גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

Summary

מאמר זה מתאר שיטות לדור, טיפול תרופתי וניתוח של explants נגזרים על ידי המטופל להערכת תגובות לתרופות גידול במערכת מודל חי, רלוונטי למטופל, פרה-קלינית.

Abstract

הבנה של עמידות לתרופות ופיתוח אסטרטגיות חדשניות לחש סרטן עמיד מאוד מסתמכים על זמינותם של מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים לחזות במדויק את תגובות המטופלים. אחד החסרונות של מודלים פרה-קליניים קיימים הוא חוסר היכולת לשמר בהקשר את מיקרו-וירוס הגידול האנושי (TME) ולייצג במדויק הטרוגניות תוך-אנושית, ובכך להגביל את התרגום הקליני של נתונים. לעומת זאת, על ידי ייצוג התרבות של שברים חיים של גידולים אנושיים, פלטפורמת explant נגזרת המטופל (PDE) מאפשרת לבחון תגובות סמים בהקשר תלת מימדי (3D) המשקף את התכונות הפתולוגיות והארכיטקטוניות של הגידולים המקוריים מקרוב ככל האפשר. דיווחים קודמים עם PDEs תיעדו את היכולת של הפלטפורמה להבחין בין כימוס רגישים לבין גידולים עמידים chemore, והוכח כי הפרדה זו מנבאת את תגובות המטופל לאותן כימותרפיות. במקביל, PDEs מאפשרים את ההזדמנות לחקור תכונות מולקולריות, גנטיות והיסתולוגיות של גידולים המנבאים תגובות לתרופות, ובכך לזהות סמנים ביולוגיים עבור ריבוד מטופלים, כמו גם גישות התערבותיות חדשניות לחש גידולים עמידים. מאמר זה מדווח על מתודולוגיית PDE בפירוט, מאיסוף דגימות מטופלים ועד לניתוח נקודות קצה. הוא מספק תיאור מפורט של שיטות נגזרות ותרבות, המדגיש תנאים מותאמים לגידולים מסוימים, במידת הצורך. לניתוח נקודות קצה, יש דגש על אימונופלואורסצנטיות מרובת מולטיפלקסים והדמיה רב-ספקטרלית ליצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים מרכזיים בתוך אזורים גידוליים ושטרומליים כאחד. על ידי שילוב שיטות אלה, ניתן לייצר נתוני תגובה כמותית ואיכותית לתרופות שיכולים להיות קשורים לפרמטרים קליניאופתולוגיים שונים ובכך עשויים לשמש לזיהוי סמן ביולוגי.

Introduction

הפיתוח של סוכני נגד נגדים יעילים ובטוחים דורש מודלים פרה-אקליניים מתאימים שיכולים גם לספק תובנה על מנגנוני פעולה שיכולים להקל על זיהוי של סמנים ביולוגיים חזויים ופרמקודינמיים. בין-1,^2,3,4,5 ו- TME^{6,7,8,9,10,11,12} ידועים כמשפיעים על תגובות תרופות נגד סרטן, ומודלים קיימים רבים של סרטן פרה-אקליני כגון קווי תאים, אורגנוידים ומודלים של עכבר אינם מסוגלים להכיל באופן מלא את אלה חיוניים תכונות. מודל "אידיאלי" הוא מודל שיכול לשחזר את האינטראקציות המרחביות המורכבות של ממאיר עם תאים לא ממאירים בתוך גידולים, כמו גם לשקף את ההבדלים האזוריים בתוך גידולים. מאמר זה מתמקד PDEs כפלטפורמה מתפתחת שיכולה למלא רבים מדרישות אלה¹³.

הדוגמה הראשונה לשימוש ב- PDEs אנושי, הידוע גם בשם היסטוקולטורות, מתוארכת לסוף שנות השמונים כאשר הופמן ואח 'יצרו פרוסות של גידולים אנושיים שנכרתו טריים ותרבלו אותם במטריצה קולגן^14,15. זה היה כרוך בהקמת מערכת תרבית תלת-ממדית ששימרה את ארכיטקטורת הרקמות, והבטיחה שמירה על רכיבים סטרומיים ואינטראקציות תאים בתוך ה- TME. מבלי לפרק את הגידול המקורי, הופמן ואח '¹⁶ מבשרים על גישה חדשה של מחקר תרגום, ומאז, קבוצות רבות מיטבו שיטות הסבר שונות במטרה לשמור על שלמות הרקמה ולייצר נתוני תגובה מדויקים לתרופות^{17,18,19,20,21,22,23,24} למרות כמה הבדלים בין פרוטוקולים ניכרים., באטלר ואח ' explants תרבותית ספוגי ג'לטין כדי לעזור דיפוזיה של חומרים מזינים ותרופות באמצעות הדגימה^20,21,25, ואילו מג'ומדר ואח 'יצר מערכת אקולוגית גידול על ידי culturing explants על גבי מטריצה המורכבת של גידול וחלבונים סטרומיים בנוכחות סרום אוטולוגי נגזר מאותו חולה^{22, 23.}

