환자 유래 종양은 환자의 약물 내성을 예측하기위한 "라이브"전임상 플랫폼으로 이월합니다.

요약

이 논문은 살아있는 환자 관련 전임상 모델 시스템에서 종양 약물 반응을 평가하기 위한 환자 유래 각종의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명합니다.

초록

약물 내성의 이해와 고저항성 암을 민감하게 하기 위한 새로운 전략의 개발은 환자 반응을 정확하게 예측할 수 있는 적합한 전임상 모델의 가용성에 의존합니다. 기존 전임상 모델의 단점 중 하나는 인간 종양 미세환경(TME)을 문맥적으로 보존하고 종양 내 이질성을 정확하게 나타내지 못해 데이터의 임상번역을 제한하는 것이다. 대조적으로, 인간 종양의 살아있는 단편의 문화를 대표함으로써, 환자 유래 한 절제 (PDE) 플랫폼은 원래 종양의 병리학 적 및 건축 적 특징을 가능한 한 가깝게 반영하는 3차원 (3D) 맥락에서 약물 반응을 검사 할 수 있게합니다. PDEs를 가진 이전 보고는 화학 저항하는 종양에서 화학반응을 구별하는 플랫폼의 기능을 문서화하고, 이 분리는 동일 화학요법에 참을성 있는 반응의 예측이다는 것을 보여주었습니다. 동시에, PDEs는 약물 반응을 예측하는 종양의 분자, 유전 적 및 조직학적 특징을 심문할 수 있게 하여 환자 계층화에 대한 바이오마커와 내성 종양에 민감하게 반응하는 새로운 중재 적 접근법을 식별할 수 있습니다. 이 논문은 환자 샘플 수집부터 끝점 분석에 이르기까지 PDE 방법론을 자세히 보고합니다. 그것은 특정 종양에 대한 맞춤형 조건을 강조, 절제 파생 및 배양 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다, 적절한 경우. 엔드포인트 분석을 위해, 종양 및 기질 영역 내의 주요 바이오마커의 공간 프로파일링을 위한 멀티플렉스 면역 형광 및 다중 스펙트럼 이미징에 초점이 있다. 이러한 방법을 결합함으로써, 다양한 임상 병리학 파라미터와 관련될 수 있는 정량적 및 질적 약물 반응 데이터를 생성하여 잠재적으로 바이오마커 식별에 사용될 수 있다.

서문

효과적이고 안전한 항암제의 개발은 예측 및 약동적 바이오마커의 식별을 용이하게 할 수 있는 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 적절한 전임상 모델이 필요합니다. 종양 간 이질성^1,2,3,4,5 및 TME^{6,7,8,9,10,11,12는} 항암제 반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 세포주, 오르가노이드 및 마우스 모델과 같은 많은 기존 전임상 암 모델은 이러한 결정적인 것을 완전히 수용할 수 없다. 기능. "이상적인" 모델은 종양 내의 비악성 세포와 악성종양의 복잡한 공간 상호 작용을 재구성할 수 있을 뿐만 아니라 종양 내의 지역적 차이를 반영할 수 있는 모델입니다. 이 문서에서는 이러한 요구 사항 중 많은 것을 충족할 수 있는 신흥 플랫폼인 PDEs에 중점을^{둡니다(13)}

또한 조직문화로 알려진 인간 PdEs의 사용의 첫 번째 예는 호프만 등 새로 절제된 인간 종양의 조각을 생성하고 콜라겐 매트릭스^14,15에서배양 할 때 1980 년대 후반으로 거슬러 올라간다. 이것은 조직 건축을 보존하는 3D 배양 시스템을 설치하여 TME 내의 기질 성분 및 세포 상호 작용의 유지를 보장하는 것을 포함했습니다. 원래 종양을 해체하지 않고, 호프만 외¹⁶ 번역 연구의 새로운 접근을 예고하고, 이 시간 이후, 많은 그룹은 조직 무결성을 보존하고 정확한 약물 반응 데이터를 생성하는 것을 목표로 다른 각질 방법을 최적화했다^{17,18,19,21,21,22,23,24} 프로토콜 간의 몇 가지 차이점이 분명하지만. 버틀러 외. 젤라틴 스폰지에서 배양된 박기는^{표본(20,21,25)을}통해 영양분과 약물의 확산을 돕는 반면, Majumder 등은 동일한^{환자로부터}유래된 자가혈류의 존재에서 종양과 기질 단백질로 구성된 매트릭스 위에 박리하여 종양 생태계를^{조성하였다. 23}.

