増加、心室性不整脈(VA)3、4の維持と同様に発症の重要な促進要因として確立されている。従って、自律的変調は、β遮断薬による交感神経活性の薬理学的減少を通じて達成され、数十年5、6年のVA患者の治療の基礎となっている。しかし、薬理学的およびカテーテルベースの介入にもかかわらず、関連する数の患者はまだ再発VA7に苦しんでいる。

心臓への交感神経入力は、主に星状神経節(SG)の神経細胞体を介して媒介され、交感神経鎖の両側の星形構造は、脳幹から心臓8、9、10に多数の胸腔内神経を介して情報を中継する。傷害後にSGから発芽した神経はVAと突然心死11、12に関連し、自律変調13、14の標的としてSGを強調する。心臓への交感神経入力の減少は、局所麻酔薬の経皮的注入を介して一時的に、またはビデオ支援胸腔鏡15、16を介してSGの部分的除去によって永久に達成することができる。心臓交感神経脱用は、有望な結果を有する治療難治性VA患者のためのオプションを提示する14,16,17.我々は、神経および神経化学的リモデリング、神経炎症およびグリア活性化が自律神経機能障害18、18を寄与または悪化させる可能性のある交感神経リモデリングの特徴であることを、これらの患者の植え付けられたSGから学んだ。それでも、これらのニューロンにおける基礎となる細胞および分子プロセスは、現在まで不明瞭なままであり、例えば、コリン作動性表現型20,21へのニューロントランス分化の役割。実験研究は、VAを治療するための新しいアプローチを提示し、例えば、光遺伝学22を介した交感神経活性の減少であるが、SGの詳細な特徴付けは、VAと手をつないで行く多くの心臓病理に依然として欠けている。これらの病理を模倣するマウスモデルは、潜在的に不整脈12、23の発症に先行する神経リモデリングを研究することを可能にする。これらは、心臓および神経系の自律神経特性解析のための更なる形態学的および機能的分析によって完了することができる。本プロトコルでは、VAの理解を深めるためにマウスSGを解剖し特徴付けできる方法の基本的なレパートリーを提供する。

プロトコル

動物に関するすべての手順は、ハンブルク州動物管理使用委員会(ORG870、959)およびノルトライン・ヴェストファーレン州自然環境消費者保護庁(LANUV、07/11)によって承認され、国立衛生研究所の動物のケアと使用ガイド(2011)に準拠しました。研究は、糖尿病自発的突然変異(Lepr db;;)の男性と女性(10-24週齢)C57BL/6マウス(ストック数000664、ジャクソン研究所)およびマウスホモ接合体(db/db)またはヘテロ接合(db/het;コントロール)を用いて行われた。BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb /J、ストック番号000642、ジャクソン研究所)。著者らは、60週まで齢のマウスにバリエーションを持たないプロトコルを手元で使用してきた。

1. ネズミ星状神経節の位置と解剖

注:記述と図面は、主に大きな種で利用可能であるにもかかわらず、いくつかの出版物は、それぞれ解剖学的方法と蛍光レポーターラインを使用して、ラット24 とマウス25 のSGの位置を以前に説明しました。