לאחרונה, הקבוצה שלנו הקימה פרוטוקול לפיו explants נוצרים על ידי פיצול של גידולים לתוך 2 - 3 מ"מ³- חתיכות בגודל כי הם ממוקמים לאחר מכן ללא רכיבים נוספים על ממברנות חדירים בממשק אוויר נוזלי של מערכת תרבות²⁴. יחד, מחקרים רבים אלה הוכיחו כי PDEs מאפשרים את התרבות של שלם, שברים חיים של גידולים אנושיים השומרים על הארכיטקטורה המרחבית וההטרוגניות האזורית של הגידולים המקוריים. בניסויים מקוריים, explants או histocultures היו בדרך כלל נתון הומוגניזציה בעקבות טיפול תרופתי, ולאחר מכן בדיקות קיימא שונות הוחלו על דגימות הומוגניות כגון אסאי תגובת התרופה היסטוקולטורה^20,21, MTT (3-(6)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) אסי, ההסתה של הלקטט דהידרוגנאז, או אסאי מבוסס רסזורין^26,27,28 . ההתקדמות האחרונה בטכניקות ניתוח נקודות קצה, במיוחד פתולוגיה דיגיטלית, הרחיבו כעת את הרפרטואר של בדיקות נקודת קצה ובדיקות שניתן לבצע על explants^29,30. כדי ליישם טכנולוגיות חדשות אלה, במקום הומוגניזציה, explants קבועים פורמלין, מוטבע פרפין (FFPE) ולאחר מכן מנותח באמצעות טכניקות חיסוניות, המאפשר פרופיל מרחבי. דוגמאות לגישה זו תועדו עבור סרטן ריאות תאים לא קטנים (NSCLC), סרטן השד, סרטן המעי הגס, ו explants mesothelioma לפיה כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סמן ההתפשטות, Ki67, ואת הסמן אפופטוטי, פולי-ADP פולימראז (cPARP), שימש לניטור שינויים התפשטות התא ומוות תאים^{24,31,32,33,34}.

אימונופלואורסצנטיות מרובת קסים נוחה במיוחד ליצירת פרופיל מרחבי של תגובות סמים ב explants בנקודת קצה³⁵. לדוגמה, ניתן למדוד את ההקצאה מחדש ואת ההתפלגות המרחבית של סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים או תאי T, בתוך TME על טיפול תרופתי^13,36,37,38, ולחקור אם סוכן טיפולי יכול להעדיף את המעבר מ"גידול קר "ל"גידול חם^"39 . בשנים האחרונות, קבוצה זו התמקדה בהפקת PDEs מסוגי גידולים שונים (NSCLC, סרטן כליות, סרטן השד, סרטן המעי הגס, מלנומה) ובדיקה של מגוון של חומרים נגד סרטן כולל כימותרפיה, מעכבי מולקולות קטנות, ומעכבי מחסום חיסוני (ICIs). שיטות ניתוח נקודות קצה עברו אופטימיזציה כדי לכלול אימונופלואורסצנטיות מרובת-קסים כדי לאפשר יצירת פרופיל מרחבי של סמנים ביולוגיים לצורך כדאיות, כמו גם סמנים ביולוגיים עבור מרכיבים שונים של TME.

Protocol

1. איסוף רקמות

1. לאחר הניתוח, העבר דגימות גידול אנושי שנפלטו טריות לתוך צינור המכיל 25 מ"ל של מדיום תרבות טרי (המדיום הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז ו L-גלוטמין + 1% (v / v) סרום עגל עוברי + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) ומאוחסן על קרח. לעבד את explant בתוך 2 שעות של ניתוח בברדס סטרילי בכיתה II.