최근에는^{배양시스템(24)의}공기-액체 인터페이스에서 투과성 멤브레인에 추가 성분없이 배치되는^{2-3mm 크기의}크기의 조각으로 종양의 단편화에 의해 각질이 발생하는 프로토콜을 설정하였다. 종합하면, 이러한 수많은 연구는 PDEs가 원래 종양의 공간 건축 과 지역 이질성을 유지하는 인간의 종양의 손상되지 않은 살아있는 단편의 문화를 허용한다는 것을 입증했습니다. 본래 실험에서, 박종 또는 히스토컬은 일반적으로 약물 치료에 따라 균질화를 실시하였다. 그 후 히스토처형 약물 반응^분석20,21,MTT(3-(6)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석, 락테이트 탈수소효소 분석, 또는 레자쥐린 계 의 분석^{26,27,288, 288} . 최근 엔드포인트 분석 기술, 특히 디지털 병리학의 진행은 이제^29,30에서수행 할 수있는 엔드포인트 테스트 및 분석의 레퍼토리를 확장했습니다. 이러한 새로운 기술을 적용하려면 균질화 대신 파라핀(FFPE)에 내장된 후 면역염색 기술을 사용하여 분석하여 공간 프로파일링을 허용합니다. 이러한 접근법의 예는 비소세포폐암(NSCLC), 유방암, 대장암 및 중피종 에 대해 문서화되어 증식 마커, Ki67, 및 세포식 마커, 갈라진 다중 ADP 리보스 폴리모제 폴리머라제(cPARP) 및 세포증식의변화를 모니터링하는 데 사용되었다,^{34, 34,}세포 증식 및^세포증식 및 세포 증식및 세포 증식, 34.

멀티플렉스 면역 형광은 종점^35에서이분야에서 약물 반응의 공간 프로파일링을 위해 특히 순종한다. 예를 들어, 대식세포 나 T 세포와 같은 면역 세포의 특정 클래스의 재현지화 및 공간 분포를 측정할 수 있으며, 약물 치료 시 TME 내에서^13,36,37,38,치료제가 "감기종양"에서 "뜨거운 종양"으로의 전환을 선호할 수 있는지 여부를 조사할 수^있다. . 최근 몇 년 동안, 이 그룹은 다른 종양 유형(NSCLC, 신장암, 유방암, 대장암, 흑색종)과 화학요법, 소분자 억제제 및 면역 체크포인트 억제제(ICI)를 포함한 다양한 항암제의 시험에서 PDE의 파생에 초점을 맞추고 있다. 엔드포인트 분석 방법은 TME의 다른 성분을 위한 바이오마커뿐만 아니라 생존을 위한 바이오마커의 공간 프로파일링을 허용하기 위해 멀티플렉스 면역 형광을 포함하도록 최적화되었습니다.

프로토콜

1. 조직 수집

1. 수술 후, 신선한 배양 배지의 25mL를 포함하는 튜브로 새로 절제된 인간 종양 표본을 옮기고 (덜벡코의 수정된 독수리 배지는 4.5 g/L 포도당및 L-글루타민 + 1% (v/v) 태아 종아리 혈청 + 1% 페니실린-연쇄 절제술)으로 보충하였다. 멸균 클래스 II 후드에서 수술의 2 시간 이내에 식을 처리합니다.