  1. 50 mL の氷冷(3-4 °C)ヘパリン化(20単位/mL、 材料表を参照)を準備します。室温(RT)でSGの解剖を行う。
  2. 機関および地域のガイドラインに従って3%-5%のイオブルランを吸入することによってマウスを深く麻酔する。ペダル離脱反射の損失により、適切な麻酔を確認します。マウスの首を切るか、子宮頸部脱臼を行う。
    注意:誤った頸部脱臼は、脊椎の破損および胸部血管の損傷を引き起こし、交感神経鎖の調製または切断を妨げる出血につながるため、SGが正しい位置に置かれていない。したがって、経験豊富な人員が子宮頸部脱臼を行ったり、深い堆積物で動物を切断することが重要です。
  3. 皮膚にエタノールをスプレーし、マヨハサミと狭いパターン鉗子を使用して前軸線に沿って2つの切開で胸郭を開きます。ダイヤフラムを切り、胸部の前面を取り外します。
  4. ロンドンの鉗子を使用して横隔膜のすぐ上に大大静脈と大静脈をつかんで、ストラビスムスハサミで下の背骨に近いすべての血管と結合組織を切断することによって、心臓肺パッケージを取り除きます。
  5. 血液のすべての痕跡が取り除かれるまで、プラスチック製の使い捨てピペットを使用してヘパリン化されたPBSで胸郭を徹底的に洗い流します。
  6. 胴体を実体顕微鏡下で準備双眼鏡の下に置き、外部光源で胸郭に良好な照明を確保します。
  7. 最初の肋骨と長いコリの筋肉を見つけます。
    注:SGは、第1肋骨と脊椎の間の分岐部の脊椎に対して、長い背筋24に横に溝に両側に両側に配置される。SGの平らな側面は、長いコリの筋肉に隣接して配置されています。準備によっては、交感神経鎖の一部は、脊椎に平行な白い斜めの繊維としてすでに見える場合があります。これらはSGに沿ってトレースすることができます。
  8. デュモン#5/45鉗子の先端をそっと使用して、結合組織を長いコリ筋に横に露出させる。
  9. 鉗子を180°回し、平らな側面を使用してSGをつかみ、最小限の圧力でそれを引き出します。
  10. 2 番目の SG で繰り返します。
  11. 冷たいPBSで満たされた皿(直径6cm)に両方のSGを入れ、適切な倍率で検査します。必要に応じて、余分な血管、脂肪組織、および大きな神経を除去します。
    注:自律神経節は、コラーゲン繊維と線維芽細胞26、27からなる結合組織カプセルに囲まれています。これらのカプセルの透過性は、種によって異なるようです, 異なる種類の神経節26と年齢28.デュモン#5/45鉗子を使用してできるだけ多くの結合組織を取り除き、必要に応じてスプリングハサミを取り除きます。
  12. 実験の目的に応じて、このプロトコルのセクション 2、3、または 5 に進みます。

2. 全体マウント免疫検査プロトコル

注:このプロトコルは、心臓全体のマウント染色4、29から適応されています。96ウェルプレートの1つのウェル内のすべての単一のSGに対してインキュベーションステップを実行し、100 μL(抗体含有溶液用)~200 μL(他のすべてのソリューション)を使用して、完全なカバレッジを確保します。定期的に双眼鏡でSGのカバレッジと正しい浸漬を確認してください。200 μL チップの上に 10 μL のチップを追加して、200 μL ピペットを使用して手動で液体を取り除きます。これはピペット先端のSGの吸引を防ぐ。細菌の増殖を防ぐために、新しく調製した溶液と滅菌液を使用してください。