2.הכנת E xplant

1. נקה את כל הציוד הכירורגי (להבי שתל / משטח שעווה דנטלי / פינצטה) עם 70% פתרון רוח מתילציה תעשייתית (IMS).
2. מלאו צלחת תרבות של 10 ס"מ (ראו את שולחן החומרים)בכ-25 מ"ל של מדיום טרי, ומניחים אותה על מצע קרח.
3. בעזרת פינצטה, מעבירים את הדגימה על משטח שעווה דנטלי (ראו טבלת החומרים) ופורסיםאת הרקמה לרסיסים של כ-2-3 מ"מ³ באמצעות שני להבי שתל עור.
   הערה: לקבלת הביצועים הטובים ביותר, להתחיל לחתוך את הרקמה כדי לקבל רצועה בודדת של 2-3 מ"מ של עובי, ולאחר מכן לחתוך את הרצועה לאורך כדי לקבל את explants הסופי. חוזרים על התהליך עד שכל הדגימה קצוצה.
4. מעבירים את המסלקים מיד למדיום התרבות הקר כקרח בצלחת 10 ס"מ. קח חלק מהגורמים (6-9 חתיכות), מקם אותם בצינור 1 מ"ל המכיל 10% מפתרון הפורמלין הלא-חוצץ, ועזוב בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות.
   הערה: קטעים אלה ייצגו את מסבירי השליטה עבור המצב "לא תרבותי".
5. מלאו את מספר הברכות הרצוי של צלחות 6-well עם 1.5 מ"ל של מדיום טרי לכל באר, ומניחים דיסק הכנסת תרבות אורגנוטיפית (ראה טבלת החומרים) בכל באר, כך שהוא צף על גבי המדיום, תוך הימנעות בזהירות מבועות אוויר בממשק הכנסת המדיה.
6. בחר explants באופן אקראי, וממקם אותם אחד בכל פעם על גבי דיסק ההוספה. כדי להפוך את המצב "לא תרבותי", להשתמש 6-9 explants לבאר. מניחים את הצלחת multiwell בחממה CO₂ ב 37 °C ו 5% CO₂, ולאפשר explants להתאושש במשך 16 שעות.
   הערה: כדי למנוע ריסוק הרקמה, מומלץ מאוד לטפל בעדינות של פינצטה.

3. טיפול תרופתי

1. לאחר 16 שעות, לקחת לוחות חדשים 6-באר, להוסיף 1.5 מ"ל של בינוני טרי לכל באר, להוסיף את התרופות הרלוונטיות בריכוזים הרצויים, ולכלול באר לשליטה ברכב. בעזרת פינצטה, להעביר כל תוספת המכילה את explants ללוחות 6 באר שהוכנו לאחרונה המכילים את התרופות. מניחים את הצלחות בחממה CO₂ ב 37 °C (5°F) ו 5% CO₂ עבור 24-48 שעות.
2. העבר את explants לא תרבותי קבוע בעבר פורמלין לתוך קלטת היסתולוגיה (ראה סעיף 4 להלן), ולאחסן 70% IMS עד סוף הניסוי.

4. עיבוד היסתולוגי

1. קיבוע רקמות
   1. לאחר טיפול תרופתי, להעביר את דיסקי הכנס המכילים explants לתוך לוחות חדשים 6-באר המכיל 10% פורמלין, ולהוסיף כמה טיפות של 10% פורמלין על החלק העליון של explants כדי להבטיח כיסוי מלא עם הקיבוע.
      זהירות: פורמרין מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור, ולטפל בו בתוך מזון אדים למניעת שאיפה.
   2. אפשר לגולמים להישאר ללילה (20-24 שעות) בפורמלין של 10%.
   3. למחרת, להשרות את המספר הרלוונטי של ספוגים היסתולוגיים קטנים ב 70% IMS, ולהניח אותם בתוך קלטות היסתולוגיה. מעבירים בעדינות את כל המסלקים ממצב טיפול תרופתי נתון על ספוג יחיד (לשמור על כיוון הגוזל כך שהצדדים של explants במגע עם דיסקים הכנס, ולכן האזורים שטופלו בסמים, ממוקמים במגע עם הספוג). מניחים עוד ספוג ספוג מראש על גבי explants, ומאובטח בתוך קלטת היסתולוגיה (קלטת אחת לכל טוב / טיפול).
   4. תטביעו את הקלטות ב-70% IMS, והשאירו ב-RT למשך 24 שעות.
2. הטמעת פרפין וחתך רקמות
   1. למחרת, להעביר את קלטות ההיסתולוגיה המכילות את explants לתוך סל לדוגמה של מעבד הרקמות (ראה טבלת החומרים), ולאבטח את המכסה. מניחים את הסל בתשובה וסוגרת בעדינות. בחר את התוכנית הרצויה והפעל את המעבד. מסננים את התשובה, פותחים אותה כדי להסיר את הסל ומעבירים את הסל לאמבט השעווה המרכזי.
   2. לאחר ההטבעה, מעבירים את מכסי קלטות המתכת לסל, וחוזרים לתשובה של מעבד הרקמות לתוכנית הניקוי. נגב את החיישן עם רקמה יבשה, הסר כל שעווה עודפת ממכסה התשובה, והמשיך עם תוכנית הניקוי.
   3. מקם בלוק פרפין במיקרוטומיה הסיבובית, חתוך כמה חלקים ב-4 מיקרומטר, והחזיר את הבלוק לקרח. מקם מחדש את הבלוק, וחתוך מקטעים נוספים של 4 מיקרומטר. מעבירים את המקטעים עם מברשת צבע קטנה ומלקחיים על אמבט מים כדי להסיר קמטים ובועות.
   4. מקם את המקטעים באופן מרכזי על שקופיות מיקרוסקופ, לנקז את השקופיות במשך כמה דקות, ולהניח אותם לתוך מתלה שקופיות להתייבש לילה באינקובטור ב 37 °C (50 °F). כאשר המקטעים יבשים, אחסן אותם ב- RT בתיקיה או בתיבה שקופית כדי להגן מפני אבק.