2. Explant 준비

1. 모든 수술 장비(접목 블레이드/치과 왁스 표면/핀셋)를 70% 산업용 메틸화 정신(IMS) 솔루션으로 청소하십시오.
2. 10cm 문화 접시(재료 의 표참조)를 신선한 매체의 ~ 25 mL로 채우고 얼음 침대 위에 놓습니다.
3. 핀셋을 사용하여 시편을 치과 왁스 표면에 옮기고(재료 표참조) 두 개의 피부 이식 블레이드를 사용하여 조직을 약 2-3mm^3mm의 조각으로 자른다.
   참고 : 최상의 성능을 위해, 두께의 2-3mm의 개별 스트립을 얻기 위해 조직을 슬라이스 시작, 다음 최종 각을 얻기 위해 길이를 따라 스트립을 잘라. 전체 표본이 잘려야 할 때까지 과정을 반복합니다.
4. 10cm 접시에 얼음 차가운 배양 매체에 즉시 이식합니다. 이별(6-9개)의 비율을 취하고, 완충되지 않은 포르말린 용액의 10%를 포함하는 1mL 튜브에 배치하고, 24시간 동안 실온(RT)에서 둡니다.
   참고: 이러한 조각은 "배양되지 않은" 조건에 대한 제어 각을 나타냅니다.
5. 6웰 플레이트의 원하는 수의 우물을 웰당 1.5mL의 신선한 배지로 채우고, 배지 위에 띄우기 위해 각 웰에 organotypic 배양 삽입 디스크(재료 표참조)를 배치하여 미디어 인서트 인터페이스에서 기포를 조심스럽게 피하십시오.
6. 무작위로 이절을 선택하고 삽입 디스크 위에 한 번에 하나씩 배치합니다. "배양되지 않은" 상태와 일치하려면 우물당 6-9개의 각경을 사용하십시오. 멀티웰 플레이트를 CO₂ 인큐베이터에 37°C 및 5% CO_2로배치하고, 16시간 동안 익스웰을 회수할 수 있도록 한다.
   참고 : 조직을 분쇄하지 않으려면 핀셋의 부드러운 취급이 좋습니다.

3. 약물 치료

1. 16h 후, 새로운 6웰 플레이트를 가지고, 각 우물에 신선한 매체의 1.5 mL을 추가하고, 원하는 농도에서 관련 약물을 추가하고, 차량 제어에 대한 우물을 포함한다. 핀셋을 사용하여, 약물을 포함하는 새로 준비 된 6 웰 플레이트에 이물질을 포함하는 각 삽입을 이동합니다. 24-48h에 대해 CO₂ 인큐베이터에 플레이트를 37°C, 5% CO_2에 배치합니다.
2. 이전에 포르말린에 고정된 비배양식 된 각종은 히스토로지 카세트 (아래 섹션 4 참조)로 옮기고 실험이 끝날 때까지 70 % IMS에 저장합니다.

4. 조직학적 처리

1. 조직 고정
   1. 약물 치료 후, 10%의 포르말린을 함유한 새로운 6웰 플레이트에 이마를 함유한 삽입 디스크를 옮기고, 10% 포르말린을 각성기 위에 몇 방울 더 추가하여 고정처리로 완전한 커버리지를 보장한다.
      주의: 포르말린은 위험합니다. 피부와의 접촉을 피하고 흡입을 방지하기 위해 연기 식품 내부에 처리하십시오.
   2. 10% 포르말린에서 하룻밤(20-24시간)에 이마를 유지하도록 허용합니다.
   3. 다음 날, 70 % IMS에 작은 히스토로지 스폰지의 관련 번호를 담그고, 히스토로지 카세트 내부에 배치합니다. 주어진 약물 치료 조건에서 모든 각출소를 단일 스폰지로 부드럽게 옮기십시오(삽입 디스크와 접촉하여 각기의 측면이 이식되도록 이분야의 방향을 유지하므로 약물 처리 부위는 스폰지와 접촉하게 됩니다). 또 다른 미리 담근 스폰지를 각성 위에 놓고 조직학 카세트 (우물 / 치료 당 하나의 카세트)내에서 고정하십시오.
   4. 카세트를 70% IMS로 잠그고 RT에서 24시간 동안 그대로 둡니다.
2. 파라핀 포함 및 조직 단면
   1. 다음 날, 티슈 프로세서의 샘플 바구니에 이출을 포함하는 조직학 카세트를 옮기고 뚜껑을 고정한다. 바구니를 레토르트에 놓고 부드럽게 닫습니다. 원하는 프로그램을 선택하고 프로세서를 시작합니다. 레토르트를 빼내고 바구니를 열고 바구니를 포함 센터 왁스 욕조로 옮습니다.
   2. 포함 후 금속 카세트 뚜껑을 바구니에 옮기고 청소 프로그램을 위해 티슈 프로세서의 레토르트로 돌아갑니다. 마른 조직으로 센서를 닦고, 레토르트 뚜껑에서 여분의 왁스를 제거하고 청소 프로그램을 진행합니다.
   3. 회전 마이크로토메에 파라핀 블록을 배치하고, 4 μm에서 몇 개의 섹션을 자르고 블록을 얼음으로 되돌려 놓습니다. 블록을 재배치하고 4 μm 섹션을 더 잘라냅니다. 작은 페인트 브러시로 섹션을 옮기고 물 욕조에 집게하여 주름과 거품을 제거합니다.
   4. 섹션을 현미경 슬라이드에 중앙집중적으로 배치하고, 슬라이드를 몇 분 동안 배수하고, 37°C의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 건조하도록 슬라이드 랙에 넣습니다. 섹션이 건조하면 먼지로부터 보호하기 위해 슬라이드 폴더 또는 상자에 RT에 저장합니다.