  1. 4%メタノールフリーパラホルムアルデヒド(PFA)/PBSでRTで2時間のSGを修正します。
  2. SGはできるだけ早く処理しますが、この時点で0.02%(w/v)のアジドナトリウムでPBSの4〜6°Cで2〜4週間保存することができます。
  3. 自家蛍光の低減と背景比30の信号の改善のためのスーダンブラックストック溶液(1%スーダンブラックw/v100%エタノール中の1/v)を準備する。RTで磁気攪拌機で2〜3時間溶解します。
    注:最大6〜8週間のストックソリューションを使用し、堆積物が現れたときに破棄してください。
  4. 残骸を取り除き、70%のエタノールでストックを0.25%スーダンブラックの最終濃度に希釈するために、フルスピード(13,000 x g)で30分間ストック溶液を遠心してスーダンの黒作業溶液を調製します。
  5. SGをデントの漂白剤で治療し、抗体透過性31を改善する。メタノール(MeOH)、過酸化水素溶液30%(w/w)をH2Oで、ジメチルスルホキシド(DMSO)を4:1:1の割合で混合して、デントの漂白剤を作り上げます。SGあたり200μLを加え、RTで1時間軌道シェーカーにプレートを置きます。
  6. 軌道シェーカー上でそれぞれ10分間インキュベートして水分補給用の降順MeOHシリーズを実行します:100%MeOH、75%MeOH/PBS、50%MeOH/PBS、25%MeOH/ PBS。
  7. SGをそれぞれ60分間2回インキュベートして、RTでPBS/1%トリトンX-100でパーメバライゼーションを行います。
  8. SGからパーメアビライズ溶液を除去し、スーダンの黒作業ソリューションを追加します。軌道シェーカーのRTで2時間インキュベートする。
  9. その間、PBSに5%の受容体グレードのウシ血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100を15mLの容器に加えてブロッキング溶液を調製し、ローラーシェーカーに約5〜10分間溶解させます。デスキャンは、破片を除去するために、プレプリーツ紙のフィルターを通して。
  10. プレートを傾け、慎重に直立側からピペットリングすることにより、非常に慎重にスーダンブラックを除去します。
    注:スーダンブラックのSGを見ることは不可能です。強い光源を使用し、ゆっくりと動作します。このステップから、SGは黒く染まって視認性を高める。この時点でSGを取り囲む追加の結合組織が見られる場合は、Dumont #5/45鉗子とスプリングハサミを使用して取り外します。
  11. PBS/0.1% Triton-X-100 (PBS-T) を 200 μL 加え、軌道シェーカーの RT で 5 分間洗浄します。
  12. ピペットでPBS-Tを吸引して取り出し、2回繰り返します。
  13. PBS を削除します。200 μLのブロッキング溶液を加え、軌道シェーカーで一晩4°Cでインキュベートします。
  14. 翌日、ブロッキング溶液に一次抗体を添加して溶液を調製する。確立されたプロトコルから抗体濃度を適応させます。
    注:一次抗体のない抗体コントロールとして1つのSGを含める(抗原事前吸収抗体またはIgG、可能な場合、またはブロッキングバッファーでインキュベート)。
  15. 軌道シェーカー上で4°Cで36-48時間の一次抗体インキュベーションを行います。交感神経の細胞サイズ測定と染色については、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を使用してください(抗体 推奨については、材料表 を参照)。
    注:96ウェルプレートを湿ったチャンバー(例えば、ddH2O-wetted ペーパータオルが並ぶプラスチック製の箱)に置き、この時点で蒸発を防ぎます。
  16. 抗体溶液を慎重に除去し、200 μLのPBS-Tを添加します。プレートを軌道シェーカーの上に30分間置きます。
  17. PBS-Tを取り除き、洗浄工程を5回繰り返す。
  18. 使用前に蛍光Alexa標識二次抗体を1分間全速力(13,000 x g)で遠心分離して二次抗体の働き溶液を調製します。一次抗体1:500に従って適切な二次抗体をブロッキング溶液で希釈し、核染色が望ましい場合はビスベンジミドH33342トリ塩酸塩(Hoechst染色)の1μg/mLを加えてSGに加えます。軌道シェーカー上の4°Cで12-24時間インキュベート。
  19. 抗体溶液を慎重に取り除き、200 μLのPBS-Tを加えます。プレートを軌道シェーカーの上に30分間置きます。
  20. PBS-Tを取り除き、洗浄工程を5回繰り返す。最後のステップでは、トリトンなしでPBSを使用します。
  21. 埋め込み用には、50~100μLの蛍光実装媒体( 材料表を参照)をガラススライドに広げ、準備双眼鏡の下に置きます。デュモン#5/45鉗子を使用して、96ウェルプレートからSGを拾い、フィルターペーパー(例えばWhatman乾燥パッド)に一方の端を浸して余分な液体を取り除き、ドロップに置きます。
  22. デュモン#5/45鉗子を使用して、適切な倍率で位置を修正します。
  23. SGの横にガラスカバースリップ(20mm x 20mm)をそっと置き、ゆっくりと下降します。
    注:あまりにも多くの取り付け媒体を使用すると、SGの動きや神経の絡み合いが発生します。その場合は、カバースリップを素早く取り外し、手順2.9~2.21を繰り返します。
  24. スライドをRTで一晩暗闇の中で乾燥させましょう。染色された標本の貯蔵は4°Cで少なくとも4〜6週間可能である。

3. その場合の全体マウント

注:SGのインシチュハイブリダイゼーションにおける全マウントは、コルチ32 の器官およびその中での市販のRNA蛍光をそのプロトコルで適応させた( 材料表を参照)。対象となる遺伝子のプローブと、サプライヤーからバッファーとソリューションを入手します。すべてのインキュベーションステップは、他に記載されていない場合は、RTで行われます。滅菌PBSを使用してください。複数のSGを1つの井戸で染色することに興味がある場合は、少なくとも150 μLのバッファーとソリューションを使用してください。