5. ההכתמה המטוקסילין ואוסין (H&E)

1. מלא את הכתם (ראה טבלת החומרים) עם ריאגנטים, ולהגדיר את התוכנית הנדרשת עבור H&E כתמים: זמן הדגירה המטוקסילין: 5 דקות; זמן הדגירה של אאוזין: 3 דקות.
2. חבר את ארון התקשורת של השקופיות למנשא, מקם אותו במיכל הראשון עם קסילן והפעל את התוכנית. הסר את מנשא השקופיות מארון התקשורת והסר את הגורם המכיל עם ארון התקשורת של השקופיות לאזור הטעינה.
3. הר את השקופיות עם דיבוטיל פתלט קסילן (DPX) מתחת למכסה המנוע. הנח את DPX על כל כיסוי, והנמיך את השקופית על כיסוי עם המקטע כלפי מטה, מה שמאפשר ל- DPX להתפשט.
   הערה: DPX הוא מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור ולהשתמש במכסה אדים ייעודי.

6. חיסון

הערה: השלבים הבאים צריכים להתבצע ב- RT אלא אם צוין אחרת.

1. דפראפיזציה והידרציה
   1. מניחים את השקופיות בארון שקופיות, ומחממים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני שמגדירים את המקטעים בקסילן למשך 3 דקות (פי 2). מזער את כמות פתרון הנשיאה.
      הערה: קסילן דליקה, מסוכנת ומרגיז. יש לטפל בתוך מכסה המנוע של האדים תוך שימוש בכפפות דו-שכבתיות. יש להימנע ממגע עור ועיניים. להיפטר מפסולת בתוך מיכל אטום.
   2. הייבשו את השקופיות בשיפוע אלכוהול כדלקמן: 99% IMS עבור דקה אחת (2x) ו-95% IMS למשך דקה אחת. מזער את כמות פתרון הנשיאה.
      הערה: IMS הוא דליק מאוד, נדיף, ומעצבן. יש לטפל בתוך מכסה המנוע של האדים ולהימנע ממגע עור ועיניים.
   3. שקוע לחלוטין במתלה השקופיות במים אולטרה-תפותיים (UP) למשך 5 דקות.
2. אחזור אנטיגן
   1. הכן מאגר אחזור אנטיגן בהתאם להנחיות היצרן עבור הנוגדן המסוים המשמש.
      הערה: חוצץ סיטראט 0.2 M, pH 6, או טריס(הידרוקסימתיל)אמינומטן (טריס)-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) 0.1 M, pH 9, הם המאגרים הנפוצים המשמשים לתנאים חומציים או אלקליין, בהתאמה. חומצת לימון מונוהידראט וטרי הם סוכנים מגורה. הכן את כל פתרונות המלאי במכסה האדים. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים.
   2. הטביע את ארון התקשורת המכיל את השקופיות במאגר אחזור אנטיגן, ומיקרוגל (ראה טבלת החומרים) בעוצמה מלאה (800 W) למשך 20 דקות.
      הערה: שמור את השקופיות שקועות לחלוטין במאגר במהלך כל התהליך. כדי למנוע הקטנה מופרזת של אמצעי האחסון של המאגר, הנח מכסה על גבי הגורם המכיל בו נעשה שימוש.
3. אימונופלואורסצנטיות מולטיפלקס (mIF)
   הערה: תהליך זה אורך 1-2 ימים.
   1. מלא מיכל נקי עם 250 מ"ל של מים UP, ולהטביע לחלוטין את מתלה השקופיות במשך 2 דקות (2x). המשך בהרכבת כל שקופית לתוך לוחית כיסוי לשקופית (עיין בטבלת החומרים).
      1. כדי להרכיב שקופית על לוחית, הכינו שוקת זכוכית עם מים. שקועים הן את לוחית הכיסוי והן מחליקים במים, ומניחים את צד מקטע הרקמה מול לוחית הכיסוי.
      2. מקם את הקצה התחתון של השקופית על גבי הבלטות בתחתית לוחית הכיסוי, ולבסוף ליישר את השקופית אל לוחית הכיסוי, ומאפשר למים למלא את הפער שביניהם ללא אוויר לכוד. החזק את לוחית הכיסוי והחליקו יחד, והצב אותם בארון טיוח.
   2. מלאו את לוחית הכיסוי עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), והמתינו עד שהמאגר ישטוף את השקופיות, הזורם החוצה בכוח המשיכה (פי 2). Pipet 110 μL של חוצץ חסימה (ראה את טבלת החומרים)על כל טייפ ודגרה במשך 10 דקות.
   3. הכן את דילול הנוגדנים העיקרי הרצוי ב- PBS או חסימת מאגר בהתאם להמלצות היצרן. לדגור את השקופיות עם נוגדן ראשוני (110 μL כל שקופית) במשך 30 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
   4. לדגור את השקופיות עם 110 μL של פולימר peroxidase חזרת במשך 30 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
   5. הכן דילול פלואורופור בדלל הגברה 1:100 (v/v), ודגר את השקופיות עם פלואורופור (110 μL כל שקופית) במשך 10 דקות. לשטוף את השקופיות עם 5 מ"ל של PBS (2x), כמתואר ב 6.3.2.
      הערה: לשימוש פלואורופור 780, בצע את הנחיות היצרן. הניסוי עשוי להיות מושהה כאן אם השקופיות הם דגירה בשטיפה הסופית של PBS ומאוחסנים ב 4 °C (50 °F) לילה.
   6. פתחו את השקופיות מהחלליות, וחזרו לשלב אחזור האנטיגן כדי להתחיל את הכתמים בנוגדן אחר. חזור על הכתמים עבור מספר הנוגדנים הרצוי לבדיקה.
   7. לאחר שלב 6.3.5 עבור פלואורופור האחרון בשימוש, לשמור את השקופיות על לוחות הכיסוי, להכין פתרון 6 מיקרומטר של 4'-6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) להתרחב עם מים UP, ונגד המגלשות במשך 5 דקות (110 μL כל שקופית). לשטוף את המגלשות עם מים UP (2x), ולהסיר מים עודפים על ידי ייבוש הקצוות של המגלשות. הרכב את כיסויי המכסים בשקופיות באמצעות מדיום הרכבה, ואחסן ב- RT בחושך.

7. סריקה

הערה: סריקת שקופיות בוצעה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית רב-ספקטרלית (ראה טבלת החומרים).