5. 헤마톡클린과 에신(H&E) 염색

1. 스테니머를 시약으로 채우고 H&E 염색에 필요한 프로그램을 설정하십시오: 헤마톡시린 인큐베이션 시간: 5분; 에오신 인큐베이션 시간 : 3 분.
2. 슬라이드 랙을 캐리어에 부착하고 자일렌으로 첫 번째 용기에 넣고 프로그램을 시작합니다. 랙에서 슬라이드 캐리어를 제거하고 슬라이드 랙을 장착한 용기에 장착 영역으로 이동합니다.
3. 추출 후드 아래에 디부틸 프탈레이트 자일렌(DPX)으로 슬라이드를 장착합니다. DPX를 각 커버슬립에 놓고 아래쪽으로 슬라이드를 커버슬립에 내리면 DPX가 확산됩니다.
   참고: DPX는 위험합니다. 피부와의 접촉을 피하고 지정된 연기 후드에 사용하십시오.

6. 면역 염색

참고: 달리 명시되지 않는 한 다음 단계는 RT에서 수행해야 합니다.

1. 분리및수분화
   1. 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓고 65°C에서 10분 동안 가열한 후 자일렌의 섹션을 3분(2배)으로 분리합니다. 이월 솔루션의 양을 최소화합니다.
      참고: 자일렌은 인화성, 위험, 자극제입니다. 이중 레이어 장갑을 사용하는 동안 연기 후드 내부를 처리합니다. 피부와 눈접촉을 피하십시오. 밀봉된 용기 내에서 폐기물을 폐기합니다.
   2. 다음과 같이 알코올 그라데이션에서 슬라이드를 재수화하십시오: 1분(2배) 99% IMS, 1분 동안 95% IMS. 이월 솔루션의 양을 최소화합니다.
      참고: IMS는 인화성, 휘발성 및 자극성이 높습니다. 연기 후드 내부를 처리하고 피부와 눈접촉을 피하십시오.
   3. 슬라이드 랙을 초순수(UP) 물에 5분 동안 완전히 담급니다.
2. 항원 회수
   1. 사용되는 특정 항체에 대한 제조업체의 지침에 따라 항원 회수 버퍼를 준비한다.
      참고: 구연산 완충액 0.2M, pH 6, 또는 트리스(hydroxymethyl) 아미노메탄(Tris)-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA) 0.1M, pH 9는 각각 산성 또는 알칼리성 조건에 사용되는 일반적인 완충제이다. 구연산 모노하이드레이트 및 트리스는 자극제입니다. 연기 후드에 모든 스톡 솔루션을 준비합니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오.
   2. 슬라이드를 함유한 랙을 항원 검색 버퍼로 잠급하고, 전자레인지(재료 표참조)를 20분 동안 완전 전력(800W)으로 잠급니다.
      참고: 전체 프로세스 중에 슬라이드가 버퍼에 완전히 잠긴 상태로 유지됩니다. 버퍼 볼륨의 과도한 감소를 방지하기 위해 사용되는 컨테이너 위에 뚜껑을 놓습니다.
3. 멀티플렉스 면역형광 (mIF)
   참고: 이 프로세스는 1-2일이 소요됩니다.
   1. 깨끗한 용기를 UP 워터 250mL로 채우고 슬라이드 랙을 2분(2배)에 완전히 담급니다. 슬라이드 커버플레이트에 각 슬라이드를 조립하여 진행합니다(재료 표참조).
      1. 슬라이드를 커버플레이트에 조립하려면 유리 통을 물로 준비합니다. 커버플레이트를 모두 물에 담그고 물에 밀어 넣고, 조직 섹션 측이 커버플레이트를 향하게 한다.
      2. 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 커버플레이트 하단의 프로튜브랜스 위에 배치하고 슬라이드를 커버플레이트에 정렬하여 공기가 갇히지 않고 물이 간격을 채울 수 있도록 합니다. 커버플레이트를 잡고 함께 밀어 커버플레이트 랙에 넣습니다.
   2. 커버플레이트를 인산염 완충식식염(PBS)으로 채우고 버퍼가 슬라이드를 씻을 때까지 기다렸다가 중력(2배)으로 흘러나온다. 각 커버플레이트에 110 μL의 블로킹 버퍼(재료 표참조)를 10분 동안 배양합니다.
   3. 제조 업체의 권고에 따라 PBS 또는 차단 버퍼에서 원하는 1 차 적인 항체 희석을 준비 합니다. 슬라이드를 1차 항체(각 슬라이드 110μL)로 30분 동안 배양합니다. 6.3.2에 설명된 바와 같이 PBS(2x)의 5mL로 슬라이드를 세척합니다.
   4. 고추냉이 과산화효소 폴리머 110 μL로 슬라이드를 30분 동안 배양합니다. 6.3.2에 설명된 바와 같이 PBS(2x)의 5mL로 슬라이드를 세척합니다.
   5. 증폭 희석제 1:100(v/v)에서 플루오로포레 희석을 준비하고, 슬라이드를 불소로호레(각 슬라이드 110μL)로 10분 동안 배양한다. 6.3.2에 설명된 바와 같이 PBS(2x)의 5mL로 슬라이드를 세척합니다.
      참고: 플루오로포레 780을 사용하십시오. 이 실험은 슬라이드가 PBS의 최종 세척에서 배양되어 하룻밤 사이에 4°C에 저장되는 경우 여기서 일시 중지될 수 있다.
   6. 커버플레이트에서 슬라이드를 풀고 항원 검색 단계로 돌아가 다른 항체로 염색을 시작합니다. 시험할 항체의 원하는 수에 대한 염색을 반복한다.
   7. 마지막 불소호레에 대한 6.3.5 단계에 따라, 커버플레이트에 슬라이드를 유지하고, 4'-6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)의 6μM 용액을 UP 워터로 틸락테이트하고, 슬라이드를 5분(각 슬라이드 110μL)에 카운터스테인한다. 슬라이드를 UP 물(2배)으로 씻고 슬라이드의 가장자리를 건조시켜 과도한 물을 제거합니다. 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드의 커버립을 조립하고 어두운 시간에 RT에 저장합니다.