  1. ステップ 1.1 から 1.13 で説明されているように SG の解剖を行います。
  2. 軌道シェーカーに配置された96ウェルプレートの1つの井戸に4%MeOHフリーPFA /PBSの200 μLの1時間のSGを固定する。
  3. 軌道シェーカーで0.1%Tween-20/PBSでそれぞれ30分間SGを3回洗浄します。
  4. MeOH/PBSシリーズでは、その後50%MeOH/PBS、70%MeOH/PBS、100%MeOHで軌道シェーカーでそれぞれ10分間脱水します。
  5. SGを-20°Cで一晩100%MeOHで保管してください。
  6. 翌日、インキュベーターを40°Cに予温する。 温度計で温度を確認してください。
  7. 逆MeOH/PBSシリーズ(100%MeOH、70%MeOH/PBS、50%MeOH/PBS)でSGを10分間水分補給します。
  8. PBSでSGを5分間3回洗います。
  9. その間、40°Cで10分間インキュベーションしてプローブを事前に温め、続いて10分間冷却します。
  10. プロテアーゼIIIの200 μLでSGを15分間インキュベートします。
  11. オプション: その後の免疫蛍光染色が計画されている場合、このプロトコルのセクション2.3、2.4、および2.8に従って自己蛍光を急いでスーダンの黒い治療を行います。
  12. 軌道シェーカー上でそれぞれ5分間、0.1%Tween-20/PBS 3xの200 μLでSGを洗浄します。
  13. オプション:複数のプローブでの共染色が望ましい場合は、チャネル-1プローブ(1x)でチャネル-2(50x)およびチャネル3プローブ(50x)を希釈します。
  14. 関心のある遺伝子のプローブを100 μLでカバーし、わずか撹拌で40°Cで一晩インキュベートします。96ウェルプレートを40°Cの湿ったチャンバーに入れて、すべてのインキュベーションステップにします。
    注:陰性対照として1つのSGを含み、細菌遺伝子に対するプローブ(例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクタ ーゼ、Dapb)を用いて、後のステップで増幅試薬の非特異的結合をチェックする。
  15. SGを供給された洗浄バッファー3xで、それぞれ15分間、軌道シェーカー上で洗浄する。
  16. 事前暖かいアンプ1-3、HRP-C1、およびHRP遮断器からRTへ。チャネル2および/またはチャネル2プローブとの共同染色が望ましい場合は、事前ウォームHRP-C2およびHRP-C3。
  17. 軌道シェーカー上の4%PFA /PBSでRTで10分間SGを再固定します。
  18. RTの軌道シェーカー上で5分間、供給された洗浄バッファー3xの200 μLでSGを洗浄します。
  19. 増幅のために、軌道シェーカー上の40°Cで35分間、Amp1の100 μLでSGをインキュベートします。
  20. 液体を慎重に取り除き、200 μLのSGを供給された洗浄バッファー3xで、それぞれRTで軌道シェーカーで5分間洗浄します。
  21. 軌道シェーカー上の40°Cで35分間、Amp2の100 μLでSGをインキュベートします。
  22. ステップ 3.18 を繰り返します。
  23. 軌道シェーカー上の40°Cで20分間、Amp3の100 μLでSGをインキュベートします。
  24. ステップ 3.18 を繰り返します。
  25. 100 μL の SG を、オービタル シェーカー上の 40 °C で 20 分間、供給されたマルチプレックス FL v2 HRP-C1 をインキュベートします。
  26. ステップ 3.18 を繰り返します。
  27. オパール共役二次抗体を200 μLで1:1000で調製し、軌道シェーカー上で40°Cで35分間SGをインキュベートします。インキュベーション中およびこのステップから光から保護します。
  28. ステップ 3.18 を繰り返します。
  29. 100 μL のインキュベート SG は、軌道シェーカー上の 40 °C で 15 分間、マルチプレックス FL v2 HRP ブロッカーを供給しました。
  30. ステップ 3.18 を繰り返します。
  31. オプション: チャネル 2 プローブとの共同染色の場合、マルチプレックス FL v2 HRP-C2 を使用してステップ 3.25~3.30 を繰り返します。
  32. オプション: チャネル 3 プローブとの共同染色の場合、指定されたマルチプレックス FL v2 HRP-C3 を使用してステップ 3.25~3.30 を繰り返します。
  33. その後の免疫蛍光染色の場合は、このプロトコルのステップ2.13~2.25を実行します。
  34. 軌道シェーカーで30分間、BSA/PBSを1%インキュベートします。
  35. ビスベンジミドH33342トリヒドロクロリド(Hoechst染色)の1μg/mLで30分間インキュベートSGを1%BSA/PBSで1%BSA/PBSでインキュベートSGは、核染色が望ましい場合はBSA/PBSで、またはアレクサ結合小麦胚アガグルチニン(WGA、1:500)を軌道シェーカーに加える。
  36. ステップ 3.18 を繰り返します。
  37. ステップ 2.19-2.22 の説明に従って埋め込みます。