1. הרכב את השקופיות לתוך המוביל, וטען אותן לסורק בסדר הרצוי.
   הערה: מומלץ לכלול שקופית בקרה שבה לא נעשה שימוש בפלואורופור או DAPI במהלך כתמים אימונוהיסטוכימיים. שקופית זו תשמש כשליטה לפלורסנס מהותי (autofluorescence (AF)) של הרקמה.
2. לאחר הפעלת תוכנת סורק השקופיות, בחר ערוך פרוטוקול מדף הבית. צור פרוטוקול חדש המתייחס לשם, מצב הדמיה, סוג הסריקה הרב-ספקטרלית שיש לבצע (4-7 ערוצים)ולמד (מדריךכתובות).
   הערה: כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של רצועות שנותחו, בחר/בטל את הבחירה במסננים הרצויים באמצעות הפונקציה בחר סרוק רצועות
3. המשך עם ספק החשיפה והטעינה של סריקה , ולבסוף בחר את המפעיל עבור הגדרת הפרוטוקול. בחר 'קח מבט כולל' כדי לזהות את הרקמה בשקופית. בחר שקופית המוצגת במנשאובחר אזור מסוים של הרקמה עם הסמן האדום כדי להביא אותה לתצוגה חיה בחלון הימני של המסך.
4. בחר את מסנן DAPIולחץ על מיקוד אוטומטי או התאם באופן ידני את המחוון גובה שלב כדי למקד את שדה העניין. לחץ על חשיפת אוטומטית כדי לאפשר למערכת למצוא את החשיפה הטובה ביותר עבור מסנן / להקה זו.
   הערה: זמן החשיפה עבור כל מסנן מוגדר על 12 ms. לאחר חשיפת המערכת באופן אוטומטי, מקד את זמן החשיפה להערכה טובה יותר. ניתן גם לעקוף את ערך ההחלמה האוטומטית על-ידי הקלדת ערך באופן ידני בתא המסומנת.
5. חזור על השלבים לעיל עבור כל המסננים בפרוטוקול. במידת הצורך, שנה את המיקומים ו/או השקופיות כדי למצוא את האותות הטובים ביותר להגדרת החשיפות.
   הערה: אם הרקמה מסומנת באדום בתצוגה חיה, האות הפלואורסצנטי של המסנן שנותח רווי, ויש לחזור על חשיפת אוטומטית.
6. לאחר קביעת הגדרות החשיפה, לחץ על לחצן הקודם ושמור את הפרוטוקול. מדף הבית של התוכנה (ראה טבלת החומרים), בחר סרוק שקופיות.
7. עורם את כל הספקים שיש לסרוק לתוך מלון Slide Carrier, ושים לב לסדר השקופיות כדי להקצות את המזהה שלהם למערכת.
   הערה: במסך התוכנה, כל מפעיל יהיה קשור לחריץ המכיל 4 שקופיות.
8. כדי לקבוע תצורה של שקופיות מרובות עם אותם פרמטרים, לחץ על קביעת תצורה של משימותובחר חריץ אחד או יותר עם האפשרות Uלשיר אתאותם כללים עבור אותן שקופיות. לאחר פתיחת השקופיות, קבע את תצורת: משימות, לימוד ופרוטוקולולחץ על אישור.
9. סמן כל שקופית על-ידי לחיצה על סמל חריץ והקלד שם בתא Slide ID. לחץ על סריקה כדי להתחיל בסריקה.
   הערה: לאחר שסמל חריץ הופך לכחול והשקופיות מסומנות בחץ כחול, למפעיל יש את כל הכללים והוא מוכן לסריקה. ניתן לשמור את מזהי השקופיות, המחקרים, הפרוטוקולים והמשימות על-ידי לחיצה על לחצן שמור התקנה.

8. ניתוח

הערה: הפרוטוקול שלהלן ממחיש את השיטה לניתוח פנוטיפ.