7. 스캔

참고: 슬라이드 스캐닝은 다중 스펙트럼 자동화 이미징 시스템을 사용하여 수행되었습니다(재료 표참조).

1. 슬라이드를 캐리어에 조립하고 원하는 순서로 스캐너에 로드합니다.
   참고: 면역히스토케미칼 염색 중에 불소또는 DAPI가 사용되지 않는 대조군 슬라이드를 포함하는 것이 좋습니다. 이 슬라이드는 조직의 본질적인 식물성 (자동 형광 (AF)에 대한 제어로 사용됩니다.
2. 슬라이드 스캐너 소프트웨어를 시작한 후 홈 페이지에서 프로토콜 편집을 선택합니다. 이름, 이미징 모드,수행될 다중 스펙트럼 검사의 유형(4-7채널) 및 스터디(디렉터리)를 해결하는 새로운프로토콜을만듭니다.
   참고: 분석된 대역의 기본 설정을 수정하려면 스캔 대역 선택 함수를 사용하여 원하는 필터를 선택/선택 해제합니다.
3. 스캔 노출 및 로드 캐리어를진행하고 프로토콜 설정에 대한 캐리어를 마지막으로 선택합니다. 슬라이드에서 조직을 감지하려면 개요를 선택합니다. 캐리어에표시된 슬라이드를 선택하고 빨간색 커서가 있는 조직의 특정 영역을 선택하여 화면왼쪽 창에서 라이브 뷰로 가져옵니다.
4. DAPI 필터를선택하고 자동 초점을 클릭하거나 스테이지 높이 슬라이더를 수동으로 조정하여 관심 분야에 집중합니다. 자동 노출을 클릭하여 시스템이 해당 필터/대역에 가장 적합한 노출을 찾을 수 있도록 합니다.
   참고: 각 필터의 노출 시간은 12ms로 설정됩니다. 시스템을 자동으로 노출한 후 노출 시간을 더 나은 추정으로 수정합니다. 또한 강조 표시된 셀에 값을 수동으로 입력하여 자동 노출 값을 재정의할 수도 있습니다.
5. 프로토콜의 모든 필터에 대해 위의 단계를 반복합니다. 필요한 경우 위치 및/또는 슬라이드를 변경하여 노출을 설정하는 데 가장 적합한 신호를 찾습니다.
   참고: 조직이 라이브 뷰에서 빨간색으로 강조되면 분석된 필터의 형광 신호가 포화되고 자동 노출이 반복되어야 합니다.
6. 노출 설정이 설정되면 뒤로 단추를 클릭하고 프로토콜을 저장합니다. 소프트웨어 홈 페이지에서(재료 표참조)에서 슬라이드 스캔을 선택합니다.
7. 슬라이드 캐리어 호텔에스캔할 모든 이동통신사를 스택하고 슬라이드 순서를 기록하여 ID를 시스템에 할당합니다.
   참고: 소프트웨어 화면에서 각 이동통신사는 4개의 슬라이드가 포함된 슬롯과 관련이 있습니다.
8. 동일한 매개 변수로 여러 슬라이드를 구성하려면 작업 구성을클릭하고 동일한 슬라이드에 대해 동일한 규칙을 노래하는 옵션 U가있는 하나 이상의슬롯을 선택합니다. 편집 슬라이드가 열리면 작업, 연구및 프로토콜을구성하고 확인을 클릭합니다.
9. 슬롯 아이콘을 클릭하여 각 슬라이드에 레이블을 지정하고 슬라이드 ID 셀에 이름을 입력합니다. 스캔을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
   참고: 슬롯 아이콘이 파란색으로 바뀌고 슬라이드가 파란색 화살표로 표시되면 이동통신사에 모든 규칙이 있으며 스캔할 준비가 되었습니다. 저장 설정 버튼을 클릭하여 슬라이드 I, 스터디, 프로토콜 및 작업을 저장할 수 있습니다.

8. 분석

참고: 아래 프로토콜은 표현형 분석 방법을 보여 줍니다.