4. ネズミ星状神経節のイメージングと分析

  1. 局所画像化設備での埋め込みSGの共焦点顕微鏡を行う。
  2. 細胞サイズ測定が必要な場合、200倍倍のチロシンヒドロキシラーゼ( 材料表参照)に染色された画像SGは、各SGから4〜6枚のランダム画像を撮影します。
  3. ImageJ33 ソフトウェアを使用して画像を分析して、セルサイズを推定します (例えば、ペンテーブルを使用して、 材料表を参照してください)。 自由手選択を使用して、各セルを丸で囲み、 分析|セル 領域を取得する測定。SG 内に十分に位置する完全に見えるセルのみを含めるには注意してください。
  4. この方法を用いて、SG当たり約100個の細胞の測定を行う。
  5. 異なるマウスのSGを比較する場合は、目が見えない研究者にステップ4.2-4.3を実行してもらいます。統計ソフトウェアで頻度分布を使用して、グループ34間のサイズの差を視覚化します。

5. ネズミ星状神経節の分子解析

注: 実験計画に応じてコントロールを含めます。これは、異なる遺伝子型および疾患の背景および/または他の自律神経節を有するSGであり得る、例えば交感神経性の上頸神経節(首の領域に位置し、Zieglerら.35の詳細な説明を参照)または副交感神経節(例えば、心臓内神経節、Jungenらを参照)。

  1. 動物1匹あたり500μLのフェノール/グアニジンチオシアネート溶液(例えば、Qiazol)を用いた2mLチューブを調製し、液体窒素をショックフロスティングの準備ができているか、RNAの保護のための市販の溶液を検討する(オプション、 材料表を参照)36。RNAの単離のために迅速に働く。
  2. ステップ 1.1 から 1.13 で説明されているように SG の解剖を行います。
  3. すぐに液体窒素にフェノール/グアニジンチオシアネート溶液とショックフロストチューブと一つのチューブに直接両方のSGを浸します。
  4. さらに処理されるまで-80°Cで保管してください。
  5. 組織溶解の場合、フェノール/グアニジンチオシアネート溶液が液化されるまでSGでチューブを解凍させ、2つの7mmステンレスビーズを加えます。乾燥氷と遠心分離機の上で組織ホモジナイザー(ボールまたはミキサーミルII)の金属部分を冷却し、遠心分離機を4°Cで冷却します。
  6. 遠心管は、SGがチューブの底にあるように、4°Cで1分間500 x g でチューブ。
  7. 20 Hzで1分間、ティッシュライザーの金属部分にチューブを入れ、溶地を入れます。
  8. 無傷の組織が検出されるまで、ステップ5.6と5.7を5回まで繰り返します。
  9. 液体を1.5mLの新鮮なチューブに移します。
  10. メーカーの指示に従ってカラムベースのRNA分離キット(例えば、miRNeasyミニキット)でRNAの単離を行います。
  11. 20 μLのRNaseフリー水でRNAを溶出し、分光光度計を用いて濃度を測定します。
    注:精製したRNAのゲノムDNAによる汚染を排除するために、ゲノムプライマーと1μLのRNAをテンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応を行い、代わりに逆転写酵素制御を差し引いたものを提案します。これにより、かなりの量のRNAが節約されます。RNAが汚染されている場合は、エキソンイントロン境界プライマーまたはイントロン隣接プライマーを使用して、その後の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行います。
  12. 250 ng SG RNA を使用して cDNA 合成を行い、確立されたプロトコルを使用します。ここでは、メーカーの指示に従って大容量cDNA逆転写キットを使用しました。
  13. cDNAの2.5 ng/μLの最終濃度に希釈し、確立されたプロトコルに従って適切なプローブで定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行います。ここで、TaqManアッセイ( 材料表を参照)は、反応あたり10ng cDNAを用いて行った。
    注: すべての遺伝子に対してテンプレートなしのコントロールを実行して、誤検知結果を除外します。
  14. 家のキーピング遺伝子(例えば 、Cdkn1b)に関心のある遺伝子の遺伝子発現を正規化し、SGの異なるグループ間の相対的な遺伝子発現を比較する。

結果

図 1は、SG を識別して解剖する方法を視覚化します。 左右の長角のコリ筋肉はSGとリブケージから内側に入る方向の重要なランドマークです。解剖は、筋肉と最初の肋骨の間の点線に沿って行われる。SGと交感神経鎖は白い構造として見えるようになります(図1C)。図1Dは、左の長い...