1. הכנת תמונה
   1. כדי להכין את התמונות לניתוח, פתח את תוכנת המציג (עיין בטבלת החומרים)ובחר טען שקופיות. בחר את הסריקות הרצויות עבור פרוייקט האימון בצד ימין של המסך.
   2. עבור כל סריקה, לחץ על חותמתובחר Project בתיבה בחר עבור: הגדר חותמת בגודל 1 x 1 בשדה התמונה שתשמש מאוחר יותר כתבנית לניתוח האימון. שים לב כי חותמת זו תסומן ריבוע אדום.
      הערה: מספר הביאורים של בולים עבור הפרוייקט הוא שרירותי. מומלץ ליצור אחד עבור סריקת פלואורסצנטיות מהותית ועוד כמה כי הם בדרך כלל מייצגים את התפלגות האות בתוך הרקמה.
   3. לבסוף, פתח את כל הסריקות של הניסוי. עבור כל אחד מהם, לחץ על חותמת, והפעם, בחר את האפשרות אצווה בתיבה בחר עבור: מקם חותמת הנימקה כל הסבר.
      הערה: הפעם, הבולים יסומנו ריבועים ירוקים ויידרשו לאחר הפעלת ניתוח האצווה. בחר את הגודל המתאים עבור הבולים (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) והימנע מחפיפה של הבולים, אשר יפיק נתונים כפולים בקובץ המיוצא.
2. ניתוח הדרכה
3. הפעל את התוכנה לניתוח (ראה טבלת החומרים) וצור פרוייקט חדש: בחר קובץ | ניו | פרוייקט.
4. הקלד שם בתיבה שם פרוייקט וקבע את תצורת סוג הפרוייקט.
   הערה: הניסויים בוצעו באמצעות המפרטים הבאים: פילוח רקמות ניתן לאימון; פילוח תאים אדפטיבי; פנוטיפינג.
5. טען את הסריקות המכילות את הבולים לאימון: | פתח | תמונה. בתצוגת מצב יחיד, נווט בין התמונות ובחר את הסריקות עם פלואורסצנטיות מהותית.
6. לחץ על לחצן Autofluorescence (AF), ועם בורר Autofluorescence, לצייר על חלק לא נגוע של רקמה. לחץ על הכן תמונות כדי לאפשר לתוכנה להפחית את עוצמת הפלואורסצנטיות המהותית מכל התמונות שהועלו לאימונים.
7. לחץ על לחצן ערוך סמנים וצבעים והזן את שמות הסמנים בתיבה המשויכת לפלורופור שלהם. לחץ על שלב רקמת פלח השוק בחלק העליון של המסך כדי לפתוח את חלון האימון פילוח רקמות.
8. בחלון קטגוריות רקמות, הקלד את שם קטגוריות הרקמות כדי לפלח את התמונות לתוך (למשל, גידול, סטרומה, רקע, נמק).
9. בחלון האימון של פילוח רקמות, לחץ על לחצן צייר וצייר אזורים סביב קבוצות תאים כדי להגדיר קטגוריית רקמות של עניין. לדוגמה, כדי להגדיר אזור גידול, לצייר אזור סביב קבוצה של תאים סרטניים. עבור לקטגוריה הבאה וחזור על תהליך הציור.
   הערה: מומלץ לצייר אזורים ברוב התמונות שהועלו לאימונים. ניתן גם למקד את ההכשרה על ידי עריכת סולם התבנית ורזולוציית הפילוח שפרטיהם מתוארים טוב יותר במדריך למשתמש.
10. לאחר שהגדר את אזורי האימון, המשך עם רכבת מקטע הרקמות.
    הערה: במהלך תהליך האימון, התוכנה מציגה את אחוז הדיוק של פילוח רקמות. לקבלת תוצאות אופטימליות, מומלץ כי פילוח רקמות להיות לפחות 90% מדויק. לאחר שהמקטע התייצב, לחץ על לחצן סיום.
11. כדי לראות את מסיכת קטגוריית הרקמות בכל התמונות, לחץ על לחצן פלח הכל.