1. 이미지 준비
   1. 분석을 위해 이미지를 준비하려면 뷰어 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 로드 슬라이드를 선택합니다. 화면 오른쪽에 있는 교육 프로젝트에 원하는 스캔을 선택합니다.
   2. 각 검사에 대해 스탬프를클릭하고 선택 상자에서 프로젝트를 선택합니다: 나중에 학습 분석을 위한 템플릿으로 사용할 이미지 필드에 크기 1 x 1이 있는 스탬프를 정의합니다. 이 스탬프가 빨간색 사각형으로 표시됩니다.
      참고: 프로젝트의 스탬프 주석 수는 임의적입니다. 내장형 형광 스캔용 검사용및 조직 내의 신호 분포를 일반적으로 대표하는 몇 가지 더 생성하는 것이 좋습니다.
   3. 마지막으로 실험의 모든 스캔을 엽니다. 각 스탬프에 대해 스탬프를클릭하고 이번에는 선택 상자에 배치 옵션을 선택합니다: 각 구독을 할례하는 스탬프를 배치합니다.
      참고: 이번에는 스탬프가 녹색 사각형으로 표시되며 일괄 분석이 시작되면 필요합니다. 스탬프(1 x 1, 2 x 2, 3 x 3)에 적합한 크기를 선택하고 내보낸 파일에 중복된 데이터를 생성하는 스탬프의 겹치지 않도록 합니다.
2. 교육 분석
3. 분석을 위한 소프트웨어를 실행하고(재료 표참조) 새 프로젝트를 만듭니다: 파일 | 선택 새로운 | 프로젝트.
4. 프로젝트 이름 상자에 이름을 입력하고 프로젝트 유형을 구성합니다.
   참고: 실험은 다음과 같은 사양을 사용하여 수행하였다: 훈련 가능한 조직 세분화; 적응형 세포 세분화; 페노티핑.
5. 스탬프가 포함된 스캔로드: 파일 | 오픈 | 이미지. 단일 모드 보기에서이미지를 탐색하고 본질적인 형광으로 스캔을 선택합니다.
6. 자동 불발성 (AF) 버튼을 클릭하고, 자동 불피성 피커와함께, 조직의 얼룩없는 부분에 그립니다. 소프트웨어가 교육을 위해 업로드된 모든 이미지에서 본질적인 형광의 강도를 빼도록 이미지 준비를 클릭합니다.
7. 마커 편집 버튼과 색상 편집 버튼을 클릭하고 불소와 연결된 상자에 마커 이름을 입력합니다. 화면 상단의 세그먼트 조직 단계를 클릭하여 조직 세분화 훈련 창을 엽니다.
8. 조직 범주 창에서, 조직 범주의 이름을 입력하여 이미지를 세그먼트로 분류합니다(예를 들어, 종양, 스트로마, 배경, 괴사).
9. 조직 세분화 훈련 창에서 그리기 버튼을 클릭하고 셀 그룹 주위에 영역을 그려 관심 있는 조직 범주를 정의합니다. 예를 들어 종양 영역을 정의하려면 종양 세포 그룹 주위에 영역을 그립니다. 다음 범주로 전환하고 도면 프로세스를 반복합니다.
   참고: 교육을 위해 업로드된 대부분의 이미지에서 영역을 그리는 것이 좋습니다. 또한 패턴 배율 과 사용자 설명서에 세부 정보가 더 잘 설명된 세분화 해상도를 편집하여 교육을 구체화할 수도 있습니다.
10. 훈련 영역을 정의 한, 조직 세그먼트를 훈련진행.
    참고: 훈련 과정에서 소프트웨어는 조직 세분화의 정확도 비율을 표시합니다. 최적의 결과를 위해 조직 세분화가 최소 90% 정확해야 합니다. 세그먼트가 안정화되면 완료 단추를 클릭합니다.