ディスカッション

突然の心停止が世界的に最も一般的な死因であり続けるため、VAの発症に先立つ交感神経系のニューロンおよびグリア細胞における細胞および分子プロセスの理解は高い関心を持つ。そこで、現在の原稿では、このネットワーク内のマウスエレメントであるマウスSGを同定し、RNA、タンパク質、細胞レベルでのその後の分析を行う方法の基本的なレパートリーを提供していま...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、ハートウィグ・ヴィーボルトの優れた技術支援と、ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターのUKE顕微鏡イメージング施設(Umif)に、顕微鏡とサポートを提供してくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)[FKZ 81Z4710141]によって資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateTPP92097RNAscope
Adhesion Slides SuperFrost plus  25 x 75 x 1 mmR. Langenbrinck03-0060Microscopy
Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil.Serva11924.03Whole mount staining
bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAB2261Whole mount staining
Chicken anti neurofilamentEMD MilliporeAB5539Whole mount staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyD8418Whole mount staining
Donkey anti chicken IgY Alexa 647 Merck, KGA, Darmstadt, GermanyAP194SA6Whole mount staining
Donkey anti goat IgG Alexa 568 Thermo Fisher ScientificA11057Whole mount staining
Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 Thermo Fisher ScientificA21206Whole mount staining
Drying block 37-100 mmWhatman (Sigma Aldrich)WHA10310992 Whole mount staining
Eosin YSigma AldrichE4009Whole mount staining
Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %)Th.Geyer2212.5000Whole mount staining
Eukitt mounting mediumAppliChem253681.0008Whole mount staining
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Whole mount staining
Fluoromount-G + DAPISouthern Biotech0100-20Whole mount staining
Goat anti choline acetyltransferaseEMD MilliporeAP144PWhole mount staining
H2O2 30% (w/w)Merck, KGA, Darmstadt, GermanyH1009Whole mount staining
Heparin Sodium 25.000 UI / 5mlRotexmedicaPZN: 3862340Preparation SG
High-capacity cDNA reverse transctiption kitLife technologies 4368813RNA isolation
Isoflurane (Forene)Abbott Laboratories2594.00.00Preparation SG
Mayer's hemalum solutionMerck1.09249.0500Whole mount staining
MethanolSigma-Aldrich34860Whole mount staining
Microscope cover glasses 20x20 mm or smallerMarienfeld0101040Whole mount staining
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA isolation
NanoDrop 2000cThermo Fisher ScientificND-2000CRNA isolation
Opal 570 Reagent PackAkoya BioscienceFP1488001KTRNAscope
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar43368Whole mount staining
Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mmTh.Geyer7691202Whole mount staining
Phosphate-buffered saline tabletsGibco18912-014Whole mount staining
Pinzette Dumont SS ForcepsFineScienceTools11203-25Preparation SG
QIAzol Lysis ReagentQiagen 79306RNA isolation
Rabbit anti tyrosine hydroxylaseEMD MilliporeAB152Whole mount staining
RNAlaterMerckR0901-100MLRNA isolation (optional)
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2biotechne (ACD)323100RNAscope
RNAscope Probe-Mm-S100b-C2biotechne (ACD)431738-C2RNAscope
RNAscope Probe-Mm-Tubb3biotechne (ACD)423391RNAscope
Stainless steel beads 7 mm Qiagen 69990RNA isolation
Sudan black BRoth0292.2Whole mount staining
TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)Thermo Fisher Scientific4331182Gene expression analysis
TaqMan mastermixApplied biosystems4370074Gene Expression analysis 
Tissue Lyser IIQiagen85300RNA isolation
Triton X-100 10% solutionSigma-Aldrich93443-100mlWhole mount staining
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100MLRNAscope
Wacom bamboo penWacomCTL-460/KCell size measurements
Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2Sigma-AldrichWHA10311647Whole mount staining
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 ConjugateThermo Fisher ScientificW21404RNAscope

参考文献

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