12. לאחר אימות איכות פילוח הרקמות, צייר מחדש את אזורי האימון סביב האזורים שסווגו באופן שגוי, ואמן מחדש את מקטע הרקמות עד שהתהליך יצליח.
13. לחץ על שלב פילוח התאים בסרגל השלבים בחלק העליון של החלון כדי להמשיך בניתוח.
14. בחר את התאים התאיים לפלח: גרעינים, ציטופלסמה, ו / או ממברנה.
    הערה: מכיוון שסגמנטציה של תאים אדפטיביים יכולה לזהות רק תאים עם אות גרעיני, אל תבחר גרעינים. למרות שניתן גם לפלח ציטופלסמה ו/או ממברנה, מומלץ לבחור תחילה את הרכיב הגרעיני החזק והשופע ביותר (למשל, DAPI).
15. קבע את תצורת הרכיב הגרעיני באמצעות המחוון 'עוצמה אופיינית' להתאמת הסף המשמש לזיהוי פיקסלים גרעיניים. שים לב לחלון התצוגה המקדימה שנפתח ומספק משוב חי כאשר הסף מותאם.
    הערה: סף זה הוא אדפטיבי ונמדד ביחס לרקע שמסביב. הגדל ערך זה אם יותר מדי רקע מזוהה כגרעין. תנמיך את הערך הזה אם חסרים גרעינים קלושים. השתמש בלחצן הצג/הסתר אזורים כדי להבהב במסיכות הפילוח לסירוגין, ובדוק אם הפיקסלים הנכונים מזוהים כגרעין.
16. לפיצול אשכולות של פיקסלים גרעיניים, השתמש בלוח פיצול רכיבים גרעיניים. בחר את הלחצן המתאר בצורה הטובה ביותר את איכות הכתמים של הגרעינים. לאחר מכן, השתמש בסרגל המחוון כדי להתאים את רגישות הפיצול, תוך התחשבות שערכים נמוכים יותר יביאו לפיצול רב יותר.
17. לחץ על לחצן פלח שוק הכל כדי לפלח את כל התמונות. אם התוצאה אינה מדויקת, שנה את ההגדרות ואמן מחדש את התוכנה עד להשגת פילוח מספק.
18. המשך לשלב האחרון של הניתוח: פנוטיפינג. בחלונית Phenotypes, הוסף את רשימת הפנוטיפים שיש לזהות, והקלד את השם בתיבת הטקסט המתאימה. לחץ על לחצן ערוך Phenotypes, בחר תא מסוים כדי להעלות תפריט נפתח, ובחר את הפנוטיפ המתאים.
    הערה: לפחות חמישה תאים עבור כל פנוטיפ יש צורך לאמן את המסווג. כיבוי ההדמיה של הגרעינים מאפשר הדמיה טובה יותר של פנוטיפ התא כי צריך להיות מוקצה.
19. לאחר השלמת הבחירה להכשרה, לחץ על לחצן מסווג הרכבת.
    הערה: התוכנה תסווג כל תא בודד בתמונה, ובכל פעם שמתרחשות שגיאות בסיווג, ניתן לערוך את הפנוטיפ של התאים ולחזור על האימון של המסווג. שמור את הפרוייקט לפני שתמשיך לניתוח אצווה ולחץ על הייצוא בסרגל הכלים בחלק העליון של המסך.
20. בחר בכרטיסיה ניתוח אמבטיה בתפריט הימני וטען את הפרוייקט בתיבה אלגוריתם אצווה או פרוייקט.
21. לחץ על אפשרויות ייצוא כדי ליצור ספריות נפרדות עבור כל תמונה, ועם לחצן עיון, נווט כדי למצוא את המיקום לייצוא הנתונים. לחץ על כל האפשרויות של תמונות וטבלאות לייצוא.
22. בצד שמאל של המסך, לחץ על הוסף שקופיות וטען את כל התמונות המכילות בולים עבור אצוות שהוכנו בעבר (שלב 7.3). לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את ניתוח האצווה ולעבד חותמת אחת בכל פעם, ייצוא הנתונים המתאימים.

תוצאות

הדמיה רב-ספקטרלית של קטעים היסתולוגיים מוכתמים MIF מאפשרת זיהוי ופנוטיפינג של אוכלוסיות תאים בודדים וזיהוי של רכיבים סרטניים וסטרומליים ב- TME המהולל (איור 2). הדמיה רב-ספקטרלית שימושית במיוחד לניתוח רקמות עם אוטופלואורסצנטיות פנימית גבוהה, כגון רקמות עם תכולת קולגן גבוהה, ש?...

Discussion

מאמר זה מתאר את שיטות הדור, הטיפול התרותי והניתוח של מחשבי כף יד ומדגיש את היתרונות של הפלטפורמה כמערכת מודל פרה-קלינית. פולחן Ex vivo של גידול שנפלט טרי, שאינו כרוך בפירוקו, מאפשר שימור של ארכיטקטורת הגידול^13,24 ולכן, את האינטראקציות המרחביות של רכיבים תאיים ב- TME...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma	320099	Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x	Perkin Elmer	ARD1001EA	Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond	Barnstead		Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate	Sigma-Aldrich	C7129	Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates	Corning Incorporated	3516	6 multiwell plate
DAPI Dilactate	Life Technologies	D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350	100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate	Gibco (Life Technologies)	10569-010	Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant	VWR	360294H	Mounting medium
DPX mountant	Merck	6522	Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	Reagent for TE buffer
Eosin	CellPath	RBC-0100-00A	Staining reagent
Foetal Bovine Serum	Gibco	10500-064	For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde	Fisher (Acros)	119690010	10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095	iGenix	IG2095	Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)	Genta Medical	199050	99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software	Akoya Biosciences	InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor	Leica Biosystems		Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C	Leica Biosystems		Embedding wax bath
Leica RM2125RT	Leica Biosystems		Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer	Leica Biosystems		H&E stainer
Mayer's Haematoxylin	Sigma	GHS132-1L	Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Merck Milipore	PICMORG50	Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System	Leica Biosystems	RE7150-K	DAB staining kit
OPAL 480	Akoya Biosciences	FP1500001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent	Akoya Biosciences	FP1501001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x	Perkin Elmer	ARH1001EA	HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution	Fisher Scientific	11548876	For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer	Akoya Biosciences	PhenoChart	Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets	Thermo Scientific Oxoid	BR0014G	PBS
1x Plus Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36961	Mounting medium
Slide Carrier	Perkin Elmer		To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S/3160/63	10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets	Fisher Scientific	S/4920/53	Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)	KEMDENT	1-601	Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center	Fisher Scientific	10098889	Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates	Fisher Scientific	11927774	Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	252859	Reagent for TE buffer
VectaShield	Vecta Laboratories	H-1000-10	Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner	Perkin Elmer	Vectra Polaris	Slide scanner
Xylene	Genta Medical	XYL050	De-waxing agent