11. 모든 이미지에서 조직 범주 마스크를 보려면 세그먼트 모든 버튼을 클릭합니다.
12. 조직 세분화의 품질을 확인한 후 잘못 분류된 영역 주변의 훈련 영역을 다시 끌어들이고 프로세스가 성공할 때까지 조직 세그먼트를 다시 훈련시합니다.
13. 창을 맨 위에 있는 스텝 바의 셀 세분화 단계를 클릭하여 분석을 진행합니다.
14. 핵, 세포질및/또는 멤브레인 : 세그먼트셀 링크를 선택합니다.
    참고: 적응형 세포 세분화는 핵 신호로만 세포를 감지할 수 있기 때문에 핵을선택 해제하지 마십시오. 세포질 및/또는 멤브레인을 분할하는 것도 가능하지만 가장 강력하고 풍부한 핵 성분(예: DAPI)을 선택하는 것이 좋습니다.
15. 일반적인 강도 슬라이더를 사용하여 핵 구성 요소를 구성하여 핵 픽셀을 감지하는 데 사용되는 임계값을 조정합니다. 임계값이 조정될 때 열리고 실시간 피드백을 제공하는 미리 보기 창을 기록합니다.
    참고: 이 임계값은 적응형이며 주변 배경에 따라 측정됩니다. 너무 많은 배경이 핵으로 감지되면이 값을 늘립니다. 희미한 핵이 놓치면 이 값을 낮춥습니다. 영역 표시/숨기기 버튼을 사용하여 세분화 마스크를 켜고 끌 수 있으며 올바른 픽셀이 핵으로 감지되고 있는지 확인합니다.
16. 핵 픽셀 의 클러스터를 분할하려면 핵 구성 요소 분할 패널을 사용합니다. 핵의 염색 품질을 가장 잘 설명하는 버튼을 선택합니다. 그런 다음 슬라이더 막대를 사용하여 분할 감도를조정하여 값이 낮으면 더 많이 분할됩니다.
17. 모든 이미지를 분할하려면 세그먼트 모든 버튼을 클릭합니다. 결과가 정확하지 않은 경우 설정을 수정하고 만족스러운 세분화가 이루어질 때까지 소프트웨어를 다시 학습합니다.
18. 분석의 마지막 단계로 진행: Phenotyping. 표현형 패널에서 감지할 표현형 목록을 추가하고 해당 텍스트 상자에 이름을 입력합니다. 표현형 편집 버튼을 클릭하고 특정 셀을 선택하여 드롭다운 메뉴를 가져오고 해당 표현형을 선택합니다.
    참고: 각 표현형에 대해 최소 5개의 세포가 분류기를 훈련하는 데 필요합니다. 핵의 시각화를 끄면 할당해야 하는 세포 표현형의 더 나은 시각화가 가능합니다.
19. 교육 선택이 완료되면 기차 분류기 버튼을 클릭합니다.
    참고: 소프트웨어는 이미지의 모든 단일 셀을 분류하고 분류오류가 발생할 때마다 셀의 표현형을 편집하고 분류자의 교육을 반복할 수 있습니다. 일괄 분석을 진행하기 전에 프로젝트를 저장하고 화면 상단의 도구 막대에서 내보내기를 클릭합니다.
20. 왼쪽 메뉴의 배스 분석 탭을 선택하고 배치 알고리즘 또는 프로젝트 상자에 프로젝트를 로드합니다.
21. 내보내기 옵션을 클릭하여 각 이미지에 대해 별도의 디렉터리를 만들고 찾아보기 버튼을 사용하여 데이터를 내보낼 위치를 찾습니다. 내보낼 이미지와 테이블의 모든 옵션을 클릭합니다.
22. 화면 오른쪽에 슬라이드 추가를 클릭하고 이전에 준비된 배치(7.3단계)에 스탬프가 포함된 모든 이미지를 로드합니다. 실행 버튼을 클릭하여 일괄 처리를 시작하고 한 번에 하나의 스탬프를 처리하여 해당 데이터를 내보냅니다.

결과

mIF 염색 조직학적 섹션의 다중 스펙트럼 이미징은 개별 세포 집단의 식별 및 phenotyping을 허용하고 각성 TME에서 종양 및 기질 성분의식별(도 2). 다중 스펙트럼 이미징은 높은 내재성 자동 불발력을 가진 조직의 분석에 특히 유용하며, 이는 자동 불피 신호가 다른 신호로부터 감속되고 후속 분석에서 제외될 수 있기 때문에 높은 콜라겐 함량을 가진 조직과 같은 조직분석에 특?...

토론

이 논문은 PdEs의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명하고 전임상 모델 시스템으로 플랫폼의 장점을 강조합니다. 그 분해를 포함하지 않는 갓 절제된 종양의 전 생체 배양은 종양^{아키텍처(13,24)의} 보존을 허용하므로 TME의 세포 성분의 공간 상호 작용뿐만 아니라 종양 내 이질성. 이 방법은 종양 특이적 마커를 사용하여, 스트로마 영역대 종양 조?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma	320099	Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x	Perkin Elmer	ARD1001EA	Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond	Barnstead		Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate	Sigma-Aldrich	C7129	Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates	Corning Incorporated	3516	6 multiwell plate
DAPI Dilactate	Life Technologies	D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350	100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate	Gibco (Life Technologies)	10569-010	Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant	VWR	360294H	Mounting medium
DPX mountant	Merck	6522	Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	Reagent for TE buffer
Eosin	CellPath	RBC-0100-00A	Staining reagent
Foetal Bovine Serum	Gibco	10500-064	For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde	Fisher (Acros)	119690010	10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095	iGenix	IG2095	Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)	Genta Medical	199050	99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software	Akoya Biosciences	InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor	Leica Biosystems		Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C	Leica Biosystems		Embedding wax bath
Leica RM2125RT	Leica Biosystems		Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer	Leica Biosystems		H&E stainer
Mayer's Haematoxylin	Sigma	GHS132-1L	Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Merck Milipore	PICMORG50	Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System	Leica Biosystems	RE7150-K	DAB staining kit
OPAL 480	Akoya Biosciences	FP1500001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent	Akoya Biosciences	FP1501001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x	Perkin Elmer	ARH1001EA	HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution	Fisher Scientific	11548876	For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer	Akoya Biosciences	PhenoChart	Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets	Thermo Scientific Oxoid	BR0014G	PBS
1x Plus Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36961	Mounting medium
Slide Carrier	Perkin Elmer		To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S/3160/63	10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets	Fisher Scientific	S/4920/53	Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)	KEMDENT	1-601	Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center	Fisher Scientific	10098889	Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates	Fisher Scientific	11927774	Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	252859	Reagent for TE buffer
VectaShield	Vecta Laboratories	H-1000-10	Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner	Perkin Elmer	Vectra Polaris	Slide scanner
Xylene	Genta Medical	XYL050	De-waxing agent