患者源性肿瘤外植体作为预测患者耐药性的"实时"临床前平台

摘要

本文描述了在实时的、与患者相关的临床前模型系统中评估肿瘤药物反应的患者来源的外植体的生成、药物治疗和分析方法。

摘要

对耐药性的理解和开发对高度耐药性癌症致敏的新策略依赖于能够准确预测患者反应的合适临床前模型的可用性。现有临床前模型的缺点之一是无法在上下文中保留人类肿瘤微环境（TME）并准确表示肿瘤内异质性，从而限制了数据的临床翻译。相比之下，通过表示人类肿瘤活片段的培养物，患者来源的外植体（PDE）平台允许在三维（3D）环境中检查药物反应，该上下文尽可能密切地反映原始肿瘤的病理和结构特征。先前的PDE报告已经记录了该平台区分化学敏感性和化学抵抗性肿瘤的能力，并且已经表明这种分离可以预测患者对相同化疗的反应。同时，偏微分方程允许有机会询问预测药物反应的肿瘤的分子，遗传和组织学特征，从而确定用于患者分层的生物标志物以及使耐药性肿瘤致敏的新型介入方法。本文详细介绍了PDE方法，从患者样本的收集到终点分析。它提供了外植体衍生和培养方法的详细说明，在适当的情况下突出了特定肿瘤的定制条件。对于终点分析，重点是多重免疫荧光和多光谱成像，用于肿瘤和基质区域内关键生物标志物的空间分析。通过结合这些方法，可以生成定量和定性的药物反应数据，这些数据可能与各种临床病理学参数相关，因此可能用于生物标志物鉴定。

引言

开发有效和安全的抗癌药物需要适当的临床前模型，这些模型还可以深入了解作用机制，从而促进预测和药效学生物标志物的鉴定。已知肿瘤间和肿瘤内异质性1，2，3，4，5和TME 6，7，8，9，10，11，12影响抗癌药物反应，许多现有的临床前癌症模型，如细胞系，类器官和小鼠模型，无法完全适应这些至关重要的特征。"理想"模型可以概括肿瘤内恶性细胞与非恶性细胞的复杂空间相互作用，并反映肿瘤内的区域差异。本文重点介绍 PDE 作为可以满足其中许多要求的新兴平台¹³.

使用人类偏微分方程（也称为组织培养）的第一个例子可以追溯到20世纪80年代后期，当时霍夫曼等人产生了新鲜切除的人类肿瘤切片并将其培养在胶原蛋白基质^14，15中。这涉及建立一个保留组织结构的3D培养系统，确保维持TME内的基质成分和细胞相互作用。在不解构原始肿瘤的情况下，Hoffman等人¹⁶预示着一种新的转化研究方法，从那时起，许多研究小组已经优化了不同的外植体方法，目的是保持组织的完整性并产生准确的药物反应数据17，18，19，20，21，22，23，24，尽管协议之间存在一些明显的差异。Butler等人在明胶海绵中培养外植体，以帮助营养物质和药物通过标本^20，21，25扩散，而Majumder等人通过在存在来自同一患者的自体血清的情况下，在由肿瘤和基质蛋白组成的基质上培养外植体来创建肿瘤生态系统^{22， 23}.

最近，我们的小组建立了一个方案，通过将肿瘤碎片化成2 - 3 mm³大小的块来生成外植体，然后在培养系统²⁴的气液界面处的可渗透膜上放置没有附加组分。综上所述，这些大量研究表明，偏微分方程允许培养完整的活体人类肿瘤片段，这些片段保留了原始肿瘤的空间结构和区域异质性。在原始实验中，外植体或组织培养通常在药物治疗后进行均质化，之后对均质化样品进行各种活力测定，例如组织培养药物反应测定20，21，MTT（3-（6）-2，5-二苯基四唑溴化物测定，乳酸盐脱氢酶测定或基于刃天青的测定26，27，28.终点分析技术的最新进展，特别是数字病理学，现在已经扩大了可以在外植体29，30上进行的终点测试和测定的库^。为了应用这些新技术，将外植体固定在福尔马林中，嵌入石蜡（FFPE），然后使用免疫染色技术进行分析，而不是均质化，从而进行空间分析。这种方法的例子已经记录在非小细胞肺癌（NSCLC），乳腺癌，结直肠癌和间皮瘤外植体中，其中免疫组织化学染色增殖标志物Ki67和凋亡标志物，切割的聚ADP核糖聚合酶（cPARP），用于监测细胞增殖和细胞死亡的变化24，31，32，33，34。

多重免疫荧光特别适合于在终点³⁵处对外植体中的药物反应进行空间分析。例如，在药物治疗^{13，36，37，38}时，可以测量TME内特定类别的免疫细胞（如巨噬细胞或T细胞）的重新定位和空间分布，并研究治疗剂是否可以有利于从"冷肿瘤"到"热肿瘤"^的转变39.近年来，该小组专注于从不同肿瘤类型（NSCLC，肾癌，乳腺癌，结直肠癌，黑色素瘤）中提取PDEs，并测试一系列抗癌药物，包括化疗，小分子抑制剂和免疫检查点抑制剂（ICI）。终点分析方法已经过优化，包括多重免疫荧光，允许对生物标志物进行空间分析，以实现生存能力以及TME不同成分的生物标志物。

研究方案

1. 组织收集

1. 手术后，将新鲜切除的人肿瘤标本转移到含有25mL新鲜培养基（Dulbecco的改良Eagle培养基，补充有4.5g / L葡萄糖和L-谷氨酰胺+ 1%（v / v）胎儿小牛血清+ 1%青霉素 - 链霉素）的管中，并储存在冰上。在手术后2小时内在无菌II级罩中处理外植体。

2. Explant制备

1. 用70%工业甲基化精神（IMS）溶液清洁所有手术设备（移植物刀片/牙蜡表面/镊子）。
2. 在10厘米的培养皿（见 材料表）中加入约25毫升的新鲜培养基，并将其放在冰床上。
3. 使用镊子将标本转移到牙蜡表面（见 材料表），并使用两个皮肤移植刀片将组织切成约2-3mm³ 的碎片。
   注意:为了获得最佳性能，开始切片组织以获得厚度为2-3mm的单个条带，然后沿着长度切割条带以获得最终的外植体。重复该过程，直到整个试样被切碎。
4. 将外植体迅速转移到10厘米培养皿中的冰冷培养基中。取一定比例的外植体（6-9片），将它们置于含有10%非缓冲福尔马林溶液的1mL管中，并在室温（RT）下放置24小时。
   注意:这些片段将代表"未培养"条件的对照外植体。
5. 用每孔1.5 mL新鲜培养基填充所需数量的6孔板孔，并在每个孔中放置一个有机型培养插入盘（见 材料表），使其漂浮在培养基顶部，小心避免介质插入界面处的气泡。
6. 随机选择外植体，然后一次将一个外植体放在插入光盘的顶部。为了与"未培养"条件一致，每孔使用6-9个外植体。将多孔板置于37°C和5%CO₂ 的CO₂培养箱中，并允许外植体回收16小时。
   注意:为避免压碎组织，强烈建议轻柔地处理镊子。

3. 药物治疗

1. 16小时后，取新的6孔板，向每个孔中加入1.5mL新鲜培养基，以所需浓度加入相关药物，并包括用于载体控制的孔。使用镊子，将每个含有外植体的插入物移动到新制备的含有药物的6孔板中。将板置于CO₂ 培养箱中，在37°C和5%CO₂ 下放置24-48小时。
2. 将先前固定在福尔马林中的未培养的外植体转移到组织学盒中（见下文第4节），并储存在70%IMS中直至实验结束。

4. 组织学处理

1. 组织固定
   1. 药物治疗后，将含有外植体的插入盘转移到含有10%福尔马林的新6孔板中，并在外植体的顶部加入几滴10%福尔马林，以确保完全覆盖固定剂。
      注意:福尔马林是有害的。避免与皮肤接触，并将其置于烟雾食品中以防止吸入。
   2. 让外植体在10%福尔马林中停留过夜（20-24小时）。
   3. 第二天，将相关数量的小组织学海绵浸泡在70%的IMS中，并将它们放入组织学盒中。轻轻地将来自给定药物治疗条件的所有外植体转移到单个海绵上（保持外植体的方向，以便外植体的侧面与插入盘接触，因此药物处理区域与海绵接触）。将另一个预浸泡的海绵放在外植体的顶部，并固定在组织学盒（每个孔/处理一个盒）中。
   4. 将盒子浸没在70%的IMS中，并在室温下放置24小时。
2. 石蜡包埋和组织切片
   1. 第二天，将含有外植体的组织学盒转移到组织处理器的样品篮中（见 材料表），并盖上盖子。将篮子放入蒸馏器中，轻轻关闭。选择所需的程序，然后启动处理器。沥干蒸馏器，打开它以取出篮子，然后将篮子转移到嵌入中心蜡浴中。
   2. 嵌入后，将金属盒盖转移到篮子中，然后返回组织处理器的蒸馏器进行清洁程序。用干纸巾擦拭传感器，从蒸馏器盖上除去任何多余的蜡，然后继续清洁程序。
   3. 在旋转切片机中放置一个石蜡块，以4μm切割几段，然后将块返回冰。重新定位块，并切割更多的4μm切片。用小画笔和镊子将切片转移到水浴上以去除折痕和气泡。
   4. 将切片集中放置在显微镜载玻片上，排空载玻片几分钟，然后将其放入载玻片架中，在37°C的培养箱中干燥过夜。 当切片干燥时，将它们存放在RT处的幻灯片文件夹或盒子中，以防止灰尘。

5. 苏木精和曙红（H&E）染色

1. 用试剂填充染色剂（见 材料表），并设置H&E染色所需的程序:苏木精孵育时间:5分钟;曙红孵育时间:3分钟
2. 将滑动架连接到托架上，将其放入装有二甲苯的第一个容器中，然后开始程序。从机架上卸下滑块托架，然后将装有滑动架的容器带到安装区域。
3. 将载玻片与邻苯二甲酸二甲酸二甲苯二丁酯（DPX）一起安装在抽油烟机下。将 DPX 放在每个盖玻片上，然后将载玻片放到盖玻片上，使该部分向下，使 DPX 展开。
   注意:DPX 是危险的。避免与皮肤接触，并在指定的通风橱中使用。

6. 免疫染色

注意:除非另有说明，否则应在RT执行以下步骤。

1. 脱蜡和补液
   1. 将载玻片置于载玻片架中，并在65°C下加热10分钟，然后在二甲苯中使切片脱蜡3分钟（2x）。最大限度地减少结转溶液的数量。
      注意:二甲苯易燃、危险且刺激。使用双层手套时将提防烟罩内。避免皮肤和眼睛接触。将废物丢弃在密封容器内。
   2. 以如下醇梯度重新水合载玻片:99%IMS持续1分钟（2x）和95%IMS持续1分钟。最大限度地减少结转溶液的数量。
      注意:IMS具有高度易燃性，挥发性和刺激性。处理通风橱内部，避免皮肤和眼睛接触。
   3. 将载玻片架完全浸入超纯（UP）水中5分钟。
2. 抗原检索
   1. 根据制造商针对所用特定抗体的指南制备抗原检索缓冲液。
      注:柠檬酸盐缓冲液0.2 M，pH 6或 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）-乙二胺四乙酸（EDTA）0.1M，pH 9分别是用于酸性或碱性条件的常用缓冲液。柠檬酸一水合物和Tris是刺激剂。在通风橱中准备所有库存溶液。避免接触皮肤和眼睛。
   2. 将含有载玻片的支架浸入抗原检索缓冲液中，并以全功率（800 W）微波（参见 材料表）20分钟。
      注意:在整个过程中，请将载玻片完全浸没在缓冲液中。为避免过度减少缓冲液体积，请在所用容器的顶部盖上盖子。
3. 多重免疫荧光
   注意:此过程需要 1-2 天。
   1. 用250 mL UP水填充干净的容器，并将载玻片架完全浸入水中2分钟（2x）。继续将每张幻灯片组装成幻灯片盖板（请参见 材料表）。
      1. 要将载玻片组装到盖板上，请准备一个装有水的玻璃槽。将盖板和滑块浸入水中，将组织切片面朝向盖板。
      2. 将滑块的底部边缘放在盖板底部的突起顶部，最后将滑块与盖板对齐，使水填充中间的间隙，而不会捕获空气。握住盖板并一起滑动，然后将其放在盖板架中。
   2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充盖板，并等待缓冲液冲洗载玻片，通过重力（2x）流出。将110μL封闭缓冲液（见 材料表）移液到每个盖板上并孵育10分钟。
   3. 根据制造商的建议，在PBS或封闭缓冲液中制备所需的一抗稀释液。用一抗（每张载玻片110μL）孵育载玻片30分钟。用 5 mL PBS （2x） 清洗载玻片，如 6.3.2 中所述。
   4. 用110μL辣根过氧化物酶聚合物孵育载玻片30分钟。用 5 mL PBS （2x） 清洗载玻片，如 6.3.2 中所述。
   5. 在扩增稀释剂1:100（v / v）中制备荧光团稀释液，并用荧光团（每张载玻片110μL）孵育载玻片10分钟。用 5 mL PBS （2x） 清洗载玻片，如 6.3.2 中所述。
      注:对于荧光团780的使用，请遵循制造商的指南。如果载玻片在PBS的最终洗涤中孵育并在4°C下储存过夜，则可以在此处暂停实验。
   6. 从盖板上松开载玻片，然后返回抗原检索步骤，开始使用其他抗体染色。重复染色以检测所需数量的抗体。
   7. 对于最后使用的最后一个荧光团，按照步骤6.3.5，将载玻片保持在盖板上，用UP水制备6μM的4'-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）扩张剂溶液，并将载玻片复染5分钟（每张载玻片110μL）。用UP水（2x）清洗载玻片，并通过干燥载玻片的边缘去除多余的水。使用安装介质组装载玻片上的盖玻片，并在黑暗中以 RT 方式存放。

7. 扫描

注:玻片扫描是使用多光谱自动成像系统进行的（参见 材料表）。

1. 将载玻片组装到托架中，然后按所需顺序将其装入扫描仪。
   注意:建议包括对照载玻片，其中在免疫组化染色期间不使用荧光团或DAPI。该载玻片将用作组织内在荧光（自发荧光（AF））的控制。
2. 启动玻片扫描仪软件后，从主页中选择"编辑协议"。创建一个新的协议，以解决名称，成像模式，要执行的多光谱扫描类型（4-7个通道）和研究（目录）。
   注:要修改所分析波段的默认设置，请使用选择扫描波段功能选择/取消选择所需的滤光片
3. 继续扫描曝光和载波，最后选择协议设置的载波。选择"获取概述"以检测载玻片上的组织。选择载体上显示的幻灯片，然后用红色光标选择组织的特定区域，以将其带入屏幕左侧窗口的实时视图。
4. 选择 DAPI 滤镜，然后单击" 自动对焦 "或手动调整" 舞台高度"滑块 以聚焦感兴趣字段。单击" 自动曝光" 以允许系统找到该滤镜/波段的最佳曝光。
   注:每个滤镜的曝光时间设置为12毫秒。自动曝光系统后，将曝光时间细化为更好的估计值。还可以通过在突出显示的单元格中手动键入值来覆盖自动曝光值。
5. 对协议中的所有筛选器重复上述步骤。如有必要，请更改位置和/或幻灯片，以找到用于设置曝光的最佳信号。
   注:如果在实时取景中组织以红色突出显示，则分析滤光片的荧光信号饱和，必须重复自动曝光。
6. 建立曝光设置后，单击" 后退 "按钮，然后 保存 协议。从 软件主页（请参阅 材料表）中，选择 扫描幻灯片。
7. 将要扫描的所有载具堆叠到 幻灯片载体酒店中，并记下幻灯片的顺序以将其ID分配到系统中。
   注:在软件屏幕上，每个托架将与包含 4 张幻灯片的插槽相关。
8. 要配置具有相同参数的多张幻灯片，请单击"配置任务"，然后选择一个或多个"插槽"，并带有"U为同一幻灯片唱相同规则"选项的"插槽"。打开"编辑幻灯片"后，配置:"任务"、"研究"和"实验方案"，然后单击"确定"。
9. 通过单击" 插槽 "图标为每张幻灯片添加标签，然后在" 幻灯片 ID" 单元格中键入名称。单击" 扫描 "开始扫描。
   注:一旦 插槽 图标变为蓝色，并且幻灯片用蓝色箭头标记，则托架具有所有规则并准备好进行扫描。可以通过单击" 保存设置 "按钮来保存幻灯片 ID、研究、实验方案和任务。

第8章 分析

注:以下方案说明了表型分析的方法。

1. 图像准备
   1. 要准备图像以进行分析，请打开查看器软件（请参见 材料表），然后选择 加载幻灯片。在屏幕右侧为训练项目选择所需的扫描件。
   2. 对于每次扫描，单击Stamp，然后在"选择:在图像字段中定义大小为 1 x 1 的图章，以便以后用作训练分析的模板"框中选择项目。请注意，此邮票将被标记为红色方块。
      注:项目的图章注释数量是任意的。建议为固有荧光扫描生成一个，并生成一些通常代表组织内信号分布的荧光扫描。
   3. 最后，打开实验的所有扫描。对于每个，单击"戳记"，这次，在"选择:放置限制每个外植体的图章"框中选择"批处理"选项。
      注意:这一次，图章将标记为绿色方块，一旦启动批量分析，这些图章将需要。为图章选择适当的大小（1 x 1、2 x 2、3 x 3），并避免图章重叠，这将在导出的文件中生成重复的数据。
2. 训练分析
3. 启动软件进行分析（请参阅 材料表），然后创建一个新项目: 选择"文件|新|项目.
4. 在" 项目名称" 框中键入名称，然后配置 项目 类型。
   注意:实验使用以下规格进行:可训练的组织分割;适应性细胞分割;表型。
5. 加载包含用于训练的图章的扫描件: 文件|打开|图像.在 单模视图中，浏览图像并选择带有固有荧光的扫描件。
6. 单击 自发荧光（AF） 按钮，然后使用 自发荧光选择器，绘制组织中未染色的部分。单击 "准备图像"， 以允许软件从上传用于训练的所有图像中减去固有荧光的强度。
7. 单击 "编辑标记和颜色 "按钮，然后在与其荧光团关联的框中输入 标记名称 。单击屏幕顶部的 "切片组织 "步骤以打开 "组织分割训练 "窗口。
8. 在 "组织类别" 窗口中，键入要将图像分割为 的组织类别的名称 （例如， 肿瘤， 基质， 背景， 坏死）。
9. 在" 组织分割训练 "窗口中，单击" 绘制 "按钮并绘制细胞组周围的区域，以定义感兴趣的组织类别。例如，要定义 肿瘤 区域，请绘制一组肿瘤细胞周围的区域。切换到下一个类别并重复绘图过程。
   注意:建议在上传用于训练的大多数图像中绘制区域。还可以通过编辑 模式刻度 和 分割分辨率 来优化训练，其详细信息在用户手册中得到了更好的描述。
10. 定义训练区域后，继续 训练组织分割器。
    注意:在训练过程中，软件显示组织分割的准确率百分比。为了获得最佳结果，建议组织分割的准确率至少为90%。一旦分段器稳定下来，单击" 完成 "按钮。
11. 要查看所有图像上的 "组织类别 "蒙版，请单击" 全部分割 "按钮。
12. 验证组织分割的质量后，在错误分类的区域周围重新绘制训练区域，并重新训练 组织分割器 ，直到该过程成功。
13. 单击窗口顶部步骤栏中的"单元格分割"步骤以继续分析。
14. 选择要分割的细胞区室: 细胞核、 细胞质和/或 膜。
    注意:由于自适应细胞分割只能检测具有核信号的细胞，因此不要取消选择 Nuclei。虽然也可以分割细胞质和/或膜，但建议首先选择最强，最丰富的核组分（例如DAPI）。
15. 使用" 典型强度" 滑块配置核组件，以调整用于检测核像素的阈值。请注意预览窗口，该窗口在调整阈值时打开并提供实时反馈。
    注:此阈值是自适应的，是相对于周围背景测量的。如果检测到过多的背景为核，请增加此值。如果错过了微弱的细胞核，请降低此值。使用 "显示/隐藏区域 "按钮打开和关闭分割掩码，并检查是否将正确的像素检测为核像素。
16. 要拆分核像素簇，请使用" 核组件拆分" 面板。选择最能描述细胞核染色质量的按钮。然后，使用滑块调整 分割灵敏度，请记住，较低的值将导致更多的分割。
17. 单击" 全部细分 "按钮以细分所有图像。如果结果不准确，请修改设置并重新训练软件，直到实现满意的分割。
18. 进入分析的最后一步: 表型。在" 表型 "面板中，添加要检测的表型列表，然后在相应的文本框中键入 名称 。单击 "编辑表型 "按钮，选择特定单元格以显示下拉菜单，然后选择相应的表型。
    注意:每种表型至少需要五个细胞来训练分类器。关闭细胞核的可视化可以更好地可视化需要分配的细胞表型。
19. 完成训练选择后，单击" 训练分类器 "按钮。
    注意:该软件将对图像中的每个细胞进行分类，每当发生分类错误时，都可以编辑细胞的表型并重复分类器的训练。在继续进行批量分析之前保存项目，然后单击屏幕顶部工具栏中的" 导出 "。
20. 选择左侧菜单上的" 浴分析 "选项卡，然后在" 批处理算法" 或"项目"框中加载 项目 。
21. 单击 "导出选项" 为每个图像创建单独的目录，然后使用" 浏览 "按钮导航以查找要导出数据的位置。单击要导出 的图像 和 表格 的所有选项。
22. 在屏幕右侧，单击" 添加幻灯片 "并加载所有包含先前准备的批次的图章的图像（步骤7.3）。单击" 运行 "按钮开始批处理分析，并一次处理一个戳记，导出相应的数据。

结果

mIF染色的组织学切片的多光谱成像允许识别和表型单个细胞群，并鉴定外植体TME中的肿瘤和基质成分（图2）。多光谱成像对于分析具有高固有自发荧光的组织（例如具有高胶原蛋白含量的组织）特别有用，因为它允许自发荧光信号从其他信号中解卷积并从后续分析中排除。随后的硅组织和细胞分割允许量化具有多种输出的药物反应，包括但不限于原始细胞数量（例如，阳性...

讨论

本文介绍了偏微分方程的生成、药物治疗和分析方法，并重点介绍了该平台作为临床前模型系统的优势。新切除的肿瘤的离体培养，不涉及其解构，允许保留肿瘤结构^13，24，从而保留TME中细胞成分的空间相互作用以及肿瘤内异质性。该方法展示了通过使用肿瘤特异性标记物，可以识别肿瘤组织区域与基质区域，从而在这些隔室内分离药物反应（

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma	320099	Staining reagent
Antibody Diluent / Block, 1x	Perkin Elmer	ARD1001EA	Antibody diluent/blocking buffer
Barnstead NANOpure Diamond	Barnstead		Ultra Pure (UP) H2O machine
Citric Acid Monohydrate	Sigma-Aldrich	C7129	Reagent for citrate buffer
Costar Multiple Well Cell Culture Plates	Corning Incorporated	3516	6 multiwell plate
DAPI Dilactate	Life Technologies	D3571
100 x 17 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	150350	100 mm diameter dish for tissue culture
DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate	Gibco (Life Technologies)	10569-010	Tissue culture medium (500 mL)
DPX mountant	VWR	360294H	Mounting medium
DPX mountant	Merck	6522	Mounting medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	Reagent for TE buffer
Eosin	CellPath	RBC-0100-00A	Staining reagent
Foetal Bovine Serum	Gibco	10500-064	For use in tissue culture medium
37% Formaldehyde	Fisher (Acros)	119690010	10% Formalin
iGenix, microwave oven IG2095	iGenix	IG2095	Microwave used for antigen retreival
Industrial methylated spirit (IMS)	Genta Medical	199050	99% Industrial Denatured Alcohol (IDA)
InForm Advanced Image Analysis Software	Akoya Biosciences	InForm
Leica ASP3000 Tissue Processor	Leica Biosystems		Automated Vacuum Tissue Processor
Leica Arcadia H and C	Leica Biosystems		Embedding wax bath
Leica RM2125RT	Leica Biosystems		Rotary microtome
Leica ST4040 Linear Stainer	Leica Biosystems		H&E stainer
Mayer's Haematoxylin	Sigma	GHS132-1L	Staining reagent
Millicell Cell Culture Inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Merck Milipore	PICMORG50	Organotypic culture insert disc
Novolink Polymer Detection System	Leica Biosystems	RE7150-K	DAB staining kit
OPAL 480	Akoya Biosciences	FP1500001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 520	Akoya Biosciences	FP1487001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 570	Akoya Biosciences	FP1488001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 620	Akoya Biosciences	FP1495001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 650	Akoya Biosciences	FP1496001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 690	Akoya Biosciences	FP1497001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent
OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagent	Akoya Biosciences	FP1501001KT	Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) diluent and TSA-DIG reagent
Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x	Perkin Elmer	ARH1001EA	HRP polymer
Penicillin/streptomycin solution	Fisher Scientific	11548876	For use in tissue culture medium
PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer	Akoya Biosciences	PhenoChart	Viewer software for scanned images
Phosphate Buffered Saline Tablets	Thermo Scientific Oxoid	BR0014G	PBS
1x Plus Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent
Prolong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen	P36961	Mounting medium
Slide Carrier	Perkin Elmer		To load slides into Slide Carrier Hotel for scanning with Vectra Polaris
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S/3160/63	10% Formalin
Sodium Hydroxide pellets	Fisher Scientific	S/4920/53	Reagent for citrate buffer
Tenatex Toughened Wax - Pink (500 g)	KEMDENT	1-601	Dental wax surface
Thermo Scientific Shandon Sequenza Slide Rack for Immunostaining Center	Fisher Scientific	10098889	Holder for slides and slide clips
Thermo Scientific Shandon Plastic Coverplates	Fisher Scientific	11927774	Slide clips
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma-Aldrich	252859	Reagent for TE buffer
VectaShield	Vecta Laboratories	H-1000-10	Mounting medium
Vectra Polaris Slide Scanner	Perkin Elmer	Vectra Polaris	Slide scanner
Xylene	Genta Medical	XYL050	De-waxing